Розробка біотехнологічних методів і використання їх для створення вихідного селекційного матеріалу цикорію коренеплідного (Cichorium intybus L.) та буряків цукрових (Beta vulgaris L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЗЕМЛЕРОБСТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК»

РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ МЕТОДІВ І ВИКОРИСТАННЯ ЇХ ДЛЯ СТВОРЕННЯ ВИХІДНОГО СЕЛЕКЦІЙНОГО МАТЕРІАЛУ ЦИКОРІЮ КОРЕНЕПЛІДНОГО (CICHORIUM INTYBUS L.) ТА БУРЯКІВ ЦУКРОВИХ (BETA VULGARIS L.)

Спеціальність: 06.01.05 - селекція рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук

РЯБОВОЛ ЛЮДМИЛА ОЛЕГІВНА

УДК 631.52:581.143.5:633.63+633.78

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано на кафедрі генетики, селекції рослин і біотехнології Уманського державного аграрного університету Міністерства аграрної політики України протягом 1994-2009 рр.

Науковий консультант: доктор біологічних наук

ПАРІЙ Федір Микитович,

Уманський державний аграрний університет

Міністерства аграрної політики України,

завідувач кафедри генетики, селекції рослин і

біотехнології

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

ГІРКО Володимир Сергійович,

ННЦ «Інститут землеробства УААН»,

завідувач відділу селекції озимої пшениці

доктор біологічних наук

ЛЕВЕНКО Борис Олексійович,

Національний ботанічний сад

ім. М.М. Гришка НАН України,

завідувач лабораторії генетики та біотехнології

відділу нових культур

доктор сільськогосподарських наук, професор

СКОРИК Віктор Варфоломійович,

Носівська селекційно-дослідна станція

Чернігівського інституту АПВ УААН,

завідувач лабораторії селекції озимого жита

Захист дисертації відбудеться « 24 » вересня 2009 року о 10 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 27.361.01 при ННЦ «Інститут землеробства УААН».

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ «Інститут землеробства УААН».

Відгуки на автореферат у двох примірниках, завірені печаткою, просимо надсилати за адресою: 08162, Україна, смт. Чабани Києво-Святошинського району Київської області, ННЦ «Інститут землеробства УААН», вченому секретареві Спеціалізованої вченої ради.

Автореферат розіслано «20» серпня 2009 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Л.О. Кравченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Найважливішою проблемою агропромислового комплексу України на сучасному етапі є збільшення кількості рослинної сировини для одержання в різноманітному асортименті харчових продуктів, що дають змогу не лише збалансувати харчування людини, але й підвищувати захисні механізми і довголіття людського організму. Високопродуктивними культурами різнобічного використання, що відповідають вищезгаданим вимогам, є цикорій коренеплідний (Cichorium intybus L.), коренеплоди якого містять полісахарид інулін у кількості до 19% і до 2-3% фруктози, та буряк цукровий (Beta vulgaris L.), коренеплоди якого мають 17-19% цукру.

Успіх виробництва продукції визначається розробкою нових селекційних технологій створення високоврожайних сортів та гібридів даних культур.

Актуальність теми. Розвиток сучасної селекції цикорію коренеплідного і буряків цукрових та ускладнення селекційно-генетичних програм потребує пошуку нових нетрадиційних підходів і методів, які б дали змогу виявити всі потенційні можливості рослинного організму та в короткі строки отримати новий вихідний матеріал. Для прискорення процесу отримання рослинного матеріалу з комплексом господарсько цінних ознак необхідно використовувати досягнення сучасної біологічної науки і біотехнології зокрема. Інтенсифікація селекційного процесу можлива при удосконаленні схеми селекції за рахунок введення в загальну схему біотехнологічної ланки.

Використання біотехнологічних методів сприяє прискоренню вирішення питань з отримання як генетично ідентичних матеріалів визначених біовидів, так і нових його форм.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації виконували протягом 1994-2009 рр. у відповідності з Державною комплексною науково-технічною програмою «Цукрові буряки» за темами: «Розробити і удосконалити методи створення вихідних матеріалів, створити високопродуктивні сорти і гібриди цикорію коренеплідного» (номер державної реєстрації -- 0105U007448), «Розробити теоретичні основи створення нових генотипів цукрових буряків з використанням методів біотехнології, створити високопродуктивні гібриди, стійкі до комплексу біотичних і абіотичних факторів, та удосконалити технології виробництва коренеплодів і насіння» (номер державної реєстрації -- 0196U012876), «Цукрові буряки та малопоширені коренеплідні й технічні культури» (номер державної реєстрації -- 0196U012876) згідно тематичних планів Філіалу інституту цукрових буряків УААН (тепер -- Інститут коренеплідних культур УААН) та у відповідності з Державною програмою за темами: «Оптимальне використання природного і ресурсного потенціалу агроекосистем Правобережного Лісостепу України» (номер державної реєстрації -- 0100U004495), «Використання біотехнологічних методів в селекції цукрових буряків та цикорію коренеплідного» (номер державної реєстрації -- 0100U003375) згідно тематичних планів кафедри генетики, селекції рослин та біотехнології Уманського державного аграрного університету Міністерства аграрної політики України.

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи було вдосконалення технології селекційного процесу для вирішення проблеми створення вихідного матеріалу цикорію коренеплідного та буряків цукрових шляхом використання біотехнологічної ланки на основі встановлення закономірностей проходження морфогенетичних процесів в ізольованій культурі рослин цикорію коренеплідного, розробки біотехнологічних методів розмноження, збереження генетично сталих та індукції формування нових вихідних його форм, а також удосконалення біотехнологічних прийомів отримання гаплоїдних матеріалів та гомозиготних ліній буряків цукрових при стимуляції гаплоїдії.

