Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

Куриннов В.В.,

Васильев А.П.,

Белянин С.А.,

Стрижакова О.М.

г. Покров

Резюме

В статье представлены статистические параметры диагностической работы ПЦР и РПИФ, основанные на использовании сложного проекта стратифицированной выборки тест-популяции первично инфицированных домашних свиней и диких кабанов от полевых случаев или вспышек африканской чумы свиней (далее, АЧС). В результате непарных ПЦР-тестирований 1 220 домашних свиней (405 страт) положительными были 1 140 голов (93,4%), а из 519 голов диких кабанов (222 страт) - 471 (90,8%); из проверенных РПИФ 987 голов домашних свиней (364 страт) положительными были 969 голов (98,2%), а из 416 диких кабанов (178 страт) - 358 голов (86,1%). Обследование тех же самых страт при параллельных проверках парных выборок оценки МсNemar's теста не представили значимых различий между ПЦР - 98,3% и РПИФ - 98,2 % (р=1,0). Это свидетельствует о случайности ложно-отрицательных результатов ПЦР при непарном тестировании, то есть неуверенности, вызванной эффектом эмпирического фактора в проекте выборки. При исследовании парных проб от павших от АЧС кабанов были хотя и незначительные, но различия чувствительности ПЦР и РПИФ - 2,64(0,18-4,4)%, (Р=0,01), которые статистически ещё более выражены при тестировании случайной выборки отстрелянных кабанов - 6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01. ППР величины при параллельном выполнении системы "ПЦР-РПИФ" были достоверно высокими для подтверждения инфекции АЧС, от 95,7 (86,0-98,4)% при превалентности 10 (3-24%) в крупных стадах до 99,2 (98,5-99,5) % и 99,6 (99,3-99,7)% - в средних и мелких (превалентность 37,0% и 53%, соответственно). кабан чума африканский

Практически, параллельная система "ПЦР-РПИФ" имеет хорошую достоверность и воспроизводимость для подтверждения клинических случаев АЧС в любых стадах (фермах) домашних свиней и кабанов, не требующая подтверждения положительных результатов референс-методом.

Ключевые слова: африканская чума свиней, вспышка, лабораторная диагностика, выборка, тесты, полимеразная цепная реакция, реакция прямой иммунофлуоресценции, параллельное тестирование, прогностические положительные результаты, прогностические отрицательные результаты.

Введение

Основной особенностью семилетнего развития эпизоотического процесса АЧС в сильно структурированном свиноводстве Российской Федерации является наблюдаемая периодичность его активных фаз (эпизоотий) с короткими межэпизоотическими периодами с низкой или очень низкой месячной инцидентностью вспышек (спорадические случаи) как в стадах домашних свиней, так и популяциях диких кабанов. Инфекция АЧС всегда сопровождалась геморрагическим воспалением, коротким инфекционным периодом (5-7 дней) с последующим фатальным 100% исходом [1], что свидетельствует о высокой вирулентности вируса [1, 8, 9].

Сразу же, после интродукции вируса АЧС на территорию РФ, для подтверждения инфекции использовали лабораторные методы по ГОСТ 2857-90 "Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней" [3, 10]. Рекомендованные методы предназначались для диагностических исследований АЧС при острой (изоляция вируса с использованием культуры макрофагов in vitro и феномена гемадсорбции, реакция прямой иммунофлуоресценции, сэндвич ИФА), хронической и латентной формах течения (реакция непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный анализ). Ранее, хорошая диагностическая эффективность этих реакций была признана экспертами МЭБ при ликвидации АЧС в Европе и Латинской Америке в 20 веке [13, 15]. Исторически, в РФ для указанных методов реагенты и наборы препаратов были разработаны ещё в 70-80 годы прошлого столетия [2, 7], но имели статус валидированных только на основании использования выборки от экспериментальной инфекции АЧС. Первая публикация относительно ПЦР, как диагностического метода, была в 1992 году [14], а в РФ - в 1995 году [11]. Позднее, после усовершенствований, в практику диагностики АЧС была введена ПЦР в реальном времени [12], но вопросы валидации ПЦР (варианты электрофорезного и в реальном времени) практически были освещены очень ограниченно [4, 5, 6].

