Роль малих генів у генетичному контролі цитоплазматичної чоловічої стерильності кукурудзи молдавського типу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Роль малих генів у генетичному контролі цитоплазматичної чоловічої стерильності кукурудзи молдавського типу

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Відкриття цитоплазматичної чоловічої стерильності (ЦЧС) у рослин - одне з видатних досягнень біологічної науки в ХХ столітті, а використання цього явища в практичному рослинництві з метою отримання гетерозисних гібридів є яскравою демонстрацією того, наскільки корисними можуть бути генетичні дослідження для селекційної практики та виробництва. Переведення насінництва кукурудзи на стерильну основу сприяло підвищенню сортових якостей насіння, зменшенню трудових і матеріальних витрат, посівних площ під урожайними гібридами.

У кукурудзи ідентифіковано декілька типів ЦЧС, з яких широко використовуються два: молдавський (М або S) і парагвайський (С). Молдавський тип відкрито у багатьох зразках кукурудзи різного географічного походження. Він використовується тривалий час у практичній селекції і залишається надійнішим типом стерильності завдяки специфічній стійкості до багатьох збудників хвороб, а також відсутності небажаних плейотропних ефектів цитоплазми на продуктивність та інші господарсько-цінні ознаки рослин.

Однак, під час роботи з молдавським типом стерильності виникають певні труднощі, коли інбредні генотипи виявляються стерильними не повністю в М-цитоплазмі або після заміни в них рецесивного гена rf₃ домінантним алеломорфом характеризуються недостатньою фертильністю і здатністю до відновлення. Подібні факти спричиняють негативне ставлення деяких фахівців до молдавського типу стерильності та перешкоджають використанню цього типу ЦЧС в селекційній роботі.

Вивченню причин нечіткого і непостійного цвітіння окремих генотипів з молдавським типом стерильності, що суперечить відомим уявленням про генетичний контроль цієї ознаки, на наш погляд, не було приділено належної уваги. Перші спеціальні генетико-селекційні дослідження у цьому напрямі розпочаті в Інституті зернового господарства УААН (м. Дніпропетровськ), де було висунуто концепцію дії малих генів (Гонтаровский, 1971). Сучасні провідні дослідження в цій галузі належать Gabay-Laughnan, Chase, Zhang та іншим. Наші досліди, що проводилися з цієї актуальної проблеми, спрямовані на конкретизацію ролі малих генів у генетичному контролі ЦЧС молдавського типу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації проводилися протягом 1999-2005 років і є складовою частиною досліджень відділу селекції кукурудзи Інституту зернового господарства УААН з розробки нових підходів до селекції вихідного матеріалу для створення високоврожайних гібридів кукурудзи. Роботу виконано згідно з Державною комплексною науково-технічною програмою УААН «Зернові та олійні культури» за темою «Генетичний контроль цитоплазматичної чоловічої стерильності» (номер державної реєстрації 0197U000090).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - визначення ролі малих генів у генетичному контролі молдавського типу ЦЧС.

Для досягнення мети було поставлено такі завдання:

- визначити генетичні особливості окремих ліній у реакції на цитоплазму молдавського типу;

- визначити дію малих генів на фоні рецесивного алеломорфа Rf₃ в різних генетичних середовищах та умовах вирощування;

- створити генетичну модель лінії з максимальною кількістю малих генів;

- визначити взаємодію малих генів з головним Rf₃;

- вивчити вплив малих генів на ступінь фертильності пилкових зерен.

Об'єкт дослідження - цитоплазматична чоловіча стерильність кукурудзи.

Предмет дослідження - генетичні особливості дії основних і малих генів, які контролюють цитоплазматичну чоловічу стерильність кукурудзи молдавського типу.

Методи дослідження. У дослідженнях використовували гібридологічний метод - гібридизація, самозапилення, реципрокні та інші схрещування; візуальний - класифікація рослин за ознакою стерильності та фертильності за шкалою, прийнятою в лабораторії (Гонтаровский, 1971); цитологічний - йодний метод визначення фертильності пилку; математико-статистичні - метод рангової кореляції Спірмена, метод ч².

Наукова новизна одержаних результатів. Доведено, що у фертилізації пилку в М-цитостерильних генотипах крім головного гену Rf₃ беруть участь інші гени, названі малими. Це переважно домінантні гени, не алельні Rf₃. Встановлено, що дія малих генів носить кумулятивний характер. Вони можуть мати самостійне вираження в рецесивних генотипах за головним геном і посилювати його експресивність, коли Rf₃ знаходиться у домінантному стані.

Створено лінію з комплексом малих генів, яка має повну фертильність у цитоплазмі молдавського типу стерильності в присутності головного гену у рецесивному стані та може використовуватися як джерело малих генів.

Практичне значення одержаних результатів. Конкретизація уявлень про генетичну природу поведінки М-цитостерильних генотипів за ознакою фертильності пилку має значення для селекції кукурудзи на стерильній основі. Виходячи з ролі та особливостей дії малих генів, можна переборювати ті труднощі, з якими зустрічаються спеціалісти при використанні молдавського типу ЦЧС, цілеспрямовано створюючи аналоги ліній, рецесивних за геном rf₃ з постійною високою стерильністю та надійні аналоги відновлення фертильності. Отриману лінію можна використовувати як джерело малих генів для створення аналогів-відновлювачів.

Особистий внесок здобувача. Огляд літератури, проведення польових і лабораторних дослідів, обґрунтування одержаних результатів і написання роботи проводилися автором особисто. Формування завдань роботи, планування напряму досліджень, інтерпретацію отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи оприлюднені та обговорювались на засіданнях вченої ради Інституту зернового господарства УААН (2000-2003 рр.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів «Наукові проблеми виробництва зерна в Україні та сучасні методи їх вирішення» (м. Дніпропетровськ, 10-11 лютого 2000 р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів з проблем зерна в Україні (м. Дніпропетровськ, 5-6 березня 2002 р.), на Міжнародній науково-практичній конференції «Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання» (м. Оброшино, 29 червня-1 липня 2005 р.), на науковій конференції молодих учених «Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології» (м. Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.), на ІІІ міжнародній конференції молодих учених «Biodiversity. Ecology. Evolution. Adaptation.» (м. Одеса, 15-18 травня 2007 р.).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 12 наукових робіт, з яких 5 - статті у фахових виданнях ВАК України, 1 - у збірнику наукових праць, 6 - тези доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційну роботу викладено на 159 сторінках машинописного тексту. Вона містить 57 таблиць, 3 рисунки, 2 додатки. Текстова частина складається зі вступу, шести розділів, висновків, практичних рекомендацій та додатків. Список використаних джерел включає 220 найменувань, у тому числі 131 латиницею.

