Трансплантация эмбрионов домашних и сельскохозяйственных животных: основные технологические процессы, современное состояние и перспективы развития

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное Бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«российский государственный аграрный университет -МСха имени К.А. Тимирязева» (ФГБОУ ВО ргау - МСХА имени К.А. Тимирязева)

Факультет Зоотехнии и биологии

Кафедра морфологии и ветеринарии

Реферат

на тему: «ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ У ДОМАШНИХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ: ОСНОВНЫЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ»

Подготовила: Зубова Алина

Проверил: Дюльгер Георгий Петрович

Москва-2016

Содержание

Введение

1. Отбор доноров

2. Стимуляция суперовуляции

3. Осеменение коров-доноров

4. Извлечение эмбрионов

5. Хранение эмбрионов

6. Пересадка эмбрионов

7. Хранение эмбрионов

8. Оплодотворение вне организма

9. Регуляция пола

10. Мелкие жвачные

11. Межвидовая пересадка эмбрионов. Получение химерных животных

12. Клонирование животных

Заключение

Список литературы

Введение

История развития этой биотехнологии началась почти 120 лет назад. В 1890 году ученым Вальтером Хипом впервые была выполнена и описана методика трансплантация эмбрионов. Он трансплантировал два эмбриона ангорских кроликов беременным крольчихам бельгийской породы и получил смешанный помет крольчат обоих пород. Опыты по пересадке эмбрионов на крупных сельскохозяйственных животных начались в 1930-х годах на овцах и козах. Первые успешные пересадки эмбрионов на крупном рогатом скоте и свиньях были осуществлены в 1950-х годах Джимом Роусоном в Кембридже, Англия.

Разработка метода искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и его практическое применение обеспечили большой успех в области улучшения генетики животных. Использование этого метода в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоянии открыло возможность получения десятков тысяч потомков от одного производителя в год. Этот прием, по существу, решает проблему рационального использования производителей в практике животноводства.

Что касается самок, то традиционные методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями (6--7 лет у крупного рогатого скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов. Суть метода состоит в том, что генетически выдающиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам. До середины 1970-х гг. трансплантацию эмбрионов проводили главным образом сложным хирургическим методом. Это приводило к образованию нежелательного рубца на матке самки. В настоящее время разработана и получила широкое распространение методика нехирургической трансплантации, или методика вагинально-цервикальной трансплантации эмбрионов. Однако ее применимость ограничивается крупными животными, главным образом крупным рогатым скотом и лошадьми. В отношении мелкого рогатого скота, свиней и оленей применяется хирургический метод. Особенно проблематично применение нехирургического метода трансплантации эмбрионов у свиней из-за морфологических особенностей этих животных.

Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка.

1. Отбор доноров

Донор - это высокоценное, выдающееся животное, от которого после гормонального вызывания полиовуляции и осеменения спермой проверенного производителя - улучшателя получают несколько зародышей. Отбирают только тех животных, которые обладают способностью к множественной овуляции и дают в течение длительного срока их использования большое количество зародышей, пригодных к пересадке. В качестве доноров лучше использовать здоровых коров в возрасте от 4 до 5 лет с хорошо развитой молочной железой, пригодной к машинному доению, и у которых не было каких-либо осложнений родов и послеродового периода. Первая стадия возбуждения полового цикла после родов должна быть синхронной и полноценной, с ярко выраженными феноменами: течки, полового возбуждения и охоты.

Операция пересадки зародышей экономически выгодна только в том случае, когда в качестве доноров берут выдающихся в племенном отношении животных. В некоторых случаях для получения зародышей рекомендуют использовать ценных в племенном отношении коров в заключительные сроки их продуктивной жизни, чтобы получить от них больше потомков (А.П. Студенцов, 1999).

В большинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальных племенных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционный дифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков, проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается по главным признакам молочного скота - по уровню молочной продукции и жирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племенной ценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекции расширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи, резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.

Нужно иметь в виду, что оценка коровы-донора по родословной и собственной продуктивности является не окончательной, так как в этом случае не учитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтому окончательно оценивать корову-донора можно только при получении и оценке ее потомства.

Высокие затраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливают необходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получать большое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими и устойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностью к воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые два месяца.