Для досягнення цієї мети було поставлено на вирішення такі завдання:

· удосконалити технології селекційного процесу для створення вихідного матеріалу цикорію коренеплідного та буряків цукрових з використанням біотехнологічної ланки;

· визначити особливості мікроклонального розмноження рослин цикорію коренеплідного (введення в культуру in vitro та стерилізація експланта, здатність до регенерації, активації розвитку меристем, проліферації, ризогенезу та адаптації до нестерильних умов росту та розвитку);

· оптимізувати умови культивування різних генотипів цикорію коренеплідного в ізольованій культурі;

· розробити прийоми адаптації культуральних рослин цикорію коренеплідного до умов ex vitro;

· встановити вплив екзогенних та ендогенних факторів на індукцію калюсогенезу з різних типів експланта цикорію коренеплідного;

· виявити оптимальні умови для розмноження та отримання нових вихідних рослинних форм цикорію коренеплідного при використанні калюсогенезу і морфогенезу (склад живильних середовищ, модифікація живильних середовищ регуляторами росту та основними неорганічними речовинами, режими культивування in vitro);

· визначити режими ефективної регенерації рослин цикорію з калюсних тканин шляхом органогенезу і соматичного ембріоїдогенезу для отримання рослин-регенерантів;

· з'ясувати вплив екзогенної абсцизової кислоти на індукцію соматичного ембріоїдогенезу калюсної біомаси цикорію;

· провести аналіз морфологічних, цитогенетичних та агробіологічних особливостей рослинних матеріалів цикорію коренеплідного, отриманих у культурі in vitro;

· підвищити вихід гомозиготних матеріалів буряків цукрових шляхом використання гіногенезу;

· дослідити рівень спонтанної диплоїдизації гаплоїдних структур в ізольованій культурі та розробити методику отримання гомодиплоїдів шляхом індукованої диплоїдизації гаплоїдних матеріалів буряків цукрових;

· визначити оптимальні умови депонування рослин для створення активної колекції та банку генетичних матеріалів цикорію коренеплідного і буряків цукрових;

· удосконалити загальну селекційну схему отримання вихідних матеріалів цикорію коренеплідного та буряків цукрових;

· отримати новий вихідний для селекції матеріал.

Об'єкт дослідження -- закономірності розвитку рослинного матеріалу та прояву господарсько цінних ознак у рослин цикорію коренеплідного при мікроклональному розмноженні, калюсогенезі і морфогенезі калюсної тканини та особливості отримання гаплоїдних і гомодиплоїдних ліній буряків цукрових у культурі in vitro як вихідного матеріалу для селекційного процесу.

Предмет дослідження -- біотехнологічні методи, вихідний матеріал цикорію коренеплідного з господарсько цінною ознакою конусоподібності кореня та гомозиготні чоловічостерильні та фертильні форми буряків цукрових.

Методи дослідження -- біотехнологічні, фізіологічні, цитологічні, агроекологічні, польові, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вирішено проблему удосконалення технології селекційного процесу з отримання вихідного матеріалу цикорію коренеплідного та буряків цукрових за рахунок використання біотехнологічної ланки для створення сортів і гібридів.

Вперше визначено оптимальні умови для мікроклонального розмноження, калюсогенезу та морфогенезу калюсної тканини рослин цикорію коренеплідного і експериментально обґрунтовано вибір експланта та умови його культивування, що забезпечує максимальний коефіцієнт розмноження та регенерацію рослин у культурі in vitro.

Розроблено модифіковані живильні середовища, які забезпечують різні напрямки розвитку рослинного біоматеріалу цикорію коренеплідного в ізольованій культурі: активацію розвитку меристем, розмноження, стимуляцію закладання генеративних пагонів у перший рік онтогенетичного розвитку, укорінення, індукцію калюсогенезу, органогенезу, соматичного ембріоїдогенезу та формування сомаклональних варіантів.

Доведено, що адаптація рослин у пробірках у культуральних кімнатах у порівнянні з проміжною адаптацією при використанні тепличного комплексу є ефективнішою і дає змогу скоротити термін та зменшити витрати на адаптаційні процеси при перенесенні вкорінених рослин цикорію з культури in vitro у природні умови вирощування.

Встановлено, що використання гіногенезу, зокрема запилення рослини-донора насіннєвих зачатків пилком виду Beta webbiana L., дає можливість підвищити вихід гаплоїдних та гомодиплоїдних рослин буряків цукрових для збільшення кількості генетично цінних гомозиготних ліній та ведення гетерозисної селекції.

Підтверджено явище спонтанної диплоїдизації рослин буряків цукрових при тривалому культивуванні клонованого матеріалу в культурі in vitro та встановлено оптимальний вміст колхіцину в живильному середовищі для індукованої диплоїдизації гаплоїдів і дигаплоїдів в ізольованій культурі, що дозволяє створювати вихідний гомозиготний чистолінійний матеріал.

Вперше визначено умови отримання та зберігання активної колекції селекційного матеріалу буряків цукрових та цикорію коренеплідного, що дає можливість формувати банк цінних генотипів, генетично ідентичних вихідним формам.

Розроблено селекційні схеми отримання вихідних матеріалів цикорію коренеплідного та гомозиготних ліній буряків цукрових з використанням біотехнологічних методів, що дає змогу інтенсифікувати і прискорити селекційний процес зі створення високопродуктивних сортів цикорію та гетерозисних гібридів буряків.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено нові технології селекційного процесу з отримання вихідного матеріалу для створення сортів цикорію коренеплідного та гетерозисних гібридів буряків цукрових, які включають біотехнологічні ланки.

Розроблено спосіб активації розвитку меристем і розмноження рослин цикорію коренеплідного, використання якого в селекційному процесі сприяє отриманню генетично ідентичного рослинного матеріалу (патент № 24325) та спосіб отримання генеративних пагонів цикорію в культурі in vitro для закладання квітконосних пагонів у перший рік онтогенетичного розвитку рослини (патент № 24324).

Обґрунтовано використання соматичного ембріоїдогенезу для створення цінних генетично стабільних вихідних форм цикорію коренеплідного.

Розроблено спосіб підвищення виходу гаплоїдних рослин буряків цукрових та удосконалено технологію отримання гаплоїдних та гомодиплоїдних ліній, що дає змогу скоротити термін отримання гетерозисних гібридів (патент № 24323).

Створено банк генетичних матеріалів та підібрано оптимальні умови підтримання активної колекції рослин буряків цукрових і цикорію коренеплідного для використання в селекційному процесі.

Розроблено методичні рекомендації зі стерилізації рослинного матеріалу цикорію коренеплідного при введенні експлантів у культуру in vitro та стимуляції розвитку генеративних пагонів рослин цикорію коренеплідного в культурі in vitro для використання студентами і викладачами навчальних закладів та фахівцями біотехнологічних лабораторій селекційних станцій та науково-дослідних інститутів, що займаються проблемами біотехнології, селекції і насінництва цикорію коренеплідногою.

Отримано новий вихідний селекційний матеріал цикорію коренеплідного та буряків цукрових, який використовується у фундаментальних та прикладних дослідженнях Інституту коренеплідних культур УААН, Всеросійського інституту цукрових буряків та цукру ім. Мазлумова РАСХН, Верхняцької дослідно-селекційної станції Інституту цукрових буряків УААН та Всеукраїнського наукового інституту селекції.