В связи с перманентным развитием эпизоотической ситуации, основной интерес властей к лабораторным исследованиям был основан, прежде всего, на необходимости быстрого подтверждения подозрения на АЧС. Благодаря активному влиянию госветслужбы, были организованы централизованные государственные закупки диагностических средств и оборудования, тренинг практических ветеринарных специалистов в научно-исследовательских учреждениях страны, поэтому ПЦР, РПИФ и ИФА были очень быстро внедрены в обычную практику ветеринарных лабораторий [9, 10]. С точки зрения объектов обнаружения, рассматриваемые реакции можно считать условно зависимыми (обе реакции обнаруживают вирус) и независимыми, так как на молекулярном уровне ПЦР обнаруживает фрагменты вирусспецифической ДНК, а РПИФ (или ИФА) - вирусспецифические полипептиды. Однако, хорошие научные знания принципа работы реакций и их блестящее техническое выполнение, могут объяснить только механизмы обнаружения компонентов вируса и представлять только свидетельства их обнаружения (то есть продукты амплификации или люминесцентная визуализация вирусных белков). Однако, для достижения основной цели лабораторных исследований - непредубеждённо оценивать полученные результаты реакций и затем делать заключение "болезнь есть" или "болезни нет", требуются очень хорошо выверенные знания диагностических характеристик используемых методов. Поэтому, из-за отсутствия таких данных ветеринарным руководством было принято решение об обязательной перепроверке положительных результатов ПЦР и РПИФ (но не отрицательных), полученных практическими ветеринарными лабораториями на АЧС, в научных учреждениях (ВНИИВВиМ или ВНИИЗЖ).

Таким образом, имея в своём распоряжении данные масштабных лабораторных скринингов большого количества инфицированных АЧС и интактных домашних свиней и кабанов, выполненные ВНИ-ИВВиМ и практическими ветеринарными лабораториями в течение 2008-2013 годов, а также все выборки при вспышках, основной целью исследований было валидация ПЦР и РПИФ и оптимизация схемы выполнения для усиления законности лабораторных исследований на

АЧС.

Материалы и методы. Для выполнения РПИФ и ПЦР использовали коммерческие серии наборов и реагентов собственного производства:

· "Специфические ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС для им-мунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней" - коммерческие серии ВНИИВВиМ; выполнение РПИФ в соответствии "Инструкции по применению";

· "Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени" - коммерческие серии ВНИИВВиМ.

В практических ветеринарных лабораториях была использована также коммерческая тест-система "АЧС" для выявления генетического материала вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

Учёт результатов реакций был дихотомический (то есть "положительный" или "отрицательный"), несмотря на субъективные оценки по 4-х бальной шкале для РПИФ или инструментальные по Ct- оценкам для ПЦР.

Для индивидуальной оценки диагностических характеристик ПЦР и РПИФ использовали сложную выборку, которая включала полевые экспертизы, сгруппированные в страты, включавших пробы от всех павших домашних свиней или диких кабанов, классифицированные как "референс-положительные АЧС" (на основании опроса и идентифицированные как ПЦР-положительные и/или РПИФ-положительные практическими ветеринарными лабораториями). Так как типы проб были разными (для ПЦР использовали пробы крови/сыворотки, костного мозга, а для РПИФ - в основном, только селезёнки), количества выборок для оценки каждой реакции также были разными.

Выборки "неинфицированных" домашних свиней и диких кабанов были из исторически свободных по АЧС территорий РФ.

Такой тип выборки для парных лабораторных исследований был использован для оценки различий диагностической чувствительности и согласованности реакций. Для этого выборки (п. 1.2.1.) были "нормализованы" по размеру и типу пробы, то есть для оценок реакций от каждого животного выборки отбирали парную пробу селезёнки.