Межотельный период является интегральным показателем воспроизводительной способности коров. Его составные части: сервис-период и период стельности.

Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.

Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается. Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис - и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.

Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.

Важным показателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется высокой степенью изменчивости - коэффициент вариабельности может достигать 70%. Существенное влияние на изменчивость индекса осеменения оказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).

Через 15-20 суток после отела ветеринарный специалист методом ректальной пальпации контролирует у потенциальной коровы-донора состояние половых органов, чтобы исключить такие нарушения воспроизводительной функции как киста яичника, гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты (Б.П. Завертяев, 1999).

2. Стимуляция суперовуляции

Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф2 (ПГФ2) или его аналогами приводит к множественной овуляции или так называемой суперовуляции.

Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови жеребой кобылы (СЖК), начиная с 9--14-го дня полового цикла. Через 2--3 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.

В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения.

3. Осеменение коров-доноров

Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещё остается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65% эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии или дегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной (Н.И. Полянцев, 2001).

Для их осеменения берут сперму выдающихся быков-производителей, проверенных по качеству потомства и признанных улучшателями продуктивности. Имеются доказательства, что при использовании некоторых быков достигается более высокая степень оплодотворяемости коров - доноров, поэтому следует оценивать быков и по данному показателю. Отбор быков и работу со спермой проводят с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и согласно действующей инструкции по искусственному осеменению коров и телок. После гормональной обработки доноров у них с помощью быков-пробников выявляют половую охоту не менее двух раз в день. Примерно у 10 - 12% животных признаки стадии возбуждения полового цикла не проявляются. Осеменение животных, у которых обнаружена охота, проводят несколько раз с 12-часовыми интервалами до ее окончания, иногда его повторяют 3-4 раза. В каждой дозе спермы должно быть не менее 40-50 млн живых подвижных спермиев. Чаще используют способ осеменения с ректальной фиксацией шейки матки, сперму вводят в ее канал.

Некоторые зарубежные авторы предлагают вводить сперму в полость тела матки. Имеются также рекомендации вводить одну порцию спермы в левый, а вторую - в правый рог матки. Свежие спермии сохраняют жизнеспособность в половых путях самок дольше, чем замороженные и оттаянные. Поэтому при использовании свежей спермы в течение охоты можно проводить 1-2 осеменения. При этом достигается более высокая степень оплодотворяемости. Нецелесообразно осеменять доноров в отдаленные сроки после окончания охоты, поскольку в дальнейшем это может оказывать вредное влияние на степень извлечения пригодных к пересадке зародышей (А.П. Студенцов 1999).

4. Извлечение эмбрионов

Оплодотворение яйцеклеток происходит в яйцепроводе. Образовавшиеся зиготы подвергаются дроблению, и большинство из них у крупного рогатого скота попадают в матку на 4-й день. Зародыши целесообразно извлекать у коров на 7-8-й день после первого осеменения (до освобождения зародыша из прозрачной оболочки). Для извлечения зародышей используют 2 способа: не хирургический и хирургический.

При не хирургическом способе извлечения зародыше животных фиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводят тщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится в каждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет и дезинфекцию наружных половых органов и промежностей. Для прекращения перистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина. Для вымывания зародышей из матки применяют различные инструменты. Используют гибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком. Инструмент должен быть стерильным. Сначала катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки в рог матки. Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистую оболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки после того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10-15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге матки и промывная жидкость не вытекает мимо катетера.

Закрепив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприца Люэра вместимостью 50-60 мл. В рог матки в зависимости от его величины вводят порциями от 40-60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рога не более 500 мл. Наполнение матки промывной средой и степень ее оттока контролируют ректально.

Для более полного извлечения зародышей верхушку рога матки приподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют яйцепровод вблизи верхушки рога матки осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этом предотвращается поступление в брюшную полость жидкости, содержащей зародыши. Но практика показывает, что поступление в брюшную полость жидкости из рога матки отмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепровод можно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух из баллончика. Таким же образом промывают и второй рог. В качестве среды для промывания используют фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС) Дюльбекко.

