Біотехнологія Т-2 токсину та обґрунтування максимально допустимого рівня його в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Біотехнологія Т-2 токсину та обґрунтування максимально допустимого рівня його в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед багатьох чинників навколишнього природного середовища, які забруднюють корми та продукти харчування, особливе місце займають мікотоксини, що становлять загрозу для організму тварин і людей. Це обумовлюється повсюдним поширенням грибів у природі, які за сприятливих умов (підвищення вологості й температури) уражують корми, продукти харчування, промислову сировину та продукують мікотоксини. Споживання кормів і продуктів харчування, контамінованих мікотоксинами, призводить до отруєння тварин та людей. Навіть невеликі концентрації мікотоксинів у кормах за довгострокового надходження до організму знижують імунітет тварин, впливають на метаболічні процеси, викликають дермальні та нервові патології, спричиняють канцерогенну, гонадо - та ембріотоксичну дії (Білай В.Й., Підоплічко М.М., 1970; Рухляда В.В., 1982; Труфанова В.О., 1984; Зайченко О.М., 1985; Ображей А.Ф., 1997; Котик А.М., 1999; Коцюмбас І.Я., 2001; Сахацький І.М., 2001).

До найпоширеніших належать гриби роду Fusarium, що здатні продукувати велику кількість мікотоксинів, у тому числі більш як 150 трихотеценових (Монастирський О.А., 2001). Серед трихотеценових мікотоксинів за частотою виявлення й токсичністю виділяється Т-2 токсин. Зернові корми України досить часто уражуються грибами роду Fusarium, здатними біосинтезувати Т-2 токсин. Недостатній контроль за якістю продукції через відсутність надійних, високочутливих методів визначення мікотоксинів, порушення технологій вирощування, збирання та зберігання кормів не дають змоги запобігти отруєнню тварин і сприяють виникненню мікотоксикозів. Дослідженнями останніх двох десятиліть встановлено хімічну структуру Т-2 токсину, вивчено фізико-хімічні властивості, а також окремі аспекти його токсичної дії на організм тварин. Не повністю з'ясовані умови виникнення токсикозу, не визначена чутливість різних видів тварин до цього токсину, не встановлені його максимально допустимі рівні (МДР) у кормах для різних видів тварин. Досконально не вивчено механізми накопичення в організмі та шляхи виділення Т-2 токсину.

Для вивчення зазначених питань та забезпечення проведення лабораторних досліджень біологічних субстратів біотехнологія виробництва Т-2 токсину потребує доопрацювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалася згідно з планом наукових робіт Інституту ветеринарної медицини УААН за темами: 051.09; 08.09.01.Д1. «Разработать и выдать Госагропрому СССР усовершенствованные методы микологической оценки кормов и повышения их санитарного качества» (реєстраційний №ДР0187.0.086198); 03.06.03/005-92 «Розробити технології виробництва та контролю нових стандартів мікотоксинів, уніфіковані методи їх виявлення в кормах і продуктах харчування, розробити нову систему санітарно-мікологічних досліджень кормів» (реєстраційний №ДР U0111476); 06.01 «Теоретично та експериментально обґрунтувати максимально допустимі рівні (МДР) особливо небезпечних мікотоксинів у кормах для тварин і розробити засоби діагностики, лікування та профілактики токсикозів» (реєстраційний №ДР0197U012762); 12.03 «Розробити систему (методи та періодичність) контролю сільськогосподарської сировини на наявність мікотоксинів з метою забезпечення заходів профілактики та сертифікації» (реєстраційний №ДР 0101U000792).

Мета роботи та завдання досліджень. Метою роботи було розроблення досконалішої біотехнології виробництва Т-2 токсину та встановлення МДР мікотоксину у кормах для молодняку великої рогатої худоби (ВРХ) на відгодівлі. Для її досягнення поставлені такі завдання:

§ вивчити поширення грибів роду Fusarium на кормах і підібрати високопродуктивний продуцент Т-2 токсину;

§ створити оптимальні умови для культивування гриба-продуцента з метою максимального біосинтезу Т-2 токсину;

§ відпрацювати ефективнішу схему біотехнології виробництва Т-2 токсину;

§ розробити методи екстрагування, очищення, кристалізації та ідентифікації Т-2 токсину;

§ дослідити чутливість телят до Т-2 токсину й особливості клініко-морфологічного прояву гострого і хронічного перебігу експериментального Т-2 токсикозу;

§ вивчити кумулятивні властивості Т-2 токсину в організмі телят;

§ теоретично та експериментально обґрунтувати максимально допустимий рівень Т-2 токсину в кормах для молодняку на відгодівлі.

Об'єкт дослідження: проблеми контамінації кормів Т-2 токсином, біотехнологія Т-2 токсину, гострий і хронічний Т-2 токсикози, МДР Т-2 токсину для молодняку ВРХ на відгодівлі.

Предмет дослідження: біотехнологія Т-2 токсину, розробка параметрів регламентування Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі.