Отримано вихідний гомозиготний матеріал буряків цукрових, частину з якого використано при створенні гетерозисних гібридів на ЧС-основі Авторитетний, Русь 3 та Аграрний.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертації самостійно визначилась з напрямами та тематикою досліджень, провела інформаційний пошук та проаналізувала дані літературних джерел вітчизняних та зарубіжних вчених, розробила концепцію програм, спланувала і провела експерименти, запропонувала нові ефективні методичні підходи, проаналізувала всі експериментальні дані, сформулювала висновки та рекомендації, підготувала до публікації наукові праці, а також впроваджувала результати досліджень у селекційну практику.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи щороку доповідались на засіданнях кафедри генетики, селекції рослин та біотехнології, вчених радах та методичних комісіях агрономічного факультету, а також наукових конференціях молодих вчених та науково-практичних конференціях Уманського державного аграрного університету 1997-2009 рр.; матеріали представлені на Міжнародній конференції «Молекулярна генетика та біотехнологія» м. Мінськ, 1998 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье» м. Сімферополь, 1998 р.; Міжнародній конференції молодих вчених «Dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine» м. Київ., 2003 р.; семінарі «Проблеми отримання та використання генетично модифікованих і клонованих організмів» м. Біла Церква, 2004 р; Міжнародній науково-практичній конференції «Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання» м. Оброшино, 2005 р.; Міжнародному науковому семінарі молодих вчених «Стрес і адаптація рослин» м. Харків, 2005 р.; Міжнародній науково-практичній конференції «Аграрний форум - 2006» м. Суми, 2006 р.; Міжнародній науковій конференції «Біологія: від молекули до біосфери» м. Харків, 2007 р.; Міжнародній науковій конференції «Сучасні проблеми виробництва і використання рослинного білка: глобальні зміни та ризики» м. Вінниця, 2008 р.

Публікації. За темою роботи опубліковано 58 наукових праць, з них у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 24 статті. За результатами роботи отримано три деклараційних патенти на корисну модель, опубліковано 20 тез доповідей та видано шість методичних рекомендацій.

Обсяг і структура роботи. Дисертаційну роботу викладено на 417 сторінках комп'ютерного набору, в тому числі 313 -- основного тексту. Дисертація складається зі вступу, десяти розділів, висновків, рекомендацій виробництву, додатків, списку використаних джерел з 514 позицій, з яких 218 -- латиницею, та містить 63 таблиці і 69 рисунків. У додатках 12 таблиць, один рисунок, акти випробування та впровадження результатів досліджень.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗДІЛ 1. сучасний стан, проблеми та перспективи розвитку біотехнологічних методів у селекції рослин (огляд літератури)

На основі аналізу джерел літератури викладено теоретичні засади та нові селекційні схеми з використанням біотехнологічної ланки при вирішенні наукової проблеми зі створення, добору і зберігання вихідного матеріалу для отримання високопродуктивних сортів цикорію коренеплідного та гетерозисних гібридів буряків цукрових. Вищезазначені питання в Україні вивчено недостатньо, що стало підставою проведення наших досліджень.

РОЗДІЛ 2. УМОВИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження за даною темою дисертаційної роботи проводили протягом 1994-2009 рр. у лабораторії біотехнології Уманського державного аграрного університету (УДАУ) та лабораторії культури тканин Інституту коренеплідних культур УААН (ІКК). Рослинні матеріали для досліджень вирощували на дослідних ділянках УДАУ та ІКК УААН, а також в окремих боксах теплиці інституту.

Донорним матеріалом у дослідах слугували сорти цикорію коренеплідного Уманський 95, Уманський 97, Уманський 99 та гетерозиготні за геном R стерильні та фертильні форми компонентів гібридів буряків цукрових Кубанський ЧС 36, Арій 1, Уладовський ЧС 36, Альтій.

Першу серію досліджень було спрямовано на вивчення біотехнологічних умов отримання та культивування різних типів тканин цикорію коренеплідного.

При проведенні біотехнологічних досліджень керувались загальними принципами та методиками роботи з культурами рослинних тканин, розробленими Р.Г. Бутенко (1989), В.В. Калініним, В.В. Сарнацькою, В.Е. Поліщук (1980).

Для стерилізації інтактних рослинних матеріалів використовували розчини хлораміну в концентрації 5,0-15,0% та дихлориду ртуті (сулеми) -- 0,05-0,15%.

Для мікроклонального розмноження на кожному етапі клонування (активація меристем, регенерація, розмноження, ризогенез) експериментально визначали склад живильного середовища та його фітогормональну оптимізацію. В основу живильного субстрату входили макро- і мікроелементи за прописами середовищ Мурасіге-Скуга та Гамборга (Murashige T., Skoog F., 1962; Gamborg O.L., Eveleigh D.E., 1968). Модифікували живильні середовища цитокінинами (6-бензиламінопурин, кінетин) та ауксинами (індолілоцтова кислота, нафтилоцтова кислота, гетероауксин). Середовища готували та стерилізували за стандартним методом (Р.Г. Бутенко, 1964).

Адаптацію рослинного матеріалу до умов навколишнього середовища проводили двома методами: рослини in vitro в адаптаційних кімнатах; проміжна адаптація при використанні теплиці. У селекційно-тепличному комплексі режим вирощування рослин задавали згідно методичних рекомендацій, розроблених в ІЦБ УААН для буряків цукрових (Зубенко В.Ф., Чудновський Б.Д., 1983).

Укорінення та розвиток акліматизованих рослин в умовах ex vitro стимулювали впливом гетероауксину (0,5-1,5 мг/л) та параамінобензойної кислоти (0,01-0,0001 мг/л).

Розвиток генеративних пагонів цикорію коренеплідного в ізольованій культурі в перший рік життя рослини індукували модифікованими живильними середовищами з додаванням до їх складу б-індолілмасляної кислоти (0,1- 2,0мг/л) та гібереліну (1,0-2,0 мг/л).

Для індукції калюсогенезу цикорію коренеплідного в основу живильного субстрату вводили макро- і мікроелементи за прописом середовищ Мурасіге-Скуга (Murashige T., Skoog F., 1962), Гамборга (Gamborg O.L., Eveleigh D.E., 1968) та Шенка-Хільдебрандта (Schenk R.U., Hildebrandt A.C., 1972).

Модифікуючи склад середовищ, вивчали вплив регуляторів росту (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота в концентрації 0,1-2 мг/л, нафтилоцтова кислота в концентрації 0,1-2,0 мг/л) на калюсотвірну здатність різних типів тканин цикорію. Для обліку приросту калюсу визначали відносний приріст сирої калюсної маси за формулою С. Кепліна (Caplin S.M., 1946).

Морфогенетичну активність калюсної тканини (органогенез, соматичний ембріоїдогенез) індукували введенням до живильного середовища різних співвідношень та концентрацій цитокінину/гіберелової кислоти, а також дією низьких позитивних температур (40С). У період формоутворюючих процесів спостерігали за розвитком структур, їх кількістю та морфологічними і цитологічними характеристиками. Початковий період органогенезу та соматичного ембріоїдогенезу фіксували за допомогою комп'ютерної зйомки.