Раствор готовят на тридистиллированной воде. Первые 4 вещества растворяют 800 мл, а 5-е и 6-е каждый отдельно в 100 мл. в итоге получают три раствора которые автоклавируют, а затем смешивают. В таком виде их можно хранить при 4 градусах до 2 недели. Непосредственно перед употреблением в ФБС вводят следующие компоненты (в расчете на один литр): альбумин бычьей сыворотки - 4г; глюкоза - 1г; натрий-пироват - 0,036г; пенициллин - 100 тыс. ЕД.

Собранную в цилиндр промывную жидкость отстаивают 20-35 мин. при температуре 20-37 градусов, чтобы зародыши опустились на дно, после чего верхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20-30 мл для обнаружения зародышей исследуют в больших часовых стеклах или чашках Петри под бинокулярной лупой при 10-50-кратном увеличении. Найденных зародышей при помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют для хранения.

Хирургическим способом зародышей извлекают при общем или местном обезболивании. Разрезают брюшную стенку по белой линии или чаще в области голодной ямки справа или слева, подтягивают рог матки к поверхности раны, делают разрез вблизи его основания и вставляют специальный катетер. Затем через иглу, введенную в полость рога у его верхушки, или через канюлю, вставленную в яйцепровод, вводят специальную среду, которую вместе с зародышами собирают через катетер. При этом методе получают до 70% жизнеспособных зародышей. У коровы можно извлекать зародышей непосредственно из яйцепровода (в течение первых 4 дней после осеменения). Но хирургический способ, по мнению многих специалистов, имеет лишь научное значение.

Он трудоемок, требует, больших расходов, и поэтому его применяют только у мелких животных (овец, коз и др.) после операции у животного значительно снижается уровень молочной продуктивности, имеется риск потери высокоценного донора при общем обезболивании. Его нельзя часто повторять, так как в послеоперационный период образуются спайки, из-за чего возникают трудности в извлечении зародышей, а затем могут развиваться необратимые изменения, приводящие к бесплодию доноров (А.П. Студенцов, 1999).

Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионов крупного рогатого скота производится несколькими методами. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации эмбрионов зависят от того, насколько полно оценена способность оплодотворенных яйцеклеток к развитию.

По морфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можно классифицировать на пригодные и непригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на формулу зиготы, состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.

Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом.

Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомера.

Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.

Важнейшим критерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и других манипуляций.

При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства. Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.

Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.

В стадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоны пеллюцида

5. Хранение эмбрионов

После оценки на жизнеспособность эмбрионы дважды промывают в фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением антибиотиков, засасывающих в минипайету вместе с небольшим количеством среды. Для пересадки используют в первые 2-4 ч после извлечения из половых путей донора.

Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов более продолжительное время возникает в случаях: отсутствия достаточного количества подходящих реципиентов; сомнительного качества вымытых эмбрионов; создание банка эмбрионов для осуществления долгосрочных селекционных программ; обмена генофондом между странами и континентами на коммерческой основе. Существует несколько способов хранения эмбрионов: кратковременное вне организма, кратковременное в организме, долговременное в сжиженных газах. При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов вне организма был использован опыт культивирования тканей и клеток. Наиболее подходящей средой оказалась ТСМ 199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крови оленей. Эмбрионы хранят в атмосфере обогащенной углекислым газом, при постоянной температуре 37 градусов. В таких условиях они остаются жизнеспособными 24-48 ч. Имеются сообщения о том, что снижение температуры до 10 градусов позволяет продлить их жизнеспособность до 5-6 суток.

На протяжении 3-4 суток эмбрионы можно хранить в яйцепроводах крольчих, выживаемость составляет в средне 73%. В настоящее время этот способ не применяется.

На сегодня известно 2 способа глубокого замораживания эмбрионов: в программируемом режиме (ступенчатое замораживание); одномоментный (витрификация).