Методи дослідження:

* мікологічні - комплекс методів, які застосовуються з метою виділення або ідентифікації грибів у досліджуваному матеріалі;

* мікотоксикологічні - методи, що використовуються для визначення токсинів грибів;

* клінічні - аналіз морфологічного складу крові (кількість еритроцитів, лейкоцитів, лейкограма) та біохімічні аналізи крові (гемоглобін, загальний білок);

* математично-статистичний аналіз з метою обґрунтування кількісної оцінки отриманих експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено поширення грибів роду Fusarium у кормах на території України, підібрано високотоксикогенний гриб - продуцент Т-2 токсину, експериментально встановлено оптимальні умови для його культивування з метою максимального біосинтезу Т-2 токсину й розроблено біотехнологію виробництва цього мікотоксину. Вивчено чутливість молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі до Т-2 токсину за експериментального гострого та хронічного токсикозу. Вперше одержано дані щодо кумуляції Т-2 токсину в організмі телят і визначено максимально недіючу, підпорогову і порогову дози Т-2 токсину в хронічному досліді. Вперше теоретично та експериментально обґрунтовано МДР Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі.

Практичне значення одержаних результатів полягає у вивченні поширення мікроміцетів на зернових субстратах України, розробці біотехнології виробництва Т-2 токсину, на основі якої розроблено нормативну документацію на виробництво Т-2 токсину (ТУУ-46.15.035-94), інструкцію з виготовлення та контролю якості й настанову щодо застосування). Налагоджено експериментальне виробництво цього мікотоксину для потреб діагностичних лабораторій різних галузей. Т-2 токсин зареєстровано та затверджено Державним департаментом ветеринарної медицини Мінагрополітики України (реєстраційне посвід-чення №1140-13-004-05 від 30.06.2005 р.).

Дані про чутливість телят різних вікових груп до Т-2 токсину, матеріали гострого й хронічного Т-2 токсикозу телят, дані щодо кумуляції Т-2 токсину в організмі тварин та експериментальне обґрунтування МДР токсину в кормах дадуть змогу практичним фахівцям своєчасно профілактувати випадки отруєння тварин і кваліфіковано використовувати корми, контаміновані Т-2 токсином.

Матеріали обґрунтування МДР Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі використані в «Методичних вказівках по санітарно-мікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів», затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України (№15-14/73 від 06.03.1998 р.).

Результати дослідів, проведених щодо вивчення розповсюдження мікроміцетів, використані в методичних вказівках «Система контролю сільськогосподарської сировини на наявність мікотоксинів», затвердженої Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України 19.10.2005 р.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснювала пошук і аналіз літературних даних, підбір необхідних біотехнологічних методів досліджень та груп тварин, виконала весь обсяг експериментальних, клінічних і лабораторних досліджень, проаналізувала й узагальнила одержані результати. Аналіз та інтерпретацію результатів, написання статей і дисертації проведено під керівництвом наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені в дисертації, доповідалися й одержали загальне схвалення на засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини УААН в 1995-2005 рр., а також на науково-практичних конференціях: «Неінфекційна патологія тварин» - м. Біла Цер-ква, 1995 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва» - м. Львів, 1997 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Проблеми інфекційної патології тварин» - АР Крим, м. Новий Світ, 2001 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Ветеринарна медицина-2004» - м. Київ, 2004 р.; науково-практичній конференції «Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів» - м. Харків, 2004 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Ветеринарна медицина-2005» - м. Київ, 2005 р.; науково-практичній конференції, присвяченій 90-й річниці від дня народження І.М. Гладенка» - м. Харків, 2005 р.

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 17 наукових працях, у тому числі: у 4 статтях - у фахових виданнях, 4-х тезах доповідей конференцій та 2-х методичних вказівках, реєстраційному посвідченні, рацпропозиції та нормативно-технічній документації (ТУ, настанова щодо застосування та інструкція з виготовлення).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: перелік умовних скорочень, вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, обговорення результатів, висновки, пропозиції виробництву, список використаних джерел, додатки. Робота викладена на 81 сторінці комп'ютерного тексту. В ній наведено 28 таблиць, подано шість рисунків і вісім додатків. До списку літератури входять 235 джерел, у тому числі 101 іноземною мовою.

Основний зміст роботи

Робота виконувалася в лабораторії мікотоксикології Інституту ветеринарної медицини УААН протягом 1987-2004 рр. У дослідах з вивчення дії Т-2 токсину на тваринах було використано 51 голову молодняку великої рогатої худоби чорно-рябої породи. Дослід проводили згідно зі схемою (рис. 1).

Матеріалом мікологічних досліджень були 485 проб кормів, які надходили із сільгосппідприємств різних типів і різних областей України: Дніпропетровської, Донецької, Житомирської, Київської, Сумської, Черкаської та Чернігівської в період збирання й зберігання. Зразки середніх проб відбирали відповідно до діючих державних стандартів (ГОСТ 13586, 3 - 83). Гриби з відібраних зразків виділяли методом серійних розведень суспензій подрібнених на млинку кормів. Для цього наважку подрібненого корму масою 10 г. заливали до 100 мл стерильною водою і струшували протягом 15-20 хв. З одержаної суміші готували послідовні розведення у пробірках 1:1000 та 1: 10 000 і висівали на агаризоване середовище Чапека та Сабуро по 0,1 см³ суспензії. Крім того, гриби виділяли методом розкладання зерен і шматочків корму на агаризоване середовище Чапека в чашках Петрі.