Основний зміст

алеломорф молдавський ген зерно

Цитоплазматична чоловіча стерильність як приклад нехромосомної спадковості (огляд літератури)

Наведено літературний огляд з питань цитоплазматичної чоловічої стерильності кукурудзи. Приведено історію вивчення явища. Розглянуто генетичні аспекти та цитологічні основи успадковування ЦЧС та функції відновлення пилку. Показано агрономічні характеристики рослин кукурудзи з ЦЧС. Наведений аналіз даних дозволяє зробити висновок про актуальність та необхідність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

Ґрунтово-кліматичні умови, вихідний матеріал та методика проведення досліджень

Експериментальну частину досліджень проводили протягом 1999-2002 рр. у дослідному господарстві «Дніпро» Інституту зернового господарства УААН, 2003-2005 рр. - у науково-виробничому фермерському господарстві «Компанія «Маїс». Дослідне господарство знаходиться в центральній частині Дніпропетровської області. Територія області характеризується помірно континентальним кліматом з нестійким та недостатнім зволоженням (належить до північної підзони Степу України). 1999, 2001 та 2002 роки були посушливими, а 2000, 2003-2005 - сприятливими для росту і розвитку рослин кукурудзи.

Дія малих генів вивчалася на інбредному та гібридному рівнях. Дослідження на інбредному фоні проводилися на rf₃-рецесивному, Rf₃-домінантному та на гетерозиготному рівнях. Для цього використовували 32 самозапилені лініії з різною здатністю до стерилізації та їх М-цитостерильні аналоги. Загальна схема досліджень зображена на рис. 1.

Для вивчення дії малих генів на rf₃-рецесивному фоні застосовували прості, діалельні, потрійні, зворотні, чотирилінійні схрещування, а також друге покоління гібридів F₂.

У простих схрещуваннях використовували чотири М-цитостерильні лінії А619, Дн619, Р149 і Р502, які схрещували з набором ліній з нормальною цитоплазмою: А111, А344-2-1, А357, А385, А392, А395, А619, В73, СО179, ДК66, F135, F522, Iuv132, Lc184, МО17, Р092, Р165, Р149, Р346, Р502, W8, W401, W729.

Десять ліній із названого набору (А111, А385, А619, В73, СО179, Р149, Р165, Р502, W401, W729) застосовували у діалельних схрещуваннях в М-цитоплазмі, а також у потрійних та чотирилінійних схрещуваннях.

За участю ліній А385, А619 і Р149 було створено прості гібриди (А385М Ч А619, А619М Ч Р149 і А385М Ч Р149), на основі яких отримували друге покоління гібридів і зворотні схрещування. Ці комбінації вивчали в польових та тепличних умовах.

Для вивчення взаємодії малих генів з головним Rf₃ проводили прості та зворотні схрещування. Прості схрещування отримували за двома схемами. У першій використовували чотири цитостерильні лінії А619М, Дн619М, Р149М і Р502М, які схрещували з набором Rf₃-домінантних генотипів: А34, А111МУВ, А344МУВ, А357нУВ, А385нМВ, А392МВ, А619МВ, Б907тУВ, В73МВ, СО179МВ, ДК66МВ, Дн502МВ, F135МВ, F522МВ, Iuv132МВ, Lc184МВ, Lc185МВ, МО17МВ, Р092МВ, Р165МВ, Р346МВ, W8МВ, W401МВ, W729МВ. В іншому досліді, навпаки, набір М-аналогів ліній А73, А111, А158, А295, А334, А344-2-1, А392, А395, А619, В73, СК32, СО179, ДК66, Дн619, F522, Iuv132, Lc184, МО17, Oh51, Р092, Р101, Р165, Р346, Р502, W8, W401, W729 схрещували з Rf₃-лініями А34, Б907тУВ, Дн502МВ, А619МВ, Р149МВ.

Для вивчення розщеплення гетерозигот проводили зворотні схрещування з батьківськими rf₃-генотипами в прямому та зворотному напрямках. У першому випадку в якості материнської форми використовували прості гібриди (ЦитМRf₃rf₃), які схрещували з rf₃-рецесивними лініями. В другому випадку материнськими формами були М-аналоги rf₃-ліній, а батьківські форми представлені простими гібридами (ЦитМRf₃rf₃).

Агротехнічні прийоми, застосовані в ході досліджень, відповідали рекомендаціям, які викладено у «Методиці польових дослідів із кукурудзою» (1980).

Кукурудзу вирощували в спеціальних селекційних сівозмінах у польових умовах, а також у посудинах в умовах теплиці. Розмір ділянок у полі складав 4,9; 9,8 та 18,6 м². Світловий день у теплиці тривав близько десяти годин. Під час цвітіння рослини оцінювали за ознаками стерильності та фертильності за шкалою, прийнятою в лабораторії: клас 0 - повна стерильність, всі, або майже всі стерильні пиляки знаходяться в закритих колосках; клас 1 - повна стерильність, значна або масова кількість стерильних пиляків виходить назовні; клас 2 - неповна стерильність, кількість фертильних пиляків не перевищує 25%; клас 3 - часткова фертильність, кількість фертильних пиляків складає 25-75%; клас 4 - неповна фертильність, кількість фертильних пиляків складає більше ніж 75%; клас 5 - повна фертильність, всі пиляки фертильні.

Гаметофітне розщеплення гетерозигот вивчали за підрахунком фертильних пилкових зерен під мікроскопом за методикою, описаною Паушевою (1970). Для підрахунку достовірності відхилень від очікуваного розщеплення проводили математичну обробку даних за методом ч². Для оцінки зв'язку у виявленні ознак стерильності та фертильності rf₃-рецесивних генотипів знаходили коефіцієнт рангової кореляції Спірмена.