При замораживании по первому способу отобранные эмбрионы (отличного и хорошего качества) последовательно проводят через растворы криопротектера (глицерин или диметилсульфоксид) возрастающих концентраций, приготовленные на фосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки. После этого эмбрионы переносят в пробирки или ампулы (по 1-4 в каждую) вместе с 0,3 - 0,4 мл среды с криопротектором. Емкости с эмбрионами герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают) и помещают в камеры замораживателя, где охлаждают до -7 градусов в режиме 1 градус в минуту. После достижения указанной температуры вызывают кристаллизацию среды. Для этого в жидком азоте пинцетом касаются стенки пробирки(ампулы) в зоне верхнего края столбика среды. Дальнейшее охлаждение (до -28 градусов или -35) ведут со скоростью 0,5 градуса в минуту, затем скорость уменьшают до 0,1 градус в минуту; через 10 минут доводят до конечной температуры погружением в жидкий азот.

Одномоментное замораживание (витрификация) - отвердение при чрезвычайно высокой вязкости среды, что ведет к образованию стекловидных структур. Это возможно при высокой концентрации криопротектора и быстром охлаждении.

Замораживают быстрым методом в минипайетах емкостью 0,25 мл в пайету, последовательно засасывают 0,5 М раствор сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствор сахарозы. Концы закрывают с обеих сторон пластиковыми пробками. После эквилибрации пайету, содержащую эмбрион, выдерживают 5 мин в парах жидкого азота, затем опускают в сосуд с жидким азотом (Н.И. Полянцев, 2001).

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.

Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами. При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50-55%. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов составит 55-60%.

По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. После герметизации емкости с эмбрионами ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.

Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.

Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего переживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.

Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет (И.Р. Чернева, 2007).

6. Пересадка эмбрионов

В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями. Основным условием хорошего приживления эмбрионов служит синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов.

Разница во времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные же результаты получаются при разнице не более 12 часов. При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионы сразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки. В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития - имплантационный.

При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса, место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно. Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят - 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10-15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом. При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе - введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.

После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты. Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации.

Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверность установления истинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев.

Существенной причиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, является возможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщение результатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.

Однако на этот счет имеется и другая точка зрения: что конструкция приборов существенно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора, качеством и стадией развития эмбрионов. В целом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой - до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадок в час. Особого внимания заслуживает приём, заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией). Результаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выход новорожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественном многоплодии коров. Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но в контрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадке составляет 50%. Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можно придти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиента или подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральный рог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологии трансплантации эмбрионов

7. Хранение эмбрионов

Применение метода трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.

Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их последующей приживляемости. Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью.

Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного. Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития после охлаждения их ниже 10--15°С (С. Полдж, 1982).

Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0°С.

Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже-- 50°С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).

Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального оборудования с заданной скоростью повышения температуры.

8. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных.

Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой работы.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию сперматозоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яичниках млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник огромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенерируют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотворение вне организма животного. В настоящее время не разработаны методы использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значительное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 1--2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5--2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2--6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1--2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5--6 ооцитов на животное. Менее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.

Положительное значение - несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возможность многократного использования животного.

Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проникновения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спаривания Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использована среда с высокой ионной силой.

Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в течение 30--40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в течение одного часа верхний слой среды объемом 0,5--0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и промывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 7--10 мин. После 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществляется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению условий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструментом для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет. Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очищают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2--5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 1--1,5 млн/мл. Через 44--48 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

осеменение скот донор эмбрион

9. Регулирование пола

В практике разведения животных очень важно научиться управлять образованием в потомстве мужских и женских особей. Метод разделения эмбрионов по полу основан на определении белков, специфичных для самцов. Этом метод широко применяется в животноводческой практике многих стран. В Канаде уже с 1975 года рождаются телята, разделенные по полу на стадии эмбрионов. В перспективе для целенаправленного получения особей мужского или женского пола может быть применен метод микрохирургической замены Х и У хромосом. Такие манипуляции уже проводились на растительных клетках и яйцеклетках земноводных.

10. Мелкие жвачные

Применение искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов на некрупных животных технически выглядят более сложными процедурами. У овец, коз и оленей извлечение эмбрионов и их пересадка проводятся только хирургическим путем. Поэтому в случае с мелкими жвачными технология трансплантации эмбрионов неизбежно ухудшает благополучие животных.

Овцы по своей природе относятся к группе животных с половым сезоном. Но оказавшись в категории «выдающихся» представителей своей породы, овцематки за счет искусственной гормональной накачки овулируют каждые 2-3 месяца. Гормоны овцам вводят посредством инъекций или вагинально -- путем введения во влагалище губки, пропитанной гормонами. Имплантацию эмбриона осуществляют при помощи лапароскопии. Эндоскоп вводят через разрез стенки живота под общим наркозом.