Мікроміцети ідентифікували за визначниками Д.К. Зерова (1971), М.М. Підоплічка (1977), М.С. Даньшина (1985) і Д. Саттона зі співавторами (2001).

Токсичність культуральних рідин ізольованих грибів визначали, вивчаючи їхню дію на тест-мікроорганізм Tetrachimena piriformis. Токсичні та слаботоксичні ізоляти грибів роду Fusarium перевіряли на здатність утворювати Т-2 токсин за розробленим нами експрес-методом. Вміст Т-2 токсину в культурах грибів визначали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ). Для цього штам гриба, вирощений на твердому живильному середовищі Чапека, екстрагували 10 см³ етилацетату. Одержані екстракти упарювали й наносили на хроматографічну пластину в кількості 10-20 мкл. Пластини хроматографували у системі розчинників толуол-етилацетат-мурашина кислота в об'ємному співвідношенні 5:4:1. Для виявлення Т-2 токсину пластини обробляли 20%-ним спиртовим розчином H₂SO₄ з послідовним нагріванням за температури 130°С протягом 3 хв та продивлялися в УФ-променях із довжиною хвилі 254 і 365 нм.

У початкових дослідах використовували Т-2 токсин, одержаний у лабораторії мікотоксикології за ТУ-10-07.77-91 з використанням культури гриба-продуцента Fusarium sporotrichiella var. poae Bilai штам 407/4, переданої нам доктором ветеринарних наук В.В. Рухлядою (Кіровоградський відділ незаразних хвороб Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН).

З метою підбору оптимального субстрату для культивування гриба-продуцента, а також для забезпечення максимального нагромадження ним мікотоксину використовували зерно проса, жита, кукурудзи, рису, суміші рис-просо (у співвідношенні 1:1) та рис-жито (1:1). Посіви гриба на різних видах зерна інкубували за температури 24 єС протягом семи і 14 діб у холодильнику за температури 4 єС.

Для визначення оптимального рівня вологості зернового субстрату, придатного для максимального нагромадження ним мікотоксину, гриб-продуцент культивували на просі, житі, кукурудзі, рисі, суміші рису з просом у співвідношенні 1:1 за вологості від 20 до 80%. Культивування здійснювали в термостаті за температури 24 єС упродовж семи діб і у подальшому витримуванні протягом 14 діб у холодильнику за температури 4 єС.

У процесі вивчення основного температурного режиму культивування грибами проведено два досліди на зерні жита та рису. Один дослід відбувався за температури 24 єС упродовж семи днів, а потім за температури 4, 10, 24 і 37 єС протягом 14 днів, а другий - за постійної температури 4, 10, 24 та 37 єС протягом 21 доби.

Для одержання необхідної кількості Т-2 токсину була розроблена принципово нова і досконаліша біотехнологія його виробництва. Гриб-продуцент культивували на зерні жита за температури 24 єС протягом семи діб, а потім за температури 4 єС - протягом місяця. Для екстракції мікотоксину з культури гриба-продуцента використовували етилацетат, а не ацетон. При цьому виявлено, що рівень токсину в екстрактах не знижується, але значно зменшується кількість коекстрактивних речовин.

У процесі розробки методу виділення Т-2 токсину нами було застосовано ряд методичних підходів загального характеру. Ми намагалися максимально уніфікувати окремі етапи ізоляції та очищення цього мікотоксину. Насамперед, це стосувалося етапів знежирювання, депротеїнізації й депігментації препарату сирцю. Для очищення і фракціонування мікотоксину застосовували метод колонкової хроматографії. Як тверду фазу використовували силікагель марки «L» (Чехія) та окис алюмінію для хроматографії за ТУ-6-09-3916-75.

Фракціонування здійснювали згідно з методом ступеневого елюювання органічними розчинниками чи їхніми сумішами у порядку зростання полярності. ТШХ виконували на силуфолових пластинках «Silufol» 254 та 365 (Чехія). Ідентифікацію отриманого кристалічного токсину проводили відповідно до «Методических указаний по обнаружению, идентификации и определению Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье», затверджених заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 29.12.1984 р.

Вміст Т-2 токсину в культурах грибів та патологічному матеріалі визначали згідно з «Методикой определения микотоксина Т-2 в зернофураже», затвердженою ГУВ МСГ СРСР 28.03.1980 р. і «Методическими указаниями по количественному определению Т-2 токсина в зерне и комбикормах», затвердженими Держагропромом СРСР 26.05.1987 р.

Гостру токсичну дію Т-2 токсину досліджували на семи телятах 2-3,5 - місячного віку, яким через зонд одноразово давали Т-2 токсин у дозі 3 мг/кг живої маси у вигляді розчину на 20-ному% етанолі з водопровідною водою.