Для підвищення активності формування соматичних ембріоїдів та рослин-регенерантів до живильного середовища додавали абсцизову кислоту (0,1-5,0 мг/л).

У другій серії досліджень передбачали роботу з ізольованими тканинами буряків цукрових.

Для підвищення виходу гаплоїдів і гомодиплоїдів буряків цукрових поєднали культуру ізольованих насіннєвих зачатків та гіногенетичне стимулювання запиленням рослини-донора експланта пилком рослин виду Beta webbiana L. Культивування насіннєбруньок проводили на модифікованому живильному середовищі MS (Рябовол Л.О., 1994).

Спонтанну диплоїдизацію гаплоїдних матеріалів буряків цукрових у культурі in vitro вивчали при тривалому культивуванні гаплоїдів у ізольованій культурі. Для депонування рослин у досліді використовували методику та середовище розроблене вченими ІЦБ УААН (Редько В.І., Ільєнко І.І., Павловська Л.Л., 1997).

Для індукованої диплоїдизації гаплоїдних рослин використовували колхіцин у концентрації 0,1-0,2% (за експозиції 12-24 год.). У дослідженнях застосовували три методи впливу колхіцину на рослину в культурі in vitro: краплинний метод - обробка апікальної меристеми клонованих рослин в ізольованій культурі; заливка точки росту біоматеріалу поліплоїдизуючою речовиною в пробірці; додавання препарату до ростового живильного середовища.

Для створення активної генетичної колекції цикорію коренеплідного та буряків цукрових вивчали вплив температурного фактору (70С-160С) та вуглеводного живлення (сахароза -10,0 г/л, агар-агар - 10,0 г/л).

Ідентифікацію плоїдності проводили під мікроскопом МБІ-13, підраховуючи кількість хромосом у давлених препаратах, отриманих із калюсу чи соматичних клітин апікальної меристеми клонованих рослин цикорію та буряків, за методикою, розробленою в лабораторії генетики і цитології ІЦБ УААН (Литвиненко И.И., Ворохов В.Г., Кирсанова Ю.В., 1988).

Статистичну обробку результатів досліджень виконували методами дисперсійного, кореляційного та регресійного аналізу з використанням прикладної програми «Statistica - 6» (Мойсейченко В.Ф., Єщенко В.О., 1994; Царенко О.М., Злобін Ю.А., Скляр В.Г., 2000).

РОЗДІЛ 3. технологія мікроклонального розмноження рослин cichorium intybus l

Для збереження та прискореного розмноження цінних рослинних генотипів доцільно застосовувати мікроклональне розмноження. Даний метод базується на регенераційній здатності тотипотентних рослинних клітин, що дає можливість нескінченно довго розмножувати та зберігати відносно незмінними генотипи. Це питання особливо важливе при веденні селекції перехреснозапильних культур, до яких належить цикорій коренеплідний.

При розробці методу мікроклонального розмноження рослин цикорію вивчали п'ять послідовних етапів клонування, першим з яких є добір та введення експлантів в культуру in vitro. Отримані нами результати підтверджують те, що найкращим експлантом для мікроклонування цикорію коренеплідного є апікальна меристема рослин, так як вона генетично стала, здебільшого звільнена від вірусної інфекції та вирізняється високою морфогенетичною здатністю.

Найефективнішою стерилізуючою речовиною для введення меристеми в ізольовану культуру визначено 0,1%-вий розчин сулеми за експозиції 20 хвилин. Вихід стерильних біоматеріалів у цьому варіанті досліду склав 96,0%. Порівнюючи два способи вирощування донорного матеріалу та вплив на інфікування початкових експлантів, ми дійшли висновку, що вирощування рослин цикорію коренеплідного в умовах закритого ґрунту сприяє отриманню в культурі in vitro 96,0% неінфікованих експлантів. Це на 15,0% більше, аніж з польового матеріалу. Отримані результати можна пояснити умовами вирощування експериментальних генотипів у теплиці, які дозволяють оптимізувати розвиток рослини-донора експлантів за рахунок штучного створення оптимальних умов вегетації, включаючи полив та підвищення інтенсивності освітлення, і уникнути забруднення листкового апарату ґрунтовою сумішшю.

Розвиток апікальних меристем, експресія або пригнічення тотипотентності значною мірою залежить від умов in vitro, у які потрапляє біоматеріал. Серед них найважливішими фізичними факторами є освітлення, температурний режим, вологість. У наших дослідженнях після стерилізації апікальну меристему висаджували на живильне середовище і культивували при температурі 20-240С, 16-ти годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 3-5 кілолюкс і відносній вологості 75%. При створенні фізичних умов вирощування для клонування рослин цикорію коренеплідного було сконцентровано увагу на спектрі освітлення культуральної кімнати, так як на думку Т. Мурасіге (Murashige T., 1974) використання відповідного спектру світла, який залежить від виду біоматеріалу, суттєво впливає на інтенсивність розвитку рослин in vitro.

У наших дослідах світло червоного спектру, з енергією світлових квантів на рівні 1,95 еВ, у ізольованій культурі інтенсифікувало процеси розвитку апікальних меристем та коренів рослин цикорію коренеплідного, але стримувало калюсогенез і морфогенез калюсних тканин. Натомість світло блакитного спектру, енергія світлових квантів якого була 2,53 еВ, стимулювало процеси морфогенезу калюсних тканин і позитивно впливало на індукцію калюсогенезу, розвитку апікальних меристем та коренів цикорію. Таким чином, встановлено, що для розвитку апікальних меристем, формування адвентивних бруньок, укорінення рослин цикорію коренеплідного ефективно використовувати червоний спектральний склад світла з довжиною хвилі 624-650 нм, для калюсогенезу та морфогенезу -- блакитний з довжиною хвилі 480-504 нм.

Вивчення фізичних умов вирощування рослин у культурі in vitro є важливим етапом роботи, проте основним і найскладнішим залишається підбір компонентів живильного середовища, концентрації та співвідношення регуляторів росту у їх складі, які і визначають напрями розвитку біоматеріалу.