Рецесивні Rf₃-генотипи на інбредному рівні

Вивчення рецесивних rf₃-генотипів на інбредному рівні в польових умовах проводилося в різні за погодними умовами роки (посушливі 1999 і 2002 та сприятливий 2000). Це дало можливість виділити лінії зі стійким проявленням повної стерильності рослин: А158, А295, А334, А334, А344-2-1, А392, В73, СК32, СО179, Дн619, F135, Iuv132, P101, P165, P346, P502, W8, W401. У інших ліній (А357, А395, МО17, Oh51A, W729) за високої стерильності окремі рослини характеризувалися дуже низьким рівнем фертильності, який виражається звичайно у викиданні одиничних стерильних пиляків з відкритою порою. Такі рослини належали до класу 2=. Лінії А111, А385, А619, ДК66, Lc184, Р149 відрізнялися частковим цвітінням аналогів у різні роки.

Більшість ліній, які стерильні в М-цитоплазмі в польових умовах, зберігають її також при вирощуванні в теплиці. Не змінюється і характер її виявлення (клас 0). Винятки складали аналоги ліній F522 і Р502, рослини яких відрізнялися масовим викиданням стерильних пиляків (клас 1). Щодо аналогів ліній А385, А619 і Р149, то в теплиці фертильність рослин була вищою, ніж у польових умовах. Особливе місце серед них займає лінія Р149, аналог якої характеризується майже нормальною фертильністю. У несприятливі роки у випробуваннях на полі рослини Р149М були переважно стерильними. Таким чином, за лінією Р149М у цитостерильних рослинах спостерігається найвища амплітуда мінливості ознаки - від повної стерильності до нормальної фертильності.

Окремо вивчалися потомства індивідуальних рослин Р149М, отримані від запилення пилком нормальної лінії одного походження. При цьому будь якого зв'язку між характеристикою материнських рослин і потомствами не спостерігалося, що свідчить про модифікаційну мінливість.

Таким чином, проведені спостереження за поведінкою цитостерильних аналогів rf₃-ліній у різних умовах свідчать про стійкість ознаки стерильності у більшості з них. Окремі лінії, за відсутністю домінантного гена-відновлювача, характеризуються частковою фертильністю різного рівня - в залежності від генотипу лінії та зовнішнього середовища. В такому разі можна говорити про значення малих генів з меншою експресивністю, ніж Rf₃. Одержані матеріали дозволяють також припускати, що ці лінії розрізняються за кількістю малих генів. Не виключено також, що вони можуть бути різної сили дії.

Рецесивні rf₃-генотипи на гетерогенному рівні

Інбредні лінії з різною реакцією на М-цитоплазму вивчалися в діалельних схрещуваннях (табл. 1).

Таблиця 1. Фертильність рослин у діалельних схрещуваннях між інбредними лініями в М-цитоплазмі (2000, 2002 рр.)

	А111	А385	А619	В73	Со179	Р149	Р165	Р502	W401	W729
А111М	0-3	2-5	2-5	1-5	1; 2	0-4	0-2	0-2	0-2	0-2
А385М		0; 2; 3	5	0-2	0	2-4	0; 2	0-2	0	0-4
А619М			0-2	0; 2	0; 1	2-5	0	0-2	0	0-5
В73М				0	0	2-5	0	0	0; 2	0-2
Со179М					0	2; 3	0	1	0; 2	1; 2
Р149М						0; 2-4	0; 1	0; 1	0-2	0-5
Р165М							0	0	0	0
Р502М								0	0	0-2
W401М									0	0
W729М										0

Дослідження показали, що лінії з частковою фертильністю (А111, А385, А619, Р149), з одного боку, і лінії стерильні (В73, СО179, Р165, W401, Р502, W729), з іншого, відрізняються в схрещуваннях визначеними особливостями. Окремі випадки, які не відповідають цим особливостям, можна розглядати як вказівку на те, що частково фертильні генотипи не є повністю ідентичними за малими генами. Це стосується також генотипів, стерильних у М-цитоплазмі.

Для ліній з частковою фертильністю характерним є неповне цвітіння, коли вони схрещуються поміж собою. При цьому рівень фертильності гібридних рослин звичайно вищий, ніж самих ліній у М-цитоплазмі. В схрещуваннях з лініями, які закріплюють стерильність, відмічається повна стерильність або дуже низький рівень фертильності.

Поведінка rf₃-ліній у схрещуваннях між собою в більшості випадків відповідає такій концепції генетичного контролю:

1. Неповна стерильність у М-цитоплазмі рецесивних за головним геном інбредних ліній зумовлена присутністю неповністю домінантних генів, які мають малий ефект фертилізації.

2. Лінії з високою здатністю до стерилізації є переважно рецесивними гомозиготами за цими ж генами.

3. У гібридних схрещуваннях у М-цитоплазмі між лініями з частковою фертильністю поліпшене цвітіння є результатом сумарної дії малих генів.

4. У гібридних схрещуваннях у М-цитоплазмі між лініями з різною здатністю до стерилізації експресивність малих генів знижується через зменшення їх частки.

Коефіцієнт рангової кореляції Спірмена показав високу залежність між рівнями фертильності діалельних комбінацій в залежності від батьківської форми (r = 0,88; P < 0,01).

В іншому досліді, де лінії з частковою фертильністю вивчалися у зворотних схрещуваннях, були отримані дані, які свідчать про те, який вплив на цвітіння генотипів, рецесивних за головним геном, може мати вплив умови зовнішнього середовища, коли ознака фертильності зумовлена дією малих генів (табл. 2).

Звертає на себе увагу не лише велика різниця в поведінці одних і тих же зразків у тепличних і польових умовах. Чутливість рослин до факторів зовнішнього середовища настільки висока, що навіть генотипово ідентичні рослини простого схрещування в природних умовах ґрунтової й атмосферної посухи, які поступово підвищувалися, не мали фенотипової одноманітності та належали до різних класів (0-5).