Кроме выборки павших животных, в исследованиях сравнений реакций также использовали парные пробы селезёнок случайной выборки отстрелянных диких кабанов в неблагополучных по АЧС субъектах РФ.

Так как данный проект выборки предназначен для сравнения, размер и структура выборки были для каждой реакции одинаковыми.

При непарных лабораторных исследованиях было последовательное выполнение каждой реакции индивидуально, когда не все пробы могли быть проверены каждой реакцией. Данный проект был предназначен для определения индивидуальных диагностических характеристик ПЦР и РПИФ.

При парных лабораторных исследованиях - параллельное выполнение реакций, то есть тестирование одних и тех же проб ПЦР и РПИФ было предназначено для оценок различий чувствительности и согласованности реакций.

Использовали статистические методы определения величины диагностической чувствительности, диагностической специфичности с использованием таблицы 2*2 [11], различий (МсМетаг'в-статистика) и согласованности (каппа) реакций с использованием пакета программ WinEpiscope 2.0 и Medcalc 10. Для определения прогностических положительных и отрицательных результатов реакций (прогностических характеристик) и эффективности параллельного выполнения использовали данные превалентности АЧС в разных фермах домашних свиней [1] и программу "MultipleDiagnosticTest" пакета WinEpiscope 2.0.

Проект и процесс выборки, осуществляемые на основе использования полевых проб для валидации методов, очень трудны, поэтому требуют описания деталей и пояснения, чтобы дальнейшие интерпретации данных и выводы авторов были понятными. От корректности выборки зависит точность диагностических показателей и рекомендаций относительно стратегии применения лабораторных методов. В наших исследованиях выборки были выполнены практическими ветеринарными врачами при вспышках АЧС в период с 2008 по 2013 годы включительно в 30 субъектах Российской Федерации. Процедуры выборки чаще были от первично инфицированных АЧС павших свиней (целенаправленная выборка), но всегда имели элемент случайности, а также неконтролируемые вмешивающиеся факторы. Поэтому границы терминологии выборки междуэмпирической и случайной установить трудно и потребовалось немало усилий для селекции и приведения проб их в приемлемый статистический порядок. В таблице 1 приведены наиболее общие данные количеств обследованных животных (домашних свиней и диких кабанов) с характеристикой как "инфицированные АЧС", то есть в основной массе они имели клинические признаки болезни, подтверждённые лабораторными исследованиями.

Таблица 1 Размеры положительных АЧС выборок (количества страт и животных по видам), использованные в расчётах для определения диагностической чувствительности ПЦР и РПИФ

Примечание: * - имели клинический статус больных и как поло-жительные-ПЦР и положительные-РПИФ, тестированные в практических ветеринарных лабораториях.

Выборки были классифицированы как истинные (референс) инфицированные, и каждую отдельно использовали для исследований.

В связи со сложным проектом выборки, были применены два варианта оценки переменных методов. Первый основывался на определении индивидуальных значений диагностической чувствительности и специфичности ПЦР и РПИФ, так как в знаменателе для каждой реакции выборка количеств истинно инфицированных АЧС животных была разной, а исследование - непарным. При таком варианте исследования выборки в различных специфических стратах (домашних свиней и диких кабанов) в расчётах таблицы 2 показаны различия диагностической чувствительности индивидуальных показателей ПЦР и РПИФ. РПИФ имела очень хорошую относительную вероятность получения положительных результатов - 98,2% (97,4-99,0%), по сравнению с ПЦР 93,4% (92,1-94,8%). Однако, при тестировании диких кабанов вероятность положительных результатов РПИФ была ниже - 86,1% (82,7-89,4%), по сравнению с ПЦР - 90,8% (88,3-93,2%).