Даже ветеринарные работники обеспокоены отсутствием регламентирующих документов в отношении трансплантации эмбрионов мелким жвачным.

Зачастую эту сложную во всех отношениях процедуру выполняют пастухи (J. D'Silva, Т. O'Brien, 1995).

Применение технологии трансплантации эмбрионов на козах и оленях требует особого подхода к животным. Козы отличаются высокоразвитой психикой и чутко реагируют на все посягательства на свое благополучие. Олени -- животные очень пугливые. Поэтому частая поимка этих полудиких животных, фиксация в станке и многократные инъекции вызывают у них тяжелые нарушения психики затяжного характера на основе нервного перенапряжения и сдвигов эндокринной регуляции физиологических процессов.

11. Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных

Принято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.

Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов от 2--8 родителей.

Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5--6,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химеризма.

Примеры

Получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой».

Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эмбрионов разных видов, например, овцы и козы.

Исследования СВ. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4--5 сут в лигатиро-ванный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоци-сты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.

12. Клонирование животных

Число потомков от одной особи, как правило, у высших животных бывает небольшим, а специфический комплекс генов, определяющий высокую продуктивность, возникает редко и в последующих поколениях претерпевает значительные изменения.

Получение однояйцовых близнецов имеет большое значение для животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от одного донора, а с другой -- появляются генетически идентичные двойни.

Возможность микрохирургического разделения эмбрионов млекопитающих на ранних стадиях развития на две и более части, чтобы каждая в последующем развивалась в отдельный организм, была высказана несколько десятилетий назад. Первое потомство однояйцовых мышей было получено из механически изолированных бластомеров двухклеточных эмбрионов в 1970 г. На основе этих исследований можно предположить, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим способность этих эмбрионов развиваться в жизнеспособные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит разделение, имеет малое значение. В настоящее время применяют простую технику разделения эмбрионов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылупившейся бластоцисты) на две равные части.

Простая техника разделения разработана и для 6-дневных эмбрионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внутреннюю клеточную массу эмбриона.

Заключение

Разведение крупного рогатого скота молочных пород с помощью трансплантации эмбрионов позволяет: обеспечить размножение высокоценных племенных быков-производителей; формировать поголовье заводских семейств; усилить давление по отбору быков-производителей, дочерей - трансплантантов, повысить генетический тренд по селекционным признакам.

Сравнение молочной продуктивности дочерей быков - трансплантантов и их сверстников, полученных путем искусственного осеменения показало, что удой первых оказался более высоким по сравнению с дочерьми быков от искусственного осеменения.

Применение метода трансплантации эмбрионов в заводских семействах от высокоценных коров доноров сокращает сроки их формирования в 1,5 раза по сравнению с искусственным осеменением за счет получения большего числа потомков.

Применение элементов системы МОЭТ дает возможность увеличения численности полученных путем трансплантации высокоценных ремонтных быков за одинаковые воспроизводительные циклы быко - воспроизводящих коров и увеличить число быков, получающих племенные категории после проверки по качеству потомства в 4 раза. В закрытом нуклеусном стаде сокращается срок воспроизведения животных через лучшую его часть поголовья почти в 3 раза.

Расчет затрат на получение одного высокоценного ремонтного быка методом трансплантации из отечественных эмбрионов показал, что они в 2,2 раза больше по сравнению с расходами на искусственное осеменение, но меньше в 5,4 раза, чем на покупку быка из-за рубежа и в 3,5 раза, чем на приобретение эмбрионов за пределами страны

Список литературы

1. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. - Л.: «Агропромиздат», 1999.

2. Полянцев Н.И., Подберезный В.В. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных. Ростов н/Д.: Феникс, 2001. - 480 с.

3. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. - Л.: «Наука», 1998.

4. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения. - 7-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1999. - 495 с.

5. Чернева И.Р. Лекции по биотехнологии и пересадке эмбрионов. Московская ветеринарная академия им. Скрябина, 2007.

Размещено на Allbest.ru