Цей випадок можна розглядати як демонстрацію того, наскільки різною може бути експресивність малих генів навіть за невеликий проміжок часу, коли цвітіння проходить в умовах зміни середовища.

Є очевидним, що цвітіння цитостерильної кукурудзи залежить не лише від присутності малих генів, але й тих інших факторів, які зумовлюють фізіологічний стан рослин. Таким чином, за умови дефіциту вологи більшій мінливості підлягають непосухостійкі генотипи. У наших дослідженнях за найважчих умов часто були схрещування з лінією Р149, що приводило до помітно більшого зниження фертильності, ніж у інших випадках.

Таблиця 2. Схрещування між лініями А619 і Р149 у М-цитоплазмі

Назва зразку	Розподіл рослин за класами
	0	1	2	3	4	5
Тепличні умови, 2001 р.
А619М	-	-	2	5	-	-
Р149М	-	-	1	6	-	-
А619М х Р149	-	-	-	3	2	3
(А619М Ч Р149) Ч А619	-	-	2	9	7	22
(А619М Ч Р149) Ч Р149	-	-	2	8	8	22
(А619М Ч Р149) F2	-	-	9	22	6	23
Польові умови, 2002 р.
А619М	26	-	-	-	-	-
Р149М	22	-	1	-	-	-
А619М Ч Р149	7	-	9	4	1	6
(А619М Ч Р149) Ч А619	35	1	11	3	-	-
(А619М Ч Р149) Ч Р149	28	2	8	1	-	-
(А619М Ч Р149) F2	17	3	11	6	1	2

У таблиці 3 приводяться сумарні результати вивчення потрійних гібридів, отриманих на основі тих же ліній, які вивчалися в діалельних схрещуваннях.

Таблиця 3. Фертильність rf₃-рецесивних генотипів у потрійних комбінаціях, 2002 р.

Назва батьківської лінії	Кількість потрійних комбінацій	Кількість рослин	Розподіл рослин
			за класами, в балах	за групами, %
			0	1	2	3	4	5	стер	ч-ф	ферт
W401	10	558	513	14	25	6	-	-	93,9	6,1	-
Р165	6	318	286	14	15	3	-	-	94,3	5,7	-
Р502	6	353	290	24	34	5	-	-	89,0	11,0	-
СО179	10	516	447	22	40	7	-	-	90,9	9,1	-
W729	10	541	402	22	86	18	10	3	79,1	18,5	2,4
А385	5	272	74	41	68	35	21	33	46,0	34,1	19,9
А111	10	520	164	78	111	61	28	64	46,5	35,4	18,1
А619	6	360	116	13	111	54	29	36	30,0	51,2	18,3
Р149	6	353	177	29	101	31	8	7	36,8	60,2	3,0

У всіх трилінійних комбінаціях батьківською формою використовувалася одна лінія, питома вага якої в потомствах розщеплення складала Ѕ. Як видно з таблиці 3, рівень фертильності рослин у схрещуваннях з лінією Р149 у важких умовах 2002 року був значно нижчим, ніж у схрещуваннях з лініями А11, А385, А619. Привертає увагу той факт, що у всіх комбінаціях, де батьківськими формами були лінії з високою здатністю до стерилізації (W401, Р165, Р502, СО179), фертильні рослини відсутні, а частково-фертильні складали 5-11%.

У схрещуваннях з іншими лініями розщеплення носило складний характер, де доля фертильних рослин доходила до 18-20%. Ці дані можуть бути пояснені з тих же позицій, що і поведінка ліній у простих діалельних схрещуваннях, припускаючи, що малі гени є переважно неповністю домінантними і дія їх носить кумулятивний характер.

Коефіцієнт рангової кореляції Спірмена показав високу достовірну залежність між рівнями фертильності діалельних і потрійних комбінацій (r = 0,87; P < 0,01).

Таким чином, можна стверджувати, що в схрещуваннях з лініями, які мають високу здатність до фертилізації, виникають генні сполучення, які мають значно більшу експресивність, ніж вихідні генотипи. Дослідження показали, що, використовуючи самозапилення і відбір, можна фіксувати рекомбінанти з високою фертильністю. В наших дослідженнях для формування і виділення подібних генотипів були проведені «здвоєні» схрещування між лініями А619, Р149 і А385. У структурі кожного «здвоєного» гібриду одна з ліній повторюється двічі. Доля генотипу такої лінії в схрещуваннях дорівнювала Ѕ, для кожної іншої - ј.

Фертильні рослини у здвоєних схрещуваннях складали 26-30%, а після однократного самозапилення - 20-94%. У результаті повторного самозапилення були виділені потомства з нормальним цвітінням (табл. 4).

Таблиця 4. Фертильність потомств складних схрещувань між лініями з високою здатністю до фертилізації після II генерації самозапилення, 2003 р.

№ потомства	Формула вихідного схрещування	Кількість рослин у потомстві	Розподіл рослин за групами, %
			стер	ч/ферт	ферт
1	(А385М Ч А619) Ч (А385 Ч Р149)	16	6,25	18,75	75,0
2	(А385М Ч А619) Ч (А619 Ч Р149)	14	-	-	100,0
3	(А385М Ч Р149) Ч (А619 Ч А385)	10	-	30,0	70,0
4	(А385М Ч Р149) Ч (А619 Ч А385)	19	-	-	100,0
5	(А385М Ч Р149) Ч (А619 Ч А385)	16	6,25	6,25	87,5

У наступних генераціях розмноження із застосуванням самозапилення висока фертильність рослин зберігається. Нові лінії представляють цінність як джерела комплексу малих генів для створення відновлювачів фертильності молдавського типу ЦЧС.

Присутність малих генів з самостійним фенотипічним ефектом може створювати серйозні труднощі під час селекції стерильних аналогів ліній. В таких випадках потрібна їх реконструкція, спрямована на заміщення малих генів рецесивними алелями іншої лінії. В Інституті зернового господарства УААН (м. Дніпропетровськ) подібні дослідження були проведені на прикладі А619. Змінена лінія отримала назву Дн619.