Таблица 2. Индивидуальные оценки диагностической чувствительности и специфичности РПИФ и ПЦР для подтверждения АЧС (WinEpiscope 2.0, Р=0,05)

Примечание: * - результаты были получены при исследованиях проб с использованием коммерческой тест-системы "АЧС" для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

Узкие диапазоны отклонений доверительных интервалов, высокий индекс Youden's (0,9) при всех ситуациях оценки подтверждали точность расчётов (хорошие размеры выборки). Однако, "испорченные" показатели диагностической чувствительности обеих реакций, и ПЦР и РПИФ при использовании выборок от кабанов, вероятно, связаны с ошибками выборки, так как в страте выборки априори могли оказаться павшие, но неинфицированные вирусом АЧС кабаны. Относительно природы ложноотрицательных результатов можно, хотя и с осторожностью, утверждать о большей роли и биологических факторов (клинический статус) и связанных с ними репрезентативности выборки (специфическая проба - селезёнка от павших). В наших исследованиях размеры выборки превосходные как от домашних свиней, так и диких кабанов, которые значительно превышали расчётные при Р=0,05 в несколько раз. Однако, уверенно можно предположить, что в некоторых стратах могли быть заражённые индивидуумы, но недавно инфицированные, то есть в инкубационном периоде (мало циклов репродукции вируса и его концентрация невелика для аналитической чувствительности ПЦР и РПИФ). Таким образом, для снижения количеств "ложно-отрицательных" результатов методов репрезентативность выборки существеннее, чем её размер.

ПЦР - "ложноположительные" результаты были получены только субъектовыми ветеринарными лабораториями, и только в тех случаях, когда использовали коммерческую тест-систему производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Основная версия ПЦР-"ложноположительных" - техническая (аутоамплификация), так как отсутствие вируса было подтверждено перепроверкой проб референс-методом биопробы. Не умаляя неоспоримых преимуществ и аналитических характеристик, ПЦР, также, имеет слабые места, а главное - это случайные и спонтанные контаминации, которые могут выявиться на любой стадии выборки или транспортировки или подготовки проб для анализа и которые могут навредить её авторитету.

К рискам получения ошибок РПИФ имели отношение наведённая неспецифическая флуоресценция нейтрофилов, а также влияние технических факторов (ошибки специалистов при интерпретации люминесцентной микроскопии).

Хотя факты получения случайных "ложноотрицательных" и "ложноположительных" результатов свидетельствуют о необходимости тщательного отношения квалидации выборки, диагностическим средствам итренингу персонала, перепроверкой положительных выборок (указание ветеринарных властей) при использовании однотипных диагностикумов (тест-системы), способов выполнения реакций было получено почти полное совпадение положительных и отрицательных результатов между практическими ветеринарными лабораториями и ВНИИВВиМ как на уровне страт, так и на уровне животных.

Так как на индивидуальные оценки ПЦР и РПИФ основное влияние оказало значение ошибок, связанных с выборкой, а именно "вмешательство" эмпирического фактора, ассиметричность размера и репрезентативности иструктуры выборки, для оценок различий и согласованности реакций был использован второй вариант статистических исследований, основанный на оценке данных чувствительности ПЦР и РПИФ с использованием "нормализованных" (парных) выборок от тех же самых инфицированных домашних свиней и кабанов. В качестве статистического был использован МсNemar's-тест из пакета программ MedCalc. Дополнительно в расчёты были включены результаты параллельных тестирований ПЦР и РПИФ случайных выборок отстрелянных кабанов (табл. 3).

Таблица 3. Результаты сравнения различий чувствительности РПИФ и ПЦР при проверке парных выборок от домашних свиней и диких кабанов, инфицированных АЧС

а)

в)

Примечание:*данные таблиц 2Ч2 (а, б, в) использовали для введения в программу MedCalc для определения различий методов МсNemar's-тестом.