Кумуляцію Т-2 токсину вивчали на десяти телятах 6-місячного віку. Дослідним тваринам щоденно, протягом 30 днів, через зонд давали Т-2 токсин у вигляді 0,5%-ного спиртового розчину в дозі 1/10 LD₅₀ (гострої) - 0,323 мг/кг живої маси. Телят перед дослідом і під час досліду клінічно обстежували. Коефіцієнт кумуляції (Кк) вираховували поділом сумарної дози Т-2 токсину, яку давали тваринам протягом 30 днів, на LD₅₀ (гостру) за одноразового введення токсину.

Досліди щодо вивчення хронічної дії Т-2 токсину проводили на 24-х телятах 3-місячного віку чорно-рябої породи, які за принципом аналогів були розподілені на чотири групи по п'ять голів й одну - чотири голови. Молодняку чотирьох груп згодовували Т-2 токсин відповідно у кількості 1,6; 3,2; 6,4 та 12,8 мг/кг комбікорму. Дослід тривав 98 діб.

Для заключного обґрунтування МДР Т-2 токсину в кормах провели дослід на десяти телятах, розподілених на дві групи по п'ять голів. Тваринам протягом 92-х діб згодовували комбікорм, в який додавали зерно жита, уражене грибом Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4. Вміст Т-2 токсину в загальному добовому раціоні становив 0,25 мг/кг корму. Під час досліду телят регулярно обстежували й зважували на 30-ту, 67-му та 92-гу добу. В ці ж терміни брали і досліджували кров тварин.

По закінченні досліду проводили контрольний забій молодняку. Внутрішні органи зважували для виведення вагових коефіцієнтів. Одержані результати експериментальних досліджень статистично опрацьовували за методом І.О. Ойвіна з виведенням середньоарифметичної величини (M), середньоарифметичної похибки (m) та ступеня вірогідності відмінностей (р). Цифрові величини виражали в системі СІ.

Результати досліджень та їх аналіз

Вивчення поширення грибів роду Fusarium на кормах і пошук токсикогенних продуцентів. Під час проведення моніторингових досліджень кормів, які надходили з різних сільгосппідприємств та різних регіонів України на наявність грибів-продуцентів мікотоксинів, було встановлено, що мікобіота кормів досить різноманітна і в основному представлена різними видами мікроміцетів родів Fusarium (26%), Aspergillіus (21,5), Penicillium (18), Alternaria (12) та інші (22,5%).

Гриби роду Fusarium, серед яких виявлено багато продуцентів Т-2 токсину, найчастіше виділялися з кормів Київської та Сумської областей. Їх знаходили в 63 зразках різних кормів, що становить 26%. Найбільше штамів було виділено із пшениці, кормосумішей, комбікорму та ячменю, менше висівали їх із кукурудзи, жита, шроту соняшникового і зовсім не виявляли у сінажі, силосі та трав'яному борошні.

У процесі токсикологічних досліджень було виявлено десять високотоксичних ізолятів потенційних продуцентів Т-2 токсину.

Під час підбору найактивнішого гриба-продуцента Т-2 токсину використовували десять штамів і відомий раніше продуцент Т-2 токсину, наданий профе-сором В.В Рухлядою, які забезпечували найбільшу токсичну дію на тест-об'єкт

Тетрахімена піріформіс. Гриби культивували на зерні жита й проса протягом семи діб у термостаті за температури 24 єС та 14 днів у холодильнику за температури 4 єС. У результаті було виявлено, що найкращий біосинтез Т-2 токсину давав Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4, усі інші були менш активними.

Розробка біотехнології культивування гриба-продуцента з метою максимального біосинтезу Т-2 токсину. Попереднім дослідженням було встановлено, що біосинтез Т-2 токсину залежить від токсичності гриба-продуцента, умов його культивування, виду субстрату, температури, вологості та часу його культивування.

Під час вивчення біосинтезу Т-2 токсину на стерильних зернових субстратах встановлено, що гриб Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4 продукував Т-2 токсин на всіх досліджуваних зернових субстратах (табл. 2).

Таблиця 1. Інтенсивність накопичення Т-2 токсину грибами роду Fusarium, мг/кг

Таблиця 2. Біосинтез Т-2 токсину Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4 під час культивування на різних зернових субстратах, мг/кг

Найкращий біосинтез реєстрували на зерні жита, рису, а найменша кількість токсину утворювалася на суміші зерна рис: просо та на кукурудзі.

З літературних публікацій відомо, що види грибів секції Sporotrichiella більш інтенсивно продукують Т-2 токсин, коли культивують спочатку за оптимальної температури росту гриба (25°С), а потім пониженій. Водночас встановлено (В.В. Рухляда, 1989 р.), що більш активне токсиноутворення відбувається під час культивування грибів лише за низької температури (4°С). Тому було вирішено поставити два досліди: один із постійними температурами, а інший зі змінними параметрами.

У процесі вивчення впливу температури на біосинтез Т-2 токсину встановлено, що культивування посівів за постійно низьких температур сприяло накопиченню Т-2 токсину в усіх зернових субстратах. Так, температура 4°С була оптимальною для зерна рису та жита.

Спостерігалась закономірність біосинтезу токсину, коли посіви вирощували за температури 24°С, а потім за температури 4°С. Підвищена температура в початковий період сприяла утворенню великої міцеліальної маси гриба, що давало можливість продукувати більше токсину за короткий проміжок часу. Максимальну кількість Т-2 токсину Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4 продукував на зерні жита (табл. 3).

Таблиця 3. Біосинтез Т-2 токсину грибом Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4 за різних температур, мг/кг

Одним з основних факторів, який впливає на біосинтез, як відомо з історії, є вологість.

Під час вивчення впливу вологості штам Fusarium sporotrichiella var. poaе штам 407/4 вирощували на п'яти зернових субстратах різної вологості (табл. 4).

Таблиця 4. Біосинтез Т-2 токсину грибом Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4 за різної вологості зернових субстратів, мг/кг

Дослідженнями встановлено, що оптимальна вологість зерна для біосинтезу Т-2 токсину становила 70% і максимальна кількість токсину накопичувалась на зерні жита та рису. За відсоткової вологості 60% токсиноутворення знижувалося на всіх видах зерна, крім проса, а за вологості 50% - погіршувалося ще більшою мірою і значно зменшилось за 40-20-відсоткової вологості. Отже, вологість субстрату 70% була оптимальною для біосинтезу Т-2 токсину цим грибом.

З метою вивчення терміну культивування гриба-продуцента було досліджено два субстрати - рис і жито в різних умовах вирощування (табл. 5).

Таблиця 5. Біосинтез Т-2 токсину грибом Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4 на зерні жита і рису під час культивування в різних режимах інкубування та різних термінів

У результаті проведених досліджень було встановлено, що гриб-продуцент Fusarium sporotrichiella var.poae Bilai штам 407/4 найкраще біосинтезував Т-2 токсин (4,2 г/кг) на зерні жита під час культивування його протягом семи діб за температури 24 єС з подальшим витримуванням упродовж 30 діб у холодильнику за температури 4 єС.

Розробка методів екстрагування, очищення та кристалізації. Одним з основних етапів біотехнології виробництва Т-2 токсину є його екстрагування, очищення та кристалізація.

Екстракцію Т-2 токсину з культури гриба тричі проводили етилацетатом, що значно зменшує кількість коекстрактивних речовин. Екстракт упарювали на ротаційному випарювачі за температури 45-50°С. Відомо, що використання для культивування грибів зернових субстратів суттєво підвищує продукцію мікотоксинів, але й такою мірою ускладнює їх очищення через присутність значних ліпідних компонентів, білкових та пігментних речовин. Депротеїнізацію здійснювали 10%-ним розчином оцтового свинцю, що забезпечувало часткове очищення.

Депігментацію розчину проводили, застосовуючи активоване вугілля БАВ-1 у полярній системі етанолу, що сприяло ефективнішому хроматографічному розподілу мікотоксинів на колонці. Елюювання з хроматографічної колонки, заповненої окисом алюмінію, із внесенням сухого екстракту токсину здійснювали гексаном, сумішшю гексан: бензол (1:1) і бензолом. Об'єднані та випарувані фракції перевіряли на наявність Т-2 токсину й кристалізували в розчині гексану та ацетону.

Т-2 токсин одержували у вигляді безбарвних голчастих кристалів, добре розчинних в ацетоні, хлороформі, етилацетаті й етанолі. На пластинах «Силуфол» після хроматографування у системі розчинників етилацетат-толуол в об'ємному співвідношенні 3:1 й обробки 20%-ним спиртовим розчином сірчаної кислоти і прогрівання в сушильній шафі за температури 110 єС протягом 3 хв. Т-2 токсин за кімнатного освітлення виявлявся у вигляді темно-сірої плями з Rf 0,42, а під час проявлення в УФ-світлі з довжиною хвилі 365 нм - у вигляді блакитної флуоресціюючої плями.

Ефективним хромогенним реагентом виявився с-анісовий ангідрид, обробка яким силуфолових пластин із подальшим прогріванням за температури 100-130 єС призводить до утворення пурпурово-червоних плям токсину. На пластинах «Силуфол» після хроматографування токсину в системі етилацетат-толуол (3:1) та біоавтографічного проявлення за допомогою Candida pseudotropicalis штам 44 ПК установлено, що концентрація Т-2 токсину 0,1 мкг давала зону пригнічення росту тест-культури діаметром 10 мм, з Rf 0,42. Температура плавлення Т-2 токсину - 149-152 єС. Проведені дослідження показали, що одержана кристалічна речовина за фізико-хімічними властивостями і за даними ІЧ-спектро-метрії відповідає Т-2 токсину.

Вивчення гострої токсичної дії на телят. Під час вивчення гострої токсичності Т-2 токсину в досліді на телятах установлено, що одноразове пероральне введення його в дозах 3 мг/кг живої маси спричиняє гострий токсикоз. Перші клінічні ознаки гострого отруєння (відсутність апетиту та пригнічення) реєстрували через 5-8 год після введення Т-2 токсину. Через добу клінічні ознаки посилювалися: відмічали тремтіння мязів задніх кінцівок, часте дихання, незначну атонію рубця і часте сечовиділення. На другу-третю добу в усіх тварин апетит нормалізувався, а на п'яту спостерігалося тільки часте сечовиділення. Протягом досліду жива маса зменшилася у двох телят. У крові виявлено зниження рівня еритроцитів (Р>0,2), гемоглобіну (Р>0,05) та лейкоцитів (Р>0,01), а також загального білка в сироватці крові (Р>0,2).