У наших дослідах цитостерильні аналоги ліній А619 і Дн619 вивчалися в паралельних схрещуваннях з 20 іншими лініями. Спостереження за цвітінням проводилися в достатньо сприятливих умовах і, незважаючи на це, майже всі комбінації з Дн619 (16) характеризувалися повною стерильністю. У схрещуваннях з оригінальною лінією А619 стерильність була відмічена лише в чотирьох випадках.

Якщо виходити з того, що малі гени мають кумулятивну дію, то для досягнення стерильності немає необхідності в заміщенні їх усіх. Кількість таких генів, очевидно, може бути невеликою, і заміщення їх досягається за допомогою беккросів і відповідного контролю у схрещуваннях з цитостерильним тестером у відносно невеликих масштабах. Наслідки подібного добору можуть мати універсальний характер, коли змінена лінія отримує здатність закріплення у схрещуваннях з різними генотипами.

Домінантні rf₃-генотипи в м-цитоплазмі

Лінії з різною здатністю до стерилізації, які розглядалися вище, вивчали в порівнянні з їх аналогами-відновлювачами, у яких рецесивний ген rf₃ був замінений домінантним алеломорфом. Таким чином, майже на ізогенному рівні передбачалося прослідкувати зв'язок між здатністю до фертилізації rf₃-генотипів і поведінкою Rf₃-аналогів.

Домінантні Rf₃-генотипи вивчали на інбредному рівні, у простих схрещуваннях і беккросах.

Як відомо, не всі лінії з нормальною цитоплазмою характеризуються високою фертильністю. Тому неповне цвітіння Rf₃-аналогів може мати різні причини, у зв'язку з чим у дослідах висівали не лише аналоги-відновлювачі, а й оригінальні лінії. Відповідно до отриманих даних за фертильністю домінантних генотипів лінії можна розділити на такі групи:

1. Лінії, аналоги-відновлювачі яких в умовах різних років характеризуються високим рівнем фертильності (А619, В73, F135, F522, Мо17, Р346). У цьому відношенні аналоги є подібними до нормальних ліній.

2. Лінії, аналоги-відновлювачі яких у важких умовах знижують рівень фертильності, як і вихідні лінії. У сприятливих умовах ті та інші цвітуть нормально (Iuv132, P092, P502, W8, W729).

3. Лінії, аналоги-відновлювачі яких у посушливих умовах погіршують цвітіння в більшій мірі. У сприятливих - різниця практично відсутня (А344-2-1, А392, А395, СО179, Lc184, P165, W401).

4. Особливе місце займають лінії Lc184 і А111, аналоги-відновлювачі яких у посушливих умовах мають вищий рівень фертильності, ніж оригінальні лінії. Можливо, що у випадку Lc184 у процесі селекції вдалося передати аналогу гени, які підвищують фізіологічну стійкість рослин до посухи. Щодо А111, то в попередні роки, коли створювався МВ-аналог, часткова фертильність, як і інші ознаки деякого пригнічення, в цієї лінії не спостерігалися. Найімовірнішою причиною погіршення цвітіння є мутаційні процеси, які могли відбутися пізніше.

Найбільшу чутливість до жорстких умов проявляють аналоги-відновлювачі тих ліній, які за нашою класифікацією були віднесені до ліній з високою здатністю до стерилізації (Р165, СО179, W401). Серед останніх називалася також лінія Р502. Однак фертильність аналога-відновлювача цієї лінії є близькою до Р502. Тут немає суперечності, тому що селекція аналога-відновлювача лінії відбувалася за оригінальною схемою, що передбачає передачу аналогові не лише головного гена, але й інших, які підвищують його експресивність.

Аналоги-відновлювачі ліній, які мають здатність до фертилізації, характеризуються вищою стійкістю ознаки, що також відповідає уявленню про малі гени як підсилювачі дії головного в домінантних генотипах ЦитМRf₃ -.

Заслуговують уваги результати вивчення тих же відновлювачів у гібридних схрещуваннях. У відносно сприятливих умовах вирощування фертильність рослин була переважно високою. Лише в окремих комбінаціях зі стерильним аналогом лінії Р502 помітні відхилення від норми (класи 3-4). У схрещуваннях з цією лінією в посушливих умовах мали місце частіші зміни, коли фертильність знижувалася до класів 3-4, а в комбінації з аналогом-відновлювачем лінії А344 - до класів 1-2. Навпаки, сталою висока фертильність була у схрещуваннях з А619М. Як було показано вище, Р502 і А344 є лініями з високою здатністю до стерилізації, а А619 - до фертилізації.

Серед відновлювачів постійністю в різних схрещуваннях і умовах виділялися А619МВ, Дн502МВ і Р149МВ, генотипові особливості яких обговорювалися. При цьому зверталася увага на присутність у них поряд з домінантним алеломорфом Rf₃ малих генів.

Для вивчення ролі малих генів у відновленні фертильності гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ проводили також зворотні схрещування, в яких батьківськими формами, що повторюються, використовували лінії з високою і низькою здатністю до стерилізації. Джерелами М-цитоплазми і гену Rf₃ у цих схрещуваннях були стерильні аналоги й аналоги-відновлювачі тих же ліній. Подібний підхід дозволив провести порівняльний аналіз здатностей до стерилізації і відновлення, відповідно, рецесивних і домінантних за головним геном варіантів.

Як відомо, в аналізуючих схрещуваннях очікується розщеплення за ознакою, що просто успадковується, в співвідношенні 1:1. У наших дослідженнях не всі комбінації відповідали такій формулі.

У схрещуваннях, де батьківською формою, яка повторюється, була лінія Р502, переважали стерильні рослини. За умови віднесення до «квітучих» рослин не лише фертильних, але й частково фертильних (класи 2-3), питома вага їх складала менше Ѕ, коли Р<0,05 і ч ²_1:1>4. Таким чином, у цих випадках окремі генотипи виявилися стерильними і частково-фертильними, незважаючи на присутність у них домінантного алеломорфу Rf₃.

У зворотних схрещуваннях з іншою лінією - Дн619, яка має високу здатність до стерилізації, спостерігали аналогічне розщеплення. Воно не носило чіткого характеру, і серед квітучих переважали частково-фертильні рослини. Коли батьківською формою, яка повторюється, використовували лінії з вищою здатністю до фертилізації, питома вага фертильних рослин підвищувалася.