При тестировании парных проб от павших от АЧС домашних свиней, отсутствие статистических различий между чувствительностью ПЦР и РПИФ [0,1 (-0,5-0,7)%] при Р=1,0 свидетельствует о реакциях, как равноценных (при этом, расчётный показатель чувствительности ПЦР, 98,3%, можно считать как более соответствующий показателю диагностической чувствительности реакции, так как при использовании парных проб нейтрализовался "конфаундинговый" эффект влияния эмпирического фактора непарного проекта выборки (см. выше). Отсутствие существенной прибавки в чувствительности при параллельном проекте выполнения "ПЦР+РПИФ" (98,7%) по сравнению с последовательным (то есть раздельным) тестированием единственной ПЦР (98,3%) или РПИФ (98,2%) также подтверждает отсутствие различий в чувствительности реакций.

Но, используя данные, полученные при тестировании парных выборок от павших кабанов, и особенно от отстрелянных, статистическая картина меняется. Так, МсNemar's тестом были обнаружены значимые различия чувствительности между ПЦР и РПИФ[2,64 (0,2-4,4)% Р=0,04], которые были выражены существеннее при тестировании парных проб от от стрелянных кабанов [6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01]. Эти различия в чувствительности ПЦР и РПИФ могут, в этом случае, указывать на независимость реакций. Видимое снижение показателей чувствительности двух реакций, и ПЦР (76,6%) и РПИФ (70,2%), будет правильным интерпретировать как проценты обнаруженных инфицированных в популяции отстрелянных кабанов и использовать в качестве величины превалентности, но не расценивать как снижение диагностической чувствительности (биноминальный параметр). Для расчётов диагностической чувствительности в знаменателе используют количество референс-положительных проб, как представлено в таблице 2.

Во всех случаях, сходная величина каппы (0,7) может свидетельствовать как о согласованности реакций, так и об их воспроизводимости.

При раннем подозрении на АЧС (например, при недавнем заносе вируса в стадо свиней) уровень распространения и заболеваемость, как правило, очень низкие (предэпизоотическая стадия), поэтому в такой критический момент парадокс ситуации заключается в том, что, несмотря на признанную чрезвычайную важность раннего установления диагноза АЧС, возникает проблема доверия ветеринарных властей (и, особенно, владельцев) к положительным результатам лабораторных исследований. Для определения вероятности положительных результатов ПЦР и РПИФ и наличия инфекции АЧС, для системы "ПЦР-РПИФ" определяли прогностические положительные и прогностические отрицательные показатели при параллельном выполнении, используя в расчётах данные истинной превалентности [1]. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Расчёты надёжности параллельной схемы выполнения системы "ПЦР-РПИФ" с учётом превалентности случаев АЧС в фермах разного размера (расчёты пакета WinEpiscope 2.0, "MultipleTest")

Примечание: * средние расчётные величины диагностической чувствительности и специфичности ПЦР (98,3°% и 99,7°%) и РПИФ (98,2°% и 99,8°%).

Из данных таблицы 4 видно, что при использовании параллельного проекта проведения лабораторных исследований системы "ПЦР-РПИФ" обнаружены высокие достоверности положительных и отрицательных результатов, подтверждающих инфекцию АЧС у положительно реагирующих индивидуумов. К существенному отклонению доверительного интервала ППР системы до 86,0% в случае подтверждения вспышки АЧС в фермах более 1000 голов скорее имеет отношение ошибка определения величины превалентности случаев инфицирования свиней в станках ферм (очень широкий диапазон доверительного интервала). Поэтому, при первичных случаях инфицирования АЧС в крупных фермах и промышленных свинокомплексах, требования ветеринарных властей подтверждать положительный результат лабораторных исследований референс-методом, а именно биопробой, имеют основание, особенно, если в выборке для исследований будет только одно животное. Двукратный пробег перепроверки полевых положительных выборок в практических ветеринарных лабораториях [1] и ВНИИВВиМ [2] показал практически полное совпадение результатов ПЦР и РПИФ и отсутствие существенных проблем работы "системы", за исключением ошибок I-типа ("ложно-положительные" из-за технической части валидации). Безусловно, при тестировании проб от павших диких кабанов расчётные показатели диагностической чувствительности и ПЦР и РПИФ (табл. 2) хотя и не внушают оптимизма, но здесь ошибка знаменателя при расчётах, то есть "ошибка выборки" истинно инфицированных животных (ошибка II-типа) имеет больший эффект, чем аналитические характеристики реакций.