Через п'ять діб після одноразового введення Т-2 токсину вміст гемоглобіну в крові дещо нормалізувався, зменшилася кількість лейкоцитів, знизився рівень загального білка. Таким чином, Т-2 токсин в одноразовій дозі 3 мг/кг живої маси виявився сильнодіючою речовиною на організм телят.

Вивчення кумулятивних властивостей Т-2 токсину в організмі телят. Дослідженням кумулятивних властивостей Т-2 токсину доведено, що токсин у дозі 0,323 мг/кг живої маси, який давали телятам один раз на добу протягом 30 днів, викликав у них слабовиражене хронічне отруєння. Хронічний Т-2 токсикоз під час згодовування молодняку токсину в зазначеній дозі проявлявся відсутністю чітко виражених клінічних ознак токсикозу, малою рухливістю, пригніченням тварин та зменшенням живої маси.

У дослідних телят, забитих через добу після останнього введення Т-2 токсину, виявляли катаральне запалення слизової оболонки рубця біля входу в стравохід, катаральне запалення з незначними крововиливами слизової оболонки сичуга.

Отже, за результатами досліду можна зробити висновок про те, що Т-2 токсин належить до речовин, які мають слабкі кумулятивні властивості, коефіцієнт кумуляції становить 3 одиниці. Сумарна доза Т-2 токсину 9,69 мг/кг живої маси, що дорівнювала 3 LD₅₀ гострої, викликала у телят слабовиражені клінічні та патологоанатомічні зміни.

Вивчення хронічної токсичної дії Т-2 токсину. Щоденне згодовування телятам комбікорму з Т-2 токсином у кількості 1,6 і 3,2 мг/кг комбікорму не викликало у них будь-яких проявів отруєння. Тварини дослідних груп, які поїдали корм з Т-2 токсином, були рухливі, за ростом та розвитком не відрізнялися від контрольних, мали гарний волосяний покрив. У них не відмічали пошкодження слизових оболонок губ і ротової порожнини. Під час гематологічних дослід-жень не виявляли достовірних змін у дослідних телят.

Т-2 токсин у дозі 6,4 мг/кг комбікорму викликав у тварин не чітко виражені клінічні ознаки отруєння. Телята добре поїдали корм, були активними та рухливими. Лише в одного теляти спостерігали затримку линьки, а у другого під кінець досліду - слизові виділення з носових ходів. Тварини відставали в рості та розвитку порівняно з контрольними, у них знижувалися середньодобові прирости маси тіла (Р>0,02). Під час гематологічних досліджень було виявлено недостовірне зниження вмісту гемоглобіну і білка в сироватці крові.

У телят, які одержували комбікорм, що містив Т-2 токсин у кількості 12,8 мг/кг, відмічали ознаки, характерні для хронічного Т-2 токсикозу. Молодняк протягом місяця досліду добре споживав корм із Т-2 токсином, але через півтора місяці у деяких тварин реєстрували слизові виділення з носових ходів. Через два місяці спостерігали некрози на слизових оболонках початкових відділів носових ходів та на внутрішній частині губ. У двох телят, які залишилися живими, були окремі виразки в носових ходах та на губах і затримка линьки. Троє телят із цієї групи загинули на 14-, 24 - та 60-ту добу від початку досліду. В усіх зазначених тварин під час патологоанатомічного розтину зареєстровано гнійно-фібринозну бронхопневмонію. При цьому не відмічали ніяких змін у травному каналі та інших органах. Причину загибелі телят не можна повністю пояснити згодовуванням їм Т-2 токсину, але є підозра, що Т-2 токсин призвів до виникнення бронхопневмонії внаслідок зниження резистентності організму тварин, особливо до появи в легенях некрозів, які сприяли проникненню інфекції.

Таким чином, вивчення чутливості телят до Т-2 токсину в хронічних дослідах тривалістю 98 діб показало, що Т-2 токсин в дозі 1,6 та 3,2 мг/кг на добу на одну голову у разі при концентрації Т-2 токсину в середньодобовому раціоні 0,27-0,4 та 0,53-0,8 мг/кг не викликав у телят токсичної дії.

Максимально недіюча концентрація Т-2 токсину в кормах для молодняку ВРХ лежить у межах від 0,53 до 0,8 мг/кг корму.

Концентрація Т-2 токсину в кормі для молодняку ВРХ від 1,07 до 1,6 мг/кг знаходиться в межах підпорогової токсичної за тривалого згодовування, оскільки Т-2 токсин у цій концентрації викликав нечітко виражені зміни.

Концентрація Т-2 токсину в кормі для молодняку ВРХ від 2,13 до 3,2 мг/кг знаходилась у межах порогової токсичної за тривалого згодовування, оскільки Т-2 токсин у цій концентрації викликав виражені зміни.

Підвищення дози токсину до 6,4 та 12,8 мг/добу супроводжувалося хронічним отруєнням з більш вираженою клінічною картиною захворювання, змінами в крові у патологоанатомічній картині.

Виходячи з результатів проведених досліджень, максимально допустима добова доза Т-2 токсину для телят за тривалого згодовування дорівнювала 3,2 мг/голову. Максимально допустима кількість Т-2 токсину в кормах дорівнює 0,53 мг/кг корму. Однак, враховуючи «Временные методические указания по разработке ДОК пестицидов в кормах для сельскохозяйственных животных», затверджені ГУВ МСГ СРСР 2.08.1972 р., для телят цю дозу необхідно зменшити в два рази (коефіцієнт безпеки). Зважаючи на це, допустима добова доза токсину на одну голову - 1,6 мг/кг. Отже, гранично допустима концентрація Т-2 токсину в кормах для телят без врахування результатів гістологічних досліджень та досліджень на залишкові кількості Т-2 токсину і його метаболітів в органах і тканинах дорівнює 0,265 мг/кг корму.

Визначення МДР Т-2 токсину в кормах для телят та великої рогатої худоби на відгодівлі. Для визначення МДР Т-2 токсину в кормах був проведений дослід з метою вивчення дії на молодняк великої рогатої худоби на відгодівлі корму з вмістом Т-2 токсину в кількості, яка відповідала МДР. Телятам протягом 92-х діб згодовували комбікорм, що містив жито, уражене грибом-продуцентом Т-2 токсину, концентрація Т-2 токсину в комбікормі становила 1,6 мг токсину на 1 кг комбікорму. Рівень Т-2 токсину в середньодобовому раціоні сягав близько 0,25 мг/кг корму. Загальний стан телят протягом усього досліду нічим не відрізнявся від контрольних. На основі цього встановлено, що молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі можна згодовувати корми, які містять Т-2 токсин у кількості 0,25 мг/кг корму.

Висновки

У дисертації на основі проведених досліджень вивчено склад мікобіоти різних кормів і виявлено гриби-продуценти Т-2 токсину. Підібрано високотоксигенний штам-продуцент Т-2 токсину та експериментально обгрунтовано оптимальні умови його культивування для забезпечення максимального токсиноутворення. Розроблено принципово нову біотехнологію одержання й очищення Т-2 токсину, що дало можливість вивчити експериментально гострий та хронічний перебіг Т-2 токсикозу, кумуляцію в організмі телят, а також обґрунтувати МДР Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі.

1. Мікологічними дослідженнями встановлено, що корми з різних областей України засмічені мікроскопічними грибами родів: Fusarium (26%), Aspergillus (21,5), Penicillium (18), Alternaria (12%) та ін.

2. Серед 63 виділених грибів роду Fusarium виявлено 26% ізолятів, здатних продукувати Т-2 токсин у кількостях від 125 до 470 мг/кг біологічного субстрату.

3. Доведено, що найактивнішим продуцентом Т-2 токсину є гриб Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4. Експериментально обґрунтовано, що культивування його на житі вологістю 70% за температури 24°С протягом семи діб із подальшим 30-денним витримуванням у холодильнику за температури 4°С забезпечує максимальний біосинтез Т-2 токсину.

4. Розроблено принципово нову біотехнологію одержання Т-2 токсину, яка включає культивування високотоксигенного гриба-продуцента Fusarium sporotrichiella var.poaе штам 407/4 в оптимальних для біосинтезу умовах, екстрагування етилацетатом, депротеїнізацію, депігментацію, дегідратацію етилацетатного розчину, елюювання на хроматографічній колонці окису алюмінію гексаном, сумішшю гексан-бензол, бензолом та кристалізацію з ацетонового розчину з додаванням гексану.

5. Підтверджено, що біосинтезований Т-2 токсин є високотоксичною речовиною для молодняку великої рогатої худоби. Вперше встановлено, що він слабко кумулюється в організмі телят (Кк<3).

6. Визначено чутливість молодняку великої рогатої худоби до Т-2 токсину за довгострокового згодовування. Максимально недіюча, підпорогова та порогова (хронічна) концентрації Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі відповідно становили: 0,53-0,8; 1,07-1,6; 2,13-3,2 мг/кг корму. Максимально допустима добова доза очищеного Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі дорівнювала 0,53 мг/кг корму.

7. Експериментально обґрунтовано МДР Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби на відгодівлі - 0,25 мг/кг.

Пропозиції виробництву

1. На основі результатів дисертаційної роботи розроблено нормативно-технічну документацію на виробництво Т-2 токсину (технічні умови «ТУУ-46.15.035-94» та «Настанову по застосуванню Т-2 токсину при мікологічних дослідженнях», затверджені Головним управлінням ветеринарної медицини з Держветінспекцією від 9 червня 1994 р., «Інструкцію по виготовленню Т-2 токсину для мікологічних досліджень», затверджену ІВМ УААН 10.08.2005 р.).

2. В Інституті ветеринарної медицини УААН, на основі розробленої нормативно-технічної документації налагоджено виробництво Т-2 токсину для забезпечення діагностичних потреб лабораторій ветеринарної медицини різних рівнів, лабораторій харчової та комбікормової промисловості, лабораторій системи охорони здоров'я та інших науково-дослідних установ. Т-2 токсин зареєстровано в Україні. Реєстраційне посвідчення на Токсин-Т-2 №1138-13-004-05, затверджене Державним департаментом ветеринарної медицини України і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок 30.06.2005 р.

3. Матеріали дисертаційної роботи щодо обґрунтування МДР Т-2 токсину в кормах для молодняку великої рогатої худоби використані в «Методичних вказівках по санітарно-мікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів», затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України (№15-14-73 від 06.03.1998 р.).

4. Результати моніторингових досліджень кормів на наявність грибів-продуцентів використані у методичних вказівках «Система контролю сільськогосподарської сировини на наявність мікотоксинів», затверджених Державним Департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України 19.10.2005 р.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Васянович О.М., Ображей А.Ф. Дія Т-2 токсину на організм телят в хронічному досліді // Наук. вісн. НАУ. - К., 2001. - №36.-С. 130-132. (Участь в експериментальних дослід-женнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

2. Васянович О.М., Ображей А.Ф. Вивчення розповсюдження грибів роду Fusarium на кормах // Ветеринарна біотехнологія.-К., 2003. - №3.-С. 14-19. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

3. Васянович О.М., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф. Видова та токсикологічна характеристика мікроміцетів, виділених із кормів для птиці // Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва вет. препаратів: Зб. Міжнар. наук.-практ. конф. «Ветеринарна медицина-2004». - Х., 2004. - С. 354-357. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

4. Васянович О.М. Обґрунтування максимально допустимого рівня (МДР) Т-2 токсину в кормах для телят // Ветеринарна медицина України.-К., 2007. - №3.-С. 30-31.

5. Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Васянович О.М. Моніторинг токсиноутворюючих грибів зернових злаків: Зб. матеріалів Міжнар. наук.-практ. конф. «Ветеринарна медицина-2005, присвяченої 90-й річниці від дня народження І.М. Гладенка. - Х., 2005.-С. 203-207. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

6. Васянович О.М. Удосконалення біотехнології виробництва Т-2 токсину // Ветеринарна біотехнологія. - К., 2006. - №9.-С. 27-30.

7. Ображей А.Ф., Погребняк Л.І., Корзуненко О.Ф., Васянович О.М. Гострий Т-2 токсикоз телят // Неінфекційна патологія тварин: Матеріали наук.-метод. конф. - Біла Церква, 1995. - С. 214-215. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

8. Васянович О.М., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Погребняк Л.І. Гострий Т-2 токсикоз телят // Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва: Зб. матеріалів Міжнар. наук.-практ. конф. - Л., 1997. - С. 37-39. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

9. Васянович О.М., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Погребняк Л.І. Кумуляція Т-2 токсину: Там же. - С. 39 - 40. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

10. Васянович О.М., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Погребняк Л.І. Хронічний Т-2 токсикоз телят: Там же. - С. 40-42. (Участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів, підготовка матеріалів до публікації).

11. Погребняк Л.І., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Васянович О.М. та ін. Технічні умови ТУУ -46.15.035-94 Т-2 токсин: Затверджені Головним управлінням ветеринарної медицини з Держветінспекцією від 9 червня 1994 року. - 11 с. (Здобувач на основі проведених досліджень оформила технічні умови на препарат).

12. Погребняк Л.І., Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Васянович О.М. Настанова по застосуванню Т-2 токсину при мікологічних дослідженнях: Затверджена Головним управлінням ветеринарної медицини з Держветінспекцією від 9 червня 1994 року. - 3 с. (Здобувач на основі проведених досліджень оформила настанову щодо застосування).

13. Ображей А.Ф., Корзуненко О.Ф., Васянович О.М. Інструкція по виготовленню Т-2 токсину для мікологічних досліджень: Затверджена директором ІВМ УААН. 10.08.2005 року. - 13 с. (На основі експериментальних досліджень здобувачем розроблено інструкцію з виготовлення Т-2 токсину).

14. Реєстраційне посвідчення на токсин Т-2 №1138-13-004-05: Затверджене Державним департаментом ветеринарної медицини України та ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок 30.06.2005 року.

15. Методичні вказівки по санітарно-мікологічній оцінці та поліпшенню якості кормів / Розробники: А.Ф. Ображей, Л.І. Погребняк, О.Ф. Корзуненко, О.М. Васянович та ін.: Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України

(№15-14-73 від 06.03.1998 р.). - 107 с. (У цих рекомендаціях використані матеріали експериментальних досліджень автора).

16. Система контролю сільськогосподарської сировини на наявність мікотоксинів: Розробники: А.Ф. Ображей, О.Ф. Корзуненко, О.М. Васянович, О.П. Погребняк: Методичні вказівки. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України 19.10.2005 р. - К., 2005. - 27 с. (У цих рекомендаціях використані матеріали експериментальних досліджень автора).

17. Рацпредложение №1. Способ получения Т-2 токсина / Разработчики: А.Ф. Ображей, Л.И. Погребняк, О.Ф. Корзуненко, О.Н. Васянович: Утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ и продовольствия Украины 29.05.1992 г.

Размещено на Allbest.ru