У цих дослідженнях стерильний аналог Дн619М спочатку схрещувався з різними аналогами-відновлювачами (А392МВ, ДК66МВ, F522MB, W8MB, Lc184MB, Iuv132MB, В73МВ), а зворотними батьківськими формами в беккросах були оригінальні лінії (А392, ДК66, F522, W8 і інші). Розщеплення часто відповідало формулі 1:1. Суттєві відхилення мали місце у схрещуваннях з Lc184 і Iuv132. У першому випадку фертильні (клас 5) рослини складали Ѕ. Очевидно, вони мають генотип ЦитМRf₃rf₃; інші були стерильними і частково-фертильними (клас 2). Лінія Lc184 схильна до часткової фертильності в М-цитоплазмі, і можна вважати, що вони були одного генотипу (ЦитМrf₃rf₃).

У беккросах з Iuv132 фертильні рослини відсутні. У посушливих умовах 2002 року відмічалося погіршення цвітіння оригінальної лінії, і низький рівень фертильності схрещувань, очевидно, був результатом невисокої посухостійкості.

В іншому досліді зворотні схрещування проводилися між лініями з високою здатністю до фертилізації. Майже у всіх беккросах переважали квітучі рослини, фертильні складали Ѕ, відповідаючи долі гетерозигот ЦитМRf₃rf₃.

Заслуговують детальнішого розгляду дані вивчення інших зворотних схрещувань, представлених у таблиці 5.

Таблиця 5. Розщеплення гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ у зворотних схрещуваннях з лініями, які мають різну здатність до стерилізації, 2002 р.

Назва	Кількість рослин	Розподіл за класами	Очікуване розщеплення	ч 21:1	Р
		0	1	2	3	4	5
(P502MЧA385нМВ)ЧР502	50	30	13	4	3	-	-	25:25	25,92	Р<0,01
(А385МЧДн502МВ)ЧР502	69	9	17	10	8	2	3	34,5:34,5	4,19	0,05>Р>0,01
(P502MЧA385нМВ)ЧА385	51	8	8	17	5	1	12	25,5:25,5	7,08	Р<0,01
(А385МЧДн502МВ)ЧА385	53	-	-	8	10	5	30	26,5:26,5	53	Р<0,01
(Р502МЧА619МВ)ЧР502	22	12	3	5	1	1	-	11:11	2,91	0,2>Р>0,05
(А619МЧДн502МВ)ЧР502	59	34	8	10	3	-	4	29,5:29,5	10,59	0,05>Р>0,01
(Р502МЧА619МВ)ЧА619	43	15	1	8	3	2	14	22,5:22,5	2,81	0,2>Р>0,05
(А619МЧДн502МВ)ЧА619	52	16	2	14	4	1	15	26:26	4,9	0,05>Р>0,01
(Р149МЧДн502МВ)ЧР502	52	24	3	12	7	1	5	26:26	0,08	0,8>Р>0,5
(Р502МЧР149МВ)ЧР502	59	37	8	11	2	1	-	29,5:29,5	16,29	Р<0,01
(Р149МЧДн502МВ)ЧР149	56	16	-	8	8	3	21	28:28	10,29	Р<0,01
(Р502МЧР149МВ)ЧР149	50	29	2	9	5	4	1	25:25	2,88	0,2>Р>0,05
(Р165МЧА385нМВ)ЧР165	51	30	-	2	2	2	15	25,5:25,5	1,33	0,5>Р>0,2
(А385МЧР165МВ)ЧР165	38	22	-	4	3	5	4	19:19	0,95	0,5>Р>0,2
(Р165МЧА385нМВ)ЧА385	59	14	7	6	-	-	32	29,5:29,5	4,89	0,05>Р>0,01
(А385МЧР165МВ)ЧА385	65	5	15	26	9	1	9	32,5:32,5	9,62	Р<0,01
(Р165МЧА619МВ)ЧР165	28	17	-	-	1	3	7	14:14	1,29	0,5>Р>0,2
(А619МЧР165МВ)ЧР165	47	27	1	5	1	2	11	23,5:23,5	1,72	0,2>Р>0,05
(Р165МЧА619МВ)ЧА619	19	5	-	6	3	1	4	9,5:9,5	2,13	0,2>Р>0,05
(А619МЧР165МВ)ЧА619	53	30	2	9	-	3	9	26,5:26,5	2,28	0,2>Р>0,05
(Р165МЧР149МВ)ЧР165	40	22	1	1	4	5	7	20:20	0,9	0,5>Р>0,2
(Р149МЧР165МВ)ЧР165	40	21	-	1	2	2	14	20:20	0,94	0,5>Р>0,2
(Р165МЧР149МВ)ЧР149	58	22	1	19	7	4	5	29:29	2,48	0,2>Р>0,05
(Р149МЧР165МВ)ЧР149	51	24	1	6	6	6	8	25,5:25,5	0,02	0,95>Р>0,8

У кожному простому схрещуванні генотипи батьківських ліній є контрастними за реакцією на М-цитоплазму, і в одних комбінаціях використовуються їх стерильні аналоги (ЦитМrf₃rf₃), в інших - аналоги-відновлювачі (ЦитМRf₃Rf₃). Зворотною батьківською формою у всіх схрещуваннях є оригінальні лінії (ЦитNrf₃rf₃). Тут ми маємо можливість проводити порівняння як між рецесивними лініями, так і їх домінантними аналогами на дуже близькому генетичному фоні.

Як видно з таблиці 5, в усіх схрещуваннях, де зворотною батьківською формою є лінія Р502, переважають стерильні та частково-фертильні рослини, на відміну від тих, де зворотною батьківською формою є лінії з високою здатністю до фертилізації (А385, А619, Р149). В останньому випадку фертильні рослини складають, як правило, близько половини, відповідаючи долі гетерозигот за головним геном. Дані таблиці свідчать також про те, що генотип лінії Дн502МВ відрізняється від Р502 не лише головним геном Rf₃, але і тими іншими генами, які посилюють ефект останнього (в схрещуваннях, де використовується лінія Дн502МВ, фертильність вища). У комбінаціях, де наводили порівняльне вивчення інших ліній, спостерігається менша різниця. Аналог-відновлювач А385МВ показав більші переваги як відновлювач фертильності в порівнянні з Р165МВ.

Близькі картини розщеплень отримали у схрещуваннях Р165МВ і А619МВ, Р165МВ і Р149МВ, незважаючи на те, що оригінальна лінія Р165 має вищу здатність до стерилізації, ніж А619 и Р149. Можливо, що під час селекції аналога-відновлювача лінії Р165, були передані інші гени, які посилюють експресивність головного. Теоретично така можливість існує, найбільш переконливо вона була продемонстрована на прикладі лінії Р502.

Крім зворотних схрещувань гібридів з рецесивними за головним геном лініями, проводилися аналізуючі схрещування, де материнськими формами використовували аналоги тих же ліній. У подібних схрещуваннях очікується повна фертильність, якщо вважати, що у гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ життєздатними є лише домінантні гамети, і для відновлення фертильності достатньо головного гену. Однак розглянуті вище експериментальні матеріали показують, що, з одного боку, відновлення фертильності в М-цитоплазмі може забезпечуватися малими генами за відсутністю головного, з іншого боку, ген Rf₃ може не відновлювати фертильність за відсутністю малих генів.

Дослідження показують, що фертильність рослин в аналізуючих схрещуваннях в найбільшій мірі залежить від генотипових особливостей зворотної батьківської форми. В комбінаціях з М-стерильними аналогами ліній з високою здатністю до закріплення фертильність завжди нижча, ніж у схрещуваннях з лініями, які мають підвищену здатність до фертилізації. В окремих комбінаціях з Р502М фертильні рослини складали невелику питому вагу або навіть були відсутні. Навпаки, у схрещуваннях з М-стерильними лініями з підвищенною здатністю до фертилізації (ДК66, W8), фертильні рослини переважали.

Уявленню про роль малих генів як підсилювачів головного Rf₃, відповідають також результати вивчення реципрокних схрещувань. Майже у всіх парах фертильність комбінацій (ЦитМrf₃rf₃ Ч ЦитМRf₃rf₃) вища. Це свідчить про гаметофітну дію генів відновлення.

При порівняльному вивченні А619 і Дн619 були отримані також різні результати. У зворотних схрещуваннях з А619М стерильні рослини були відсутні або складали невеликий процент. У беккросах з іншою лінією - Дн619М питома вага їх могла перевищувати 50%.

Мікроскопічний аналіз пилку

Цитостерильні генотипи, рецесивні та гетерозиготні за головним геном, вивчали за ознакою фертильності пилку. Як критерій фертильності приймалася реакція пилку на йодне забарвлення і його форма.

Мікроскопічний аналіз пилку проводили у рослин різних класів фертильності (2-5) простих і більш складних схрещувань.

Фертильність рецесивних генотипів ЦитМrf₃rf₃ коливалася в широких межах, хоча в жодному випадку повною вона не була. В рослинах з найвищим рівнем фертильності нормальний пилок складав 85-90%. Візуально ці рослини відносилися до класів 4-5.

Серед простих схрещувань висока фертильність відмічалася у рослин гібриду А385М х А619 (13,7% стерильного пилку). Інші прості гібриди мали значно менший рівень фертильності (41-58% стерильного пилку). Найнижчий рівень фертильності помітний в окремих рослинах схрещування (Р502М Ч Р165) Ч А619, де з трьох ліній дві характеризуються високою здатністю до стерилізації (близько 70% стерильного пилку).

В окремому досліді проводили підрахунок фертильних і стерильних пилкових зерен у цитостерильних гетерозиготах Rf₃rf₃. У цих дослідженнях лінії з різною здатністю до стерилізації схрещувалися з одними і тими ж відновлювачами, що дозволило виявити відносну роль обох батьківських форм у процесах відновлення чоловічої фертильності.

Наскільки значною була різниця в розщепленні гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ в залежності від відновлювача, демонструють дані, представлені в таблиці 6.

Таблиця 6. Фертильність цитостерильних гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ у схрещуваннях з різними лініями-відновлювачами, 2002 р.

Назва лінії-відновлювача	Число схрещувань зі стерильними аналогами ліній	Число фертильних пилкових зерен у схрещуваннях, %
		розмах мінливості	середнє
Б907тУВ	19	19,2 - 51,8	41,7
А34	20	19,3 - 55,0	44,9
Р149МВ	23	26,5 - 83,2	60,5
Дн502МВ	20	34,0 - 79,1	59,2
А619МВ	21	43,9 - 77,6	62,1

У схрещуваннях з відновлювачами А619МВ, Дн502МВ і Р149МВ фертильність була високою. Вихідні лінії А619 і Р149 у М-цитоплазмі характеризуються неповною стерильністю, і в схрещуваннях з іншими генотипами в М-цитоплазмі нерідко дають часткову фертильність. Що до аналога Дн502МВ, як вказувалося раніше, вихідна лінія підлягала суттєвій реконструкції.

На рівень фертильності комбінацій впливав також генотип М-стерильної лінії. Найнижча фертильність відмічалася в схрещуваннях з лініями, які мають високу здатність до стерилізації (А295М, А344-2-1М, Oh51АМ, Р092М, Р165М).

Аналіз і узагальнення отриманих результатів

У цьому розділі дисертації узагальнено результати проведених досліджень щодо участі малих генів у фертилізації пилку М-цитостерильних генотипах кукурудзи.

Висновки

У дисертаційній роботі узагальнено дослідження щодо визначення ролі малих генів у генетичному контролі ЦЧС кукурудзи молдавського типу. Отримані експериментальні дані дозволяють сформулювати наступні висновки:

1. Молдавський тип цитоплазматичної чоловічої стерильності контролюється декількома генами. Крім головного Rf₃ існують інші гени - малі, експресивність яких є меншою. Ці гени не алельні Rf₃. Ефекти малих генів не є рівнозначними. Виявлені різні рівні їх фертильності у М-цитоплазмі - від низького (лінії А395, W729) до високого (лінія Р149).