Заключение. Имея в виду высокую вирулентность вируса АЧС, вызывающего острое течение с летальным исходом даже при сложных проектах выборки, показана высокая точность и достоверность диагностической системы ПЦР- РПИФ при параллельном выполнением и весьма эффективной для подтверждения АЧС. При такой схеме выполнения лабораторных исследований фактор риска "пропуска" инфекции, даже при разных уровнях превалентности, будет минимальным.

При использовании случайной выборки, для повышения вероятности обнаружения инфицированных АЧС кабанов, а в целом и эффективности контроля распространения болезни в неблагополучных популяциях, признавая факт несовершенства диагностических тестов, будет необходимо, наряду с совершенствованием выборки, повышать чувствительность лабораторных исследований введением дополнительного теста(ов), что, конечно, приведёт к их усложнению и стоимости.

Список литературы

1. Белянин С.А. Динамика распространения и мониторинг эпизоотического процесса африканской чумы свиней в РФ, автореф., канд. дис., Покров, 2013, с.27.

2. Вишняков И.Ф., Митин Н.И., Карпов Г.М., Куриннов В.В., Яшин А.Т. Диагностика и дифференциальная диагностика африканской и классической чумы свиней // Ж.Ветеринария-1991-N° 4 - С.28-30.

3. ГОСТ 28573-90 (СТ СЭВ 6539-88) Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Балабанов В.А., Куриннов В.В. и др.// Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней - Москва - 1990.

4. Газаев И.Х., Елсукова А.А., Синдрякова И.П., Цыбанов С.Ж., Колбасов Д.В. // Применение метода ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса африканской чумы свиней //- 7-я Международная научно-практическая конф., "Молекулярная диагностика -2010", М.,с.83-85.

5. Газаев И.Х. Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора //автореф. канд.биол.наук, г. Покров, 2011 г.,с. 26.

6. Копытов В.О., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О., Цыбанов С.Ж. // Идентификация вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции//- Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сб. тезисов Всероссийской науч. конф.-М. 2002,-с.341-343.

7. Куриннов В.В. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики африканской и классической чумы свиней//док. дис, г. Покров, 2000 г., с.360.

8. Куриннов В.В., Черных О.; Миколайчук С. Вспышка африканской чумы в хозяйстве закрытого типа [Краснодарский край, ноябрь 2008 г.] //Животноводство России.- 2009.- N° 4. - С. 29-31.

9. Куриннов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж., Васильев А.П. и др. Африканская чума свиней - главная проблема для свиноводства России // Жизнь без опасностей, 2010,т IV,N°3, стр.82-87.

10. Куриннов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж. и др. //Диагностика и мониторинг при вспышках африканской чумы свиней в республиках Кавказа в 2007-2008 гг.//Ветеринария, - 2008, N°10.- стр.20-25.

11. Цыбанов С.Ж., Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. //Выявление вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)//Тезисы докл. Всерос. Науч--практ. Конф., Вирусные болезни животных,-Владимир, с.26.

12. King D.P., Reid S.M., Hutchings G.H. идр.Development of TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of africam swine fever virus//J. Virol. Methods.-2003,vol.107,N°1, р.53-61.

13. S. Botija, and A. Ordas. Rapid diagnosis by identification of antibodies extracted from tissues using indirect immunofluorescence // Hog Cholera/Classical swine fever and African swine fever, Luxembourg, 1977, c.658-659.

14. Steiger Y., Ackermann M., Mettraux C., Kihm U. Rapid and biologically safe diagnosis of African swine fever virus infection by using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1992, (30), р.1-8.

15. Jose Manuel Sanchez-Vizcaino. African Swine Fever. В 9th Edition Diseases of Swine, Blackwell,2006,р.291-298.

Размещено на Allbest.ru