У наших дослідженнях для введення та культивування меристем цикорію коренеплідного аналізували 50 модифікованих середовищ. Для активації розвитку меристем в основу живильного субстрату вводили макро- і мікроелементи за прописами середовищ Мурасіге-Скуга та Гамборга, вітаміни -- за Уайтом. Для вивчення впливу концентрації та співвідношення екзогенних регуляторів на розвиток меристем біовиду живильні субстрати модифікували регуляторами росту групи ауксинів і цитокінинів. У результаті проведених досліджень встановлено, що модифіковане середовище Мурасіге-Скуга з додаванням 6-бензиламінопурину у концентрації 1,0 мг/л, в-аланіну -- 1,0 мг/л; L-глютаміну -- 1,0 мг/л, гіберелової кислоти -- 0,05 мг/л (MS-3) ініціювало до мікроклонального розмноження 96,0% експлантів, сприяло швидкому закладанню адвентивних бруньок та розвитку їх меристем (патент № 24325, 2007).

Також виявлено залежність інтенсивності утворення меристематичних клонів від фітогормональної оптимізації живильного середовища. При використанні для проліферації середовищ, до складу яких входили цитокінини, зокрема 6-бензиламінопурин, у досліджуваних генотипів цикорію коефіцієнт розмноження збільшувався при підвищенні концентрації цієї складової до 1,0 мг/л (рис. 1).

Подальше збільшення вмісту цього компонента в середовищі інгібувало закладання адвентивних бруньок, а в зонах ушкодженої тканини фіксували формування калюсу. Нами також встановлено, що при введенні до живильного субстрату ауксинів (ІОК, IMK) коефіцієнт розмноження зводився до нуля. Необхідно зауважити і те, що кількість закладених бруньок залежала від генотипу вихідного експланта. Найвищий коефіцієнт розмноження був у рослин сорту Уманський 99, кількість отриманих клонів на сороковий день культивування в середньому склала 43 штуки. Найнижчим він був у сорту Уманський 97 (31 клон).

У рослин цикорію, як і в більшості видів, коефіцієнт розмноження (кількість пагонів, утворених в одному меристематичному клоні за один міжпасажний період) прямопропорційно залежить від тривалості міжпасажного періоду (рис. 2) та пори року.

Найкращий показник у досліді мав сорт Уманський 99, утворюючи інтенсивно меристематичні клони рослин. Найвищий коефіцієнт розмноження при інтенсивному закладанні бруньок спостерігали на тридцятий день культивування. Після місячного культивування інтенсивність закладання пагонів різко знижувалась. Вищий коефіцієнт розмноження відмічено у весняно-літній період, нижчий -- у осінньо-зимовий.

Для укорінення клонованих рослин цикорію коренеплідного до основного складу живильного середовища додавали ауксини у концентрації 0,5-2,0 мг/л. У процесі досліджень встановлено, що концентрація індолілоцтової кислоти 1,0 мг/л у модифікованому живильному середовищі MS є оптимальною для індукції формування коренів та інтенсивного (96,4%) наростання кореневої системи рослин цикорію коренеплідного (табл. 1).

Таблиця 1

Вкорінення клонованих рослин цикорію in vitro залежно від концентрації ІОК

Концентрація в живильному середовищі ІОК, мг/л	Кількість укорінених рослин,%	Кількість сформованих початкових коренів у рослини, шт.	Інтенсивність наростання кореневої системи, мм (15-та доба культивування)
0,5	12,5±2,5	3,5±0,6	5,5±0,6
1,0	96,4±2,5	7,3±0,5	9,8±0,9
1,5	80,6±2,4	5,0±0,8	7,8±0,5
2,0	9,2±1,2	1,7±0,5	2,3±0,9

*Примітка: у кожній повторності досліду на укорінення висаджували 50 штук рослин;

При укоріненні рослинного матеріалу протягом року встановлено критичні періоди (травень-червень, жовтень-листопад) формування у базальній частині калюсної тканини. Уникнути даного явища можна введенням до середовища підвищеної концентрації екзогенного ауксину (1,5 мг/л ІОК).

Для перенесення рослин з оптимальних умов in vitro у природні в наших дослідженнях вивчались два способи адаптації - адаптація з проміжним укоріненням рослин при використанні теплиці та адаптація рослин в пробірках у культуральних (адаптаційних) кімнатах. При адаптації рослин в ізольованій культурі у середньому за генотипами 85,5% біоматеріалу прижилося в ґрунті і забезпечило ріст та розвиток нормально розвинених рослин (табл. 2).

Таблиця 2

Вихід акліматизованих рослин цикорію коренеплідного залежно від способу адаптації

Генотип	А д а п т а ц і я
	рослини у пробірках в адаптаційних кімнатах	проміжне укорінення рослин у теплиці
	висаджено	адаптовано	висаджено	адаптовано
	шт.	шт.	%	шт.	шт.	%
Уманський 95	230	196	85,2±1,8	430	391	90,9±3,2
Уманський 97	195	164	84,1±3,1	300	263	87,6±4,2
Уманський 99	245	213	86,9±4,6	341	305	89,4±2,1
Всього за генотипами	670	573	85,5±3,2	1071	959	89,5±3,2

При проміжному типі адаптації вихід акліматизованих рослин цикорію становив у середньому за генотипами 89,5%, що на 5,0% вище, аніж у попередньому досліді. Проте, використовуючи регламент адаптації рослин в системах in vitro, економиться час та витрати на проміжне укорінення в тепличному комплексі з контрольованими параметрами мікроклімату. Окрім того, подвійне пересаджування рослин, особливо, які формують коренеплід, травмує кореневу систему, що може призвести до її аномального розвитку.

Розглянувши будову кореневої системи укорінених рослин цикорію коренеплідного на 30-тий день вегетації, отримали результати, які підтверджують ефективність запропонованого способу адаптації (табл. 3).

Таблиця 3

Формування кореневої системи у рослин цикорію коренеплідного за різних способів адаптації

Спосіб адаптації	Тип кореневої системи
	стрижневий	проміжний	мичкуватий
	шт.	%	шт.	%	шт.	%
Рослини в ізольованій культурі	30,3	75,6±2,4	6,7	16,9±2,4	3,0	7,5±2,0
Проміжне укорінення	25,2	63,1±2,3	6,8	16,9±1,2	8,0	20,0±2,1

*Примітка: у кожній повторності досліду аналізували 50 штук рослин;

При використанні адаптації рослин в ізольованій культурі 75,6% біоматеріалу формувало стрижневу кореневу систему, а при застосуванні способу проміжного укорінення рослин стрижневу кореневу систему формувало лише 63,1% матеріалу цикорію коренеплідного. Враховуючи необхідність формування штеклінгів цикорію коренеплідного з інтенсивно розвиненим стрижневим коренем, пропонуємо застосовувати для адаптації рослинного матеріалу розроблений спосіб адаптації рослин у пробірках в адаптаційних кімнатах.

Обробка коренів рослин перед висадкою в ґрунт рістактивуючими препаратами (ПАБК 0,0001-0,01 мг/л, гетероауксин 0,5-1,5 мг/л) дозволила збільшити кількість адаптованого рослинного матеріалу цикорію коренеплідного. При цьому найефективнішим виявився вплив параамінобензольної кислоти (C7H7O2N) у концентрації 0,001 мг/л, що забезпечило виживання рослин у середньому за генотипами на рівні 92,0% від загальної кількості висаджених матеріалів. У даному варіанті досліду спостерігався інтенсивний ріст рослин цикорію: формування яскраво забарвлених молодих листків, видовження черешків.

Проведений цитологічний аналіз довів генетичну ідентичність 92,4% клонованого рослинного матеріалу цикорію коренеплідного (диплоїди з каріотипом 18 хромосом) рослині донора експлантів.

Отже, в результаті проведених досліджень підібрано оптимальні умови для мікроклонального розмноження рослин цикорію коренеплідного (включаючи підбір стерилізуючої речовини при введенні апікальної меристеми в культуру in vitro, спектр освітлення, модифікацію живильного середовища для активації розвитку меристем, розмноження та укорінення рослин, адаптацію рослин у ізольованій культурі та вибір регуляторів росту для акліматизації рослин), як важливої ланки в селекційному процесі для збереження та розмноження цінних генотипів.

РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ РЕГУЛЯТОРІВ РОСТУ НА СТИМУЛЯЦІЮ РОЗВИТКУ ГЕНЕРАТИВНИХ ПАГОНІВ РОСЛИН CICHORIUM INTYBUS L. В КУЛЬТУРІ IN VITRO

Цикорій коренеплідний (Cichorium intybus L. var. sativum Lam.) -- дворічна культура. У перший рік утворюється потовщений корінь (коренеплід), на другий -- формуються генеративні пагони, настає цвітіння і плодоношення.

У літературі відомі факти стимуляції онтогенетичних процесів (закладання квітконосних пагонів у перший рік життя) під впливом регуляторів росту рослин (Калинин Ф.Л., 1984). За допомогою фізичних та хімічних факторів можна прискорити, уповільнити чи змінити цей процес і таким чином втрутитись у керуванням ростом, розвитком та продуктивністю рослини і скоротити селекційний процес вдвічі.

При обробці гіберелінами розеток дворічних рослин спостерігається витягування стебла та формування генеративних органів. Перехід до цвітіння забезпечується біосинтезом нових функціонально-специфічних білків, які формуються під впливом регулятора росту (Миляева Э.Л., Ковалёва Л.В., 1981). У рослині створюється певний тип обміну речовин, який призводить до закладання генеративних пагонів, цвітіння та плодоношення (Чайлахян М.Х., 1937). Окрім того, гібереліни не беруть участі у активації генетичної інформації, що відповідає за формування квітки, а стимулюють активацію генетичної інформації, що визначає формування генеративного стебла. В основі цього лежить активація гіберелінами ділення або розтягування клітин, а іноді мають місце обидва цих процеси (Paleg L., Wood A., Sawnhey R., 1970). Окрім гіберелінів у регуляції формування генеративних органів беруть участь й інші фітогормони, зокрема ауксини (Adamson D., 1962).

Отже, використовуючи екзогенні гібереліни й ауксини в певних концентраціях та співвідношеннях у культуральних умовах вирощування, можна стимулювати процеси детермінації та диференціації рослинних тканин, зокрема цикорію коренеплідного, що дасть змогу отримати в культурі in vitro програмоване закладання генеративних пагонів та цвітіння. Це скоротить селекційний процес за рахунок часу, що відводиться на стан спокою (витримування біоматеріалу при температурі 3-50С 45-50 днів у холодильниках) та яровизацію.

Для стимуляції розвитку закладання генеративних пагонів рослин цикорію коренеплідного до експериментальних живильних середовищ, в основу яких входили макро- та мікроелементи за прописом Мурасіге-Скуга, 5,0 мл/л Fe-хелат, 1,0 мл/л вітамінів за Уайтом, 30,0 г/л сахарози, вводили різні концентрації регуляторів росту -- 1,0-2,0 мг/л гіберелової кислоти (ГК) та 0,1-2,0 мг/л індолілмасляної кислоти (ІМК).

Проведені дослідження показали, що у рослин цикорію під впливом гіберелової кислоти в поєднанні з індолілмасляною кислотою відбувається активне закладання генеративних пагонів (рис. 3). Найвищу інтенсивність закладання генеративних пагонів отримали на живильному середовищі, до складу якого входили 2,0 мг/л гіберелової кислоти та 0,5 мг/л індолілмасляної кислоти. На його фоні кожна рослина утворювала від однієї до трьох квітконосів, а на кожному стеблі ще в ізольованій культурі закладалось по 2-3 квітки.

При формуванні у рослин цикорію квітконосних пагонів спостерігали також утворення кореневої системи з чітко вираженим центральним коренем. Вона була менш розгалужена, аніж у матеріалів, культивованих на спеціальних середовищах для ризогенезу, проте дозволяла проводити перенесення рослин у ґрунт для укорінення та адаптації.

Вивчення репродуктивних рослин цикорію коренеплідного за основними ознаками продуктивності показало відмінність між рослинами з культури in vitro, які в перший рік вегетації сформували генеративні пагони, та рослинами другого року вегетації, отриманими із штеклінгів (табл. 4). Незалежно від генотипу вихідного матеріалу, за висотою генеративних пагонів, кількістю стебел на одній рослині та кількістю суцвіть, на 15,0-20,0% кращі показники мали насіннєві матеріали другого року вегетації. Проте рослини першого року вегетації на 15-20 діб мали триваліший термін цвітіння, аніж репродуктивні рослини з двохрічним циклом розвитку, а маса 1000 насінин та схожість насіння істотно не відрізнялись. Необхідно зауважити і те, що маса 1000 насінин на рівні 1,7 г, а схожість насіння на рівні 86,0% є середнім показником також і для репродуктивних рослин, які вирощуються за загальноприйнятими технологіями.

Таблиця 4

Характеристика репродуктивних рослин цикорію коренеплідного за ознаками, що визначають насіннєву продуктивність, 2002-2004 рр.

Ознака	Уманський 99	Уманський 97
	репродуктивна рослина першого року вегетації з культури in vitro	репродуктивна рослина другого року вегетації з штеклінгів	репродуктивна рослина першого року вегетації з культури in vitro	репродуктивна рослина другого року вегетації з штеклінгів
Висота рослини, см	99,0±12,1	123,3±13,3	88,3±5,7	110±6,1
Кількість стебел на одній рослині, шт.	7,3±0,6	8,7±0,6	7,3±1,2	8,0±1,0
Кількість суцвіть на одну рослину, шт.	620±73	847±65	573±64	795±92
Тривалість цвітіння, днів	62,3±2,6	44,0±3,2	61,7±2,9	44,0±1,0
Маса 1000 насінин, г	1,71±0,2	1,75±0,1	1,70±0,1	1,72±0,1
Схожість насіння,%	85,7±2,4	86,1±1,4	86,4±2,7	85,9±1,6

Отже, доведено, що внесення до живильного середовища макро-, мікроелементів за прописами MS, 1,0 мг/л вітамінів за Уайтом, 2,0 мг/л гіберелової кислоти, 0,5 мг/л індолілмасляної кислоти, 30,0 г/л сахарози, дозволяє формувати в культурі in vitro квітконосні та укорінені рослин. Використовуючи даний біотехнологічних метод у селекційній схемі, можна стимулювати закладання квітконосних пагонів рослин цикорію коренеплідного в перший рік онтогенетичного розвитку, що дає можливість удвічі скоротити селекційний процес.

На основі проведених досліджень нами було запропоновано спосіб отримання генеративних пагонів рослин цикорію коренеплідного в культурі in vitro (патент № 24324, 2007).

РОЗДІЛ 5. ПІДБІР ОПТИМАЛЬНИХ УМОВ КАЛЮСОГЕНЕЗУ ТА МОРФОГЕНЕЗУ ДЛЯ ОТРИМАННЯ НОВИХ СЕЛЕКЦІЙНИХ МАТЕРІАЛІВ CICHORIUM INTYBUS L

Одним із ефективних біотехнологічних методів, що сприяє прискоренню розмноження цінного селекційного матеріалу або отримати нові генотипи, є використання морфогенезу з калюсної біомаси.

Здатність до калюсоутворення у багатьох видів рослин -- еволюційно закріплена генетично детермінована реакція на травму, яка спрямована на відновлення ушкоджень організму і втрачених органів. Вона зумовлена моногенно або невеликою кількістю взаємодіючих генів та цитоплазматичними факторами (Кунах В.А., 1997; 2005). Виявлення здатності до утворення калюсу in vitro залежить не лише від генотипу рослин, експресії конкретних генів, а й від фізіологічного стану біоматеріалу.

Одним із основних питань при індукції калюсогенезу залишається морфогенетична активність калюсної біомаси (здатність калюсу до органогенезу чи соматичного ембріоїдогенезу).

Експлантами для отримання калюсної тканини цикорію коренеплідного слугували листкові пластинки, черешки та апікальна меристема рослин. Простерилізований рослинний матеріал надрізали в декількох місцях і переносили на агаризоване живильне середовище. В основу живильного середовища входили макро- і мікроелементи за прописами середовищ Мурасіге-Скуга, Гамборга, Шенка-Хільдебрандта. Модифікували середовища підвищеними концентраціями ауксинів та незначною кількістю цитокінинів.

Біоматеріал культивували в темнових умовах (термостатах) та на світлі з інтенсивністю освітлення 2 кЛк, температурному режимі 22-250С і відносній вологості 75%.

Швидкий хаотичний поділ клітин при інтенсифікації мітотичних циклів призводив до ініціації калюсогенезу різних типів експлантів. Проте інтенсивність наростання калюсу цикорію коренеплідного залежало як від типу початкового матеріалу, так і від складу живильного середовища.

У наших дослідах з індукції калюсогенезу було вивчено 48 варіантів культуральних середовищ. Внаслідок проведених досліджень підібрано склад живильного середовища для активної індукції калюсної тканини цикорію коренеплідного. Визначено, що введення до модифікованого живильного середовища Мурасіге-Скуга 5,0 мг/л Fe-хелат, 5,0 мг/л гліцину, 1,0 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л 6-БАП, 0,2 мг/л кінетину, 0,05 мг/л гіберелової кислоти, 30,0 г/л сахарози стимулює розвиток калюсу з різних типів експлантів. Найкращим експлантом була апікальна меристема рослини. Культивування даного типу експланта сприяло за 20-25 діб формуванню розпушеної калюсної тканини у 65,0% висадженого біоматеріалу.

При використанні в якості початкового експланта листкової пластинки зафіксовано нерівномірну чутливість віку та різних частин листка до калюсотвірної здатності. Інтенсивніше формується калюс у базальній частині листкової пластинки тривалої вегетації, аніж з тканин верхівок молодих листків.

Тривале культивування калюсу на середовищах з високими концентраціями 2,4-Д призводило до втрати морфогенетичного потенціалу калюсної тканини.

Для визначення оптимальної концентрації регулятора росту в культуральному середовищі для тривалого пасажування калюсу цикорію, отриману калюсну тканину висаджували на модифіковані 2,4-Д та НОК середовища МS. Діапазон концентрації речовин був у межах 0,1-2,0 мг/л. Маса початкового калюсу складала 0,53-0,65г.

У результаті проведених досліджень встановлено, що найвищий приріст калюсної тканини цикорію при пасажуванні був на середовищі з концентрацією 2,4-Д 0,1 мг/л, де він склав у середньому за генотипами 26,86%, а індекс наростання сягав 27,9 пунктів (рис. 4). Поступове збільшення концентрації регулятора росту до 1,5 мг/л знижувало ці показники відповідно до 1,67 та 2,7 пункти. Вміст 2,4-Д у концентрації 2,0 мг/л дозволив у порівнянні з попереднім варіантом дещо стимулювати калюсогенез.

У результаті культивування різних типів експлантів трьох сортів цикорію коренеплідного було отримано калюсні тканини різного походження, які відрізнялись як за консистенцією, так і кольором формувань.

За здатністю до морфогенезу, швидкістю наростання калюсної тканини і морфологічними ознаками нами було виділено три основні типи калюсів цикорію: 1 -- напівщільний зеленого або буро-зеленого забарвлення, який виявився здатним до регенерації поодиноких пагонів; 2 -- розпушений або середньої щільності світло-зеленого кольору, частково дедиференційований з добре вираженими чисельними меристематичними осередками, здатний до масового морфогенезу; 3 -- пухкий, швидко наростаючий, світлого кольору, неморфогенний. Взаємозв'язку між сортовими особливостями (за винятком кольору), походженням експланта та морфотипом калюсу не спостерігалось.

Найвищою морфогенетичною активністю характеризувався другий тип калюсної біомаси з розпушеною або напівщільною консистенцією та яскраво-зеленими меристематичними зонами. Морфогенез у культурі калюсних тканин цикорію коренеплідного пов'язаний з процесами цитогенетичної мінливості наростаючої маси клітин. Меристемоїдні клітини калюсу, які мають щільну цитоплазму, одне ядро, невелику вакуоль та щільно з'єднані між собою, характеризуються високою морфогенетичною активністю. Калюсні тканини, в яких переважають паренхімні клітини, гетерогенні за формою та розмірами, виявилися неспроможними до морфогенезу.

Калюсна тканина цінна тим, що з неї можна регенерувати рослини як генетично ідентичні материнській рослині, так і з новими ознаками. Для отримання нового матеріалу необхідно підбирати умови (зокрема склад живильного середовища) для індукції стимулювання морфогенезу калюсної біомаси.

З цією метою після нарощування достатньої кількості калюсу його переносили на регенераційні середовища та культивували на світлі при інтенсивності освітлення 2 кЛк.

Оскільки генетична стабільність клітин калюсу, як правило, невисока і може змінюватися протягом тривалого культивування, для подальшої регенерації використовувався первинний і субкультивований калюс після невеликої кількості пасажувань тому, що внаслідок довготривалого культивування рослинних тканин і клітин in vitro втрачається їх морфогенетичний потенціал. Через визначений період культивування на модифікованих регенераційних середовищах було виділено три типи розвитку калюсної тканини: 1) формування з калюсу пагонів шляхом органогенезу; 2) формування на поверхні калюсної тканини ембріоїдоподібних структур; 3) проліферація калюсної тканини.

Модифікуючи склад живильних середовищ, ми змінювали умови для індукції формування різних морфогенетичних реакцій компетентних клітин з метою реалізації програми диференціювання. Така програма генетично обумовлена і є результатом функціональної складової дії генів.

Для отримання органогенезу калюсної тканини використовували живильні середовища, в основу яких входили макро- і мікроелементи за прописом середовищ Мурасіге-Скуга (MS) та Гамборга (В5). Ці середовища модифікували підвищеною концентрацією 6-бензиламінопурину та невисокими концентраціями ауксинів (індолілоцтова кислота, нафтилоцтова кислота, індолілмасляна кислота). Показником ефективності одержаних середовищ була кількість сформованих з калюсної тканини пагонів та інтенсивність їх розвитку. Найкращі результати було отримано на модифікованому середовищі В5 при додаванні 1,0 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л ІМК та 0,05 мг/л ГК (рис. 5). При культивуванні калюсу цикорію на даному середовищі в середньому за генотипами 96,1% біомаси формувало пагони, а кількість сформованих бруньок на 30-тий день культивування досягала 22 штук на експлант. Слід зазначити і високу інтенсивність розвитку отриманих пагонів, які за вказаний період мали по три-чотири сформованих листочки, а за розмірами досягали 10-15 мм.

У весняний період органогенез проходив інтенсивніше, що очевидно пов'язано з біологічною активністю біоматеріалу, утворенням пластичних речовин, які відповідають за морфогенез.

На інтенсивність органогенезу калюсної тканини впливало і мінеральне живлення. На середовищі, в основу якого входили макро- і мікроелементи за прописом Гамборга, отримали істотно вищі результати (96,1% калюсних структур формували пагони), аніж на середовищі Мурасіге-Скуга (60,0% структур відповідно). Особливістю середовища MS є висока концентрація неорганічного азоту (амонійного і нітратного), яка, очевидно, пригнічує органогенез калюсної тканини цикорію коренеплідного.

Внесення до живильного середовища аденіну (5,0 мг/л) призводило до утворення додаткових адвентивних бруньок (25-30 шт.), які формувались як в результаті непрямого морфогенезу, так і після перенесення окремих бруньок на свіже живильне середовище.

Соматичний ембріоїдогенез -- це процес утворення зародкоподібних структур (ембріоїдів) нестатевим шляхом із соматичних клітин експланта. Ембріоїди -- це біполярні структури, які одночасно розвивають верхівковий та кореневий апекси. Для індукції ембріогенного калюсу та ембріоїдогенезу переважної більшості біовидів достатньо введення до живильного середовища ауксинового аналогу 2,4-Д (Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е., 1980; БутенкоР.Г., 1989; Шаяхметов И.Ф.. 1999; Фоменко Т.И., Бердичевец Л.Г., Малюш М.К., 2001; Кунах В.А., 2005). Відомо також, що введення до середовища цитокінину активізує клітинний поділ тканин гіпокотиля і вони формують калюс, в той час як деякі клітини підепідермального прошарку розвиваються в соматичні ембріоїди (Zung Z.R, 1985; Thorpe T.A., 1988; Sagare A.P., Lee Y.L., Lin T.C., 2000; Кунах В.А., 2005). У наших дослідженнях показано, що для отримання ембріогенного калюсу цикорію коренеплідного введення до середовища 2,4-Д було не достатнім. Живильне середовище довелося модифікувати і цитокінинами.

При використанні в якості експлантів проростків цикорію індукція ембріогенного калюсу відбувалася на живильних середовищах КЕ8 та КЕ13, а далі на середовищах Е7 та Е20 було індуковано формування соматичних ембріоїдів (табл. 5).

Таблиця 5

Інтенсивність формоутворення на різних етапах соматичного ембріоїдогенезу цикорію коренеплідного залежно від складу живильного середовища

Етап ембріоїдогенезу	Індекс середовища	Склад середовища	Інтенсивність формоутворення
Індукція ембріогенного калюсу	КЕ8	MS + 1,0 мг/л 2,4-Д, + 0,5 мг/л 6-БАП	+ +
	КЕ13	MS + 1,0 мг/л 2,4-Д, + 1,0 мг/л 6-БАП	+ + +
Індукція соматичних ембріоїдів	Е7	MS + 1,0 мг/л ІОК, + 1,0 мг/л 6-БАП	+ + +
	Е20	MS + 1,5 мг/л НОК, + 1,0 мг/л 6-БАП	+

Примітка: інтенсивність формування та розвитку: «+ + +» - висока; «+ +» - середня; «+» - низька.

У варіанті середовища Е20 формувалися лише поодинокі кластери ембріоїдів, а тривалість культивування від експланта до появи ембріоїдів у калюсній тканині складала 2-4 місяці. У варіанті Е7 ембріоїди утворювались протягом 1-2 місяців від початку культивування. Соматичні ембріоїди з'являлись на поверхні або в поверхневому прошарку калюсної тканини недиференційованих клітин у вигляді білих структур. Формування ембріоїдів починалося на окремій ділянці калюсу, а далі поступово поширювалось на всю площину калюсної тканини. Розвиток ембріоїдів характеризувався низкою морфологічних змін, у результаті яких проходило їх дозрівання. Модифіковане середовище Е7, до складу якого входили 5,0 мг/л гліцину, 2,0 мг/л глютаміну та 50,0 г/л сахарози, виявилось найефективнішим для формування вторинних ембріоїдів та підтримки ембріогенної тканини при пасажуванні.