2. Фертильність є домінантною або неповністю домінантною ознакою. Лінії, схильні до часткової фертильності, в схрещуваннях зі стерильними лініями в багатьох випадках повторюють ознаку в потомстві.

3. Фертильність можна розглядати як порогову ознаку. Пороговість ознаки полегшує завдання реконструкції генотипів ліній, які мають неповну здатність до закріплення. Вона полягає у заміни не всіх, а лише окремих малих генів їх рецесивними алеломорфами. Прикладом такої реконструкції може бути лінія Дн619.

4. Взаємодія малих генів носить кумулятивний характер. Відновлення фертильності, часткової або повної, відбувається за поєднання малих генів у одному генотипі. Це може досягатися методами селекції, під час створення рекомбінантів з високим рівнем фертильності. Отримана в дослідженнях лінія з комплексом малих генів має високу фертильність (клас 5) у молдавській цитоплазмі в присутності головного гену у рецесивному стані.

5. Малі гени в інбредних лініях, домінантних за головним геном, посилюють дію останнього, виступаючі його модифікаторами. У сприятливих умовах зовнішнього середовища малі гени для відновлення фертильності в М-цитоплазмі мають менше значення.

6. Малі гени можуть здійснювати самостійний ефект. В аналізуючих схрещуваннях співвідношення стерильних і фертильних рослин не завжди відповідає розщепленню 1:1.

7. М-цитостерильні генотипи з головним геном у домінантному стані і дефіцитом малих генів можна ефективно змінювати методами селекції до прояву повної фертильності, передбачаючи заміну декількох рецесивних алелей домінантними. Прикладом може бути лінія Р502 та її аналог-відновлювач Дн502МВ.

8. Відмінності у фертильності рослин у реципрокних схрещуваннях гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ зумовлені не лише дією гена Rf₃, але й участю в заплідненні гамет з рецесивним головним геном, фертильність яких відбувається за рахунок дії малих генів. Питома вага фертильного пилку різних гетерозигот ЦитМRf₃rf₃ коливається в межах 19-83%.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. *Тарасенко О.М. Взаємодія малих генів у rf₃-рецесивних генотипах кукурудзи з молдавським типом ЦЧС / О.М. Тарасенко // Науковий вісник Ужгородського університету. - Ужгород, 2006. - №18. - С. 9-14.

2. Гонтаровський В.О. Відновлення фертильності Rf₃-гетерозигот в цитоплазмі молдавського типу ЦЧС / В.О. Гонтаровський, *О.М. Тарасенко // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - Біла Церква, 2006. - №37. - С. 76-82 (Доля участі здобувача - 70%, особистий внесок: проведення польових та лабораторних досліджень, узагальнення даних).

3. *Тарасенко О.М. Розщеплення Rf₃-гетерозигот у зворотних схрещуваннях кукурудзи з молдавським типом цитоплазматичної чоловічої стерильності / О.М. Тарасенко // Вісник Дніпропетровського державного університету. - Дніпропетровськ, 2007. - №3/1. - С. 175-182.

4. *Тарасенко О.М. Прості та потрійні схрещування rf₃-рецесивних ліній кукурудзи з молдавським типом цитоплазматичної чоловічої стерильності / О.М. Тарасенко // Вісник Львівського державного аграрного університету. - Львів, 2007. - С. 125-131.

5. Борисов В.М. Вплив дії малих генів на розщеплення у зворотних схрещуваннях кукурудзи з молдавським типом ЦЧС / В.М. Борисов, *О.М. Тарасенко // Вісник Дніпропетровського державного аграрного університету, 2008. - №2. - С. 43-46 (Доля участі здобувача - 70%, особистий внесок: проведення польових та лабораторних досліджень, узагальнення даних).

6. Гонтаровский В.А. Гаметофитное расщепление гетерозигот по гену Rf₃ в цитоплазме молдавского типа ЦМС / В.А. Гонтаровский, *О.Н. Тарасенко // Фактори експериментальної еволюції організмів. - К.: Аграрна наука, 2003. - С. 137-142 (Доля участі здобувача - 50%, особистий внесок: проведення польових та лабораторних досліджень, узагальнення даних).

7. *Карпенко О.М. Поведінка самозапилених ліній кукурудзи, їх цитостерильних аналогів та аналогів-відновлювачів в умовах сильної посухи / О.М. Карпенко // Наукові проблеми виробництва зерна в Україні та сучасні методи їх вирішення: Тези всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених і спеціалістів (10-11 лютого 2000 р.). - Дніпропетровськ: Інститут зернового господарства УААН, 2000. - С. 62-63.

8. *Тарасенко О.М. Модифікаційна мінливість інбредних ліній кукурудзи та їх цитостерильних аналогів у різних кліматичних умовах / О.М. Тарасенко // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених і спеціалістів з проблем зерна в Україні (5-6 березня 2002 р.). - Дніпропетровськ: Інститут зернового господарства УААН, 2002. - С. 59.

9. *Тарасенко О.М. Взаємодія малих генів у rf₃-рецесивних генотипах кукурудзи з молдавським типом ЦЧС / О.М. Тарасенко // Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання: Тези доповідей міжнародної науково-практичної конференції (29 червня - 1 липня 2005 р.). - Оброшино: Інститут землеробства і тваринництва західного регіону УААН, 2005. - С. 185-186.

10. *Тарасенко О.М. Вплив навколишнього середовища на цвітіння інбредної кукурудзи / О.М. Тарасенко, В.В. Борисова, Ю.В. Лихолат // Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології: Тези наукової конференції молодих учених (1-3 грудня, 2005 р.). - Ужгород: Ужгородський національний університет, 2005. - С. 116-117 (Доля участі здобувача - 50%, особистий внесок: проведення польових та лабораторних досліджень, узагальнення даних).

11. *Tarasenko O.M. The fertility of S type CMS maize backcrosses / O.M. Tarasenko // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: Proceeding of the III international young scientist's conference (15-18 may, 2007). - Odesa: Pechatniy dom, 2007. - P.227.

Размещено на Allbest.ru