Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

03.00.20 - біотехнологія

Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин

Яремчук Ірина Митодіївна

Львів 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин Української академії аграрних наук

Науковий керівник - доктор сільськогосподарських наук, професор Шаловило Степан Григорович, Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З. Ґжицького, завідувач кафедри технології виробництва молока і яловичини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Розгоні Іван Іванович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії ембріональної біотехнології

доктор сільськогосподарських наук, професор Шеремета Віктор Іванович, Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, професор кафедри розведення та генетики тварин імені М.А. Кравченка

Провідна установа - Державний науково - дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, лабораторія контролю дезінфектантів та антигельмінтиків, м. Львів.

Захист дисертації відбудеться “_15___”_травня__2007 р. о _10__ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий “_14_” _квітня_2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О. І.

1. Загальна характеристика роботи

заморожування ембріон рогатий худоба

Актуальність теми. Кріоконсервування ембріонів відкриває значні можливості для використання методу трансплантації ембріонів і його широкого впровадження у племінному тваринництві. Довготривале зберігання ембріонів дозволяє вирішити ряд теоретичних і практичних питань, зокрема, перевірку корів-донорів за якістю нащадків, збереження рідкісних порід і тих, що зникають, різних гібридних ліній, мутацій і особливо комбінацій, які можуть служити цінним матеріалом для генетичних досліджень, а також здійснити імпорт та експорт ембріонів (Зубець М.В., Буркат В.П., 1997, 2000; Безуглий М.Д., 1997; Шеремета В.І., 1997; J.E. Snijders, P. Dillon, 2000; R. Sartor, J.N. Guenther, 2000).

Кріоконсервування ембріонів пов'язане з тривалим перебуванням їх в екстремальних умовах зростаючої гіперосмолярності, що приводить до збільшення токсичності середовища і зниження життєздатності. На даний час не розроблено достатньо надійні методи заморожування ембріонів корів, які б відповідали запитам виробництва. Зроблені спроби скоротити період знаходження ембріонів в умовах гіперосмолярності середовища, що досягається, поряд із зменшенням тривалості еквілібрації клітин у середовищі кріоконсерванта, значним збільшенням швидкості їх охолодження шляхом прямого занурювання в рідкий азот (Rall W.F., Fahy G.M., 1985; Leibo S.P., 1989; Грищенко В.І., Осташко Ф.І., 1992; Massip A.P. зі співавторами, 1994; Ісаченко В.В., 1994; Шаловило С.Г., 1996). У цьому випадку, на думку авторів, відбувається вітрифікація рідких фаз ембріонів.

Однак, у процесах кріоконсервування ембріонів залишилось чимало невирішених питань, а дослідження з використання надшвидкого охолодження біологічних об'єктів, зокрема ембріонів, є поодинокими. Враховуючи перспективність напрямку кріоконсервування гамет, теоретичні, науково-виробничі дослідження, представлені у дисертації, спрямовані на створення високоефективних і простих у реалізації способів кріоконсервування ембріонів, які б відповідали сучасним вимогам виробництва. При надшвидкому заморожуванні можна досягти високої збереженості репродуктивних клітин шляхом застосування кріопротекторів ендо- і екзоцелюлярної дії та біологічно активних речовин, які володіють мембраностабілізуючою дією.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у лабораторії біології відтворення Інституту біології тварин УААН і є частиною науково-технічної програми УААН “Технології у молочному і м'ясному скотарстві”, підпрограми “Відтворення сільськогосподарських тварин” за темою “Удосконалення технології заморожування ембріонів методом вітрифікації” (01.02.06. ДР 0101 U 003421) на 2001-2005 рр. Автор є виконавцем підрозділів “Удосконалення середовищ для надшвидкого заморожування ембріонів шляхом додавання жиророзчинних вітамінів” та “Вивчення кріозахисної ефективності фосфоліпідів при додаванні їх у середовища для заморожування надшвидким методом”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було удосконалення технології кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби та розробка ефективних біологічних способів і практичних методів їх надшвидкого заморожування.

Для досягнення цієї мети було поставлено наступні завдання :

- дослідити кріозахисну ефективність композиційних кріопротекторів різнобічної кріозахисної дії залежно від їх концентрації;

- порівняти життєздатність і приживлення ембріонів, заморожених надшвидким методом на різних стадіях морфологічного розвитку;

- визначити ефективність використання мембраностабілізуючих речовин у складі кріоконсервантів при надшвидкому охолодженні ембріонів;

- вивчити антиоксиданту властивість препарату “Філомек” (фосфоліпідний комплекс із морських організмів) і вітаміну Е на життєздатність ембріонів корів-донорів;

- удосконалити середовища для заморожування і відтавання ембріонів з поєднанням у них різних кріопротекторів та мембраностабілізуючих речовин;

- провести порівняльну оцінку приживлення деконсервованих ембріонів, заморожених загальноприйнятим і надшвидким методами.

Об'єкт дослідження: морфологічна та функціональна здатність сперміїв і ембріонів у кріозахисних середовищах при надшвидкому заморожуванні.

Предмет дослідження: ембріони корів і мишей до і після кріоконсервування, показники сперми бугаїв-плідників після заморожування, середовища для вітрифікації, біохімічні показники крові корів-донорів.

Методи дослідження: експериментальні, лабораторні, кріобіологічні (дослідження кількісних та якісних показників ембріонів та сперміїв до і після кріоконсервування), біохімічні (активність ферментів, продукти перекисного окиснення ліпідів), та статистичні (біометрична обробка результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Науково обґрунтовано і запропоновано альтернативний існуючому ефективний метод переводу ембріонів у стан холодового анабіозу за допомогою надшвидкого охолодження з використанням композиційних кріопротекторів різнобічної кріозахисної дії, який дозволяє здійснювати кріоконсервуваня ембріонів у практичних умовах з мінімальними трудовими і фінансовими затратами. Встановлено, що ступінь морфофункціонального збереження ембріонів залежить від правильного поєднання надшвидкого заморожування і складу поліфункціонального кріоконсерванта.

Вперше доказано, що антиоксиданти і мембраностабілізуючі речовини (фосфоліпіди), як компоненти кріоконсерванта, мають ефективну дію при додаванні їх у середовища при надшвидкому заморожуванні ембріонів великої рогатої худоби. Запропоновано спосіб підвищення кількісних та якісних показників ембріонів, шляхом введення в організм корів-донорів вітаміну Е та фосфоліпідів, одержаних з морських організмів.

Розроблено і експериментально перевірено ефективний “Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів, заморожених надшвидким методом”.

Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено кріозахисні середовища, застосування яких покращує морфологічну якість деконсервованих ембріонів корів, а також підвищує їх приживлення після трансплантації тваринам-реципієнтам. Отримано нові дані про загальні закономірності кріопошкодження і кріозахист ембріонів в умовах надшвидкого заморожування та ефективність використання у вітрифікаційних середовищах композиційних кріопротекторів різнопланової кріозахисної дії.

Введення антиоксидантів в організм корів-донорів та мембраностабілізуючих речовин у вітрифікаційне середовище розширило існуючі уявлення про роль біохімічних факторів у реалізації кріозахисту ембріонів. На основі проведених досліджень розроблено нові, науково-обґрунтовані підходи до підвищення ефективності їх кріоконсервування, удосконалена економічно вигідна технологія надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби, яка забезпечує їх високу життєздатність після деконсервування та приживлення у реципієнтів.

Матеріали дисертаційної роботи увійшли до “Довідника з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби”, - Львів, 2004. - за редакцією доктора сільськогосподарських наук, професора С.Г. Шаловила.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем розроблено схеми і методи проведення експериментів у лабораторних та виробничих умовах. Проведено підбір та опрацювання першоджерел літератури за темою дисертаційної роботи, розроблено теоретичне обґрунтування щодо механізмів регуляції ембріогенезу після впливу кріотемператур, виконано експериментальні та аналітичні дослідження. Зроблено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковано результати досліджень. Планування наукової програми, аналіз та обговорення результатів досліджень проведено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на міжнародних науково-практичних конференціях: присвячена 120-річчю від часу заснування ветеринарної школи у Львові (Львів, 2001); присвячена 40-річчю створення Інституту біології тварин УААН (Львів, 2001); “Здобутки і перспективи ветеринарного акушерства”, присвячена великому вченому і педагогу, творцеві Міжнародної школи ветеринарних акушерів, професору Г.В. Звєрєвій (Львів, 2002); “Ведення тваринництва інтенсивними методами”, присвячена 55-річчю Інституту тваринництва НАН Білорусі (Гродно, 2004); всеукраїнська наукова конференція “Теорія і практика породотворного процесу в тваринництві України” (Київ, 2005); “Сучасні проблеми біохімії, фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин” (Дніпропетровськ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 9 наукових праць, у тому числі 6 - у фахових наукових виданнях, які рекомендовані ВАК України та отримано 1 патент на винахід.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури. Текст дисертації викладений на 160 сторінках комп'ютерного тексту, містить 18 таблиць (9 сторінок) і 18 рисунків (10 сторінок). Список використаної літератури включає 296 джерел, у тому числі 161 латиною.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури. Складається з 5 підрозділів, у яких наведено дані літератури стосовно заморожування ембріонів, використання кріопротекторів для їх кріозахисту, впливу різних факторів на вихід придатних ембріонів, їх життєздатність та приживлення деконсервованих ембріонів у реципієнтів.

Загальна методика та основні методи досліджень. Дослідження виконано у лабораторії біотехнології відтворення тварин Інституту біології тварин УААН, господарствах “Україна” Буського, “Правда” Бродівського районів Львівської області та ЛНВЦ “Західплемресурси”.

Експерименти проводили на коровах та телицях української чорно-рябої молочної породи та голштинізованої худоби європейської селекції. Вимивання ембріонів, їх пошук, морфологічну оцінку, підготовку до заморожування, кріоконсервування та пересадку ембріонів трансферабельних стадій розвитку телицям-реципієнтам проводили відповідно до запланованих досліджень. З метою відпрацювання методичних основ для експериментів з кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби, було проведено дослідження на ембріонах лабораторних мишей лінії СWВА за методом М.Манка (1990). Для індукції суперовуляції корів-донорів використовували схеми гормональної обробки згідно “Інструкції з трансплантації ембріонів” (Москва, 1987). Для вивчення антиоксидантної та мембраностабілізуючої дії біологічно активних речовин і підвищення виходу доброякісних ембріонів було відібрано, за методом аналогів, 4 групи тварин: три дослідних і одна контрольна по десять голів у кожній групі. Коровам-донорам І групи на 2 та 12 день естрального циклу під час гормональної обробки вводили внутрішньом'язово препарат “Філомек”. Тваринам другої групи, в ці ж дні статевого циклу, ін'єкували вітамін Е у дозі 200 мг на голову. Третій групі тварин вводили одночасно вітамін Е та “Філомек”. Контрольним тваринам вводили по 2 мл фізіологічного розчину. Кров для біохімічних досліджень відбирали з яремної вени корів-донорів на третій день після повторного введення в їх організм вітаміну Е та фосфоліпідного препарату “Філомек”. У крові донорів визначали активність глутатіонпероксидази за методом Моіна В.М. (1986); активність каталази за методом Королюка М.Л., Іванова Л.І. (1998); малоновий діальдегід за методом Коробейникова С.М. (1989); гідроперекисі ліпідів за методом Мирончика В.В. (1994).

Об'єктом дослідження були ембріони на стадії морули та бластоцисти до і після кріоконсервування. Для кріоконсервування були використані інтактні, морфологічно повноцінні ембріони мишей і корів, вимиті хірургічним та нехірургічним способами від суперовульованих донорів. Заморожування ембріонів проводили двома методами з метою порівняння їх ефективності.

Кріоконсервування ембріонів програмним методом у пайєтах проводили у середовищі ФСБ Дюльбекко з 1,4 М розчином гліцерину на заморожувачі ЗЕМ-3 виробництва Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (Харків). Для заморожування ембріонів надшвидким методом використовували два середовища: еквілібраційне та вітрифікаційне. Для приготування еквілібраційного середовища використовували 9 мл розчину Дюльбекко з вмістом 20,0 % фетальної сироватки та 1 мл гліцерину, що відповідає 1,4 М розчину гліцерину. Відмиті від забруднення ембріони витримували у цьому розчині 5-10 хвилин, після чого їх переносили у вітрифікаційне середовище. У процентному об'ємі вітрифікаційного середовища знаходилось 25,0 % гліцерину, 40,0 % сахарози та 35,0 % середовища для культивування з 20,0 % фетальною сироваткою теляти. Кріоконсервування надшвидким методом проводили шляхом прямого занурення пайєт з ембріонами у рідкий азот.

У залежності від поставленого завдання, до вітрифікаційного середовища для заморожування дослідних груп ембріонів додавали мембраностабілізуючі речовини, препарат “Філомек” і холін-хлорид. Перш ніж проводити експерименти з вивчення впливу препарату “Філомек” на ембріони, нами були проведені дослідження його дії на якість деконсервованої сперми бугаїв-плідників. Виживання сперміїв після розморожування оцінювали у відсотковому відношенні числа активно рухомих гамет після відтавання до числа активно рухомих сперміїв до заморожування.

Ембріони розморожували у водяній бані при температурі 38 єС до зникнення твердого або аморфного стану. З метою підвищення морфологічної якості і здатності до подальшого розвитку деконсервованих ембріонів корів до середовища для їх культивування після розморожування додавали мембраностабілізуючий препарат “Філомек” у концентрації 0,2 %. Придатні для трансплантації ембріони поміщали у пайєти і пересаджували телицям-реципієнтам. Рівень приживлення ембріонів визначали на 60-ий день після їх пересадки ректальною діагностикою реципієнтів.

Отримані цифрові дані опрацьовували статистично на персональному комп'ютері за допомогою програми Microsoft Office Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Визначення оптимальної концентрації кріопротекторів при надшвидкому заморожуванні ембріонів. У результаті опрацювання ряду наукових робіт і проведених власних пошуків, нами було розроблено 4 вітрифікаційних середовища з різними концентраціями гліцерину, сахарози та культурального середовища з фетальною сироваткою. Вимиті мишачі ембріони були поділені на 4 групи відповідно до розроблених середовищ. У результаті проведених досліджень встановлено, що для кріоконсервування ембріонів найбільш оптимальним є вітрифікаційне середовище, в якому міститься 20,0 % гліцерину, 30,0 % сахарози і 50,0 % культурального середовища з 20,0 % фетальною сироваткою теляти. У цьому середовищі відзначено найвище виживання ембріонів після розморожування (65,0 %), та високий відсоток приживлення пересаджених ембріонів (38,4 %). Ембріони, які залишилися життєздатними після заморожування і відтавання, морфологічно були нормальними, круглої форми, без пошкодженої прозорої оболонки, перивітеліновий простір прозорий, бластомери чіткі.

Одержані результати та аналіз літературних даних про мембраностабілізуючі властивості різних модифікацій кріопротекторів послужили підґрунтям для проведення наступних експериментів з кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби вищевказаним методом. Для заморожування відбирали ембріони з морфологічною оцінкою відмінні та добрі, які за розвитком відповідали компактним морулам, раннім і пізнім бластоцистам (табл. 1).

Таблиця 1 Життєздатність і приживлення ембріонів корів залежно від різної концентрації кріопротекторів у вітрифікаційному середовищі при надшвидкому заморожуванні

Найвищий рівень виживання ембріонів (77,2 %) був у вітрифікаційному середовищі, до складу якого входило 25,0 % гліцерину, 40,0 % сахарози та 35,0 % середовища для культивування. З збільшенням концентрації гліцерину і кількості сахарози суттєво знижувалась життєздатність ембріонів та їх приживлення у реципієнтів. Вітрифікація ембріонів у середовищі з різними комбінаціями кріопротекторів гліцерину та сахарози вказує, що цим шляхом можна досягти задовільних результатів.

Морфофункціональні властивості деконсервованих ембріонів, заморожених надшвидким методом, на різних стадіях розвитку та їх якості. Метою цих досліджень було заморожування ембріонів надшвидким методом на різних стадіях морфологічного розвитку з метою визначення показників функціонального стану клітин після завершення циклу заморожування-відтавання. Встановлено, що високу життєздатність після деконсервування зберігали ембріони майже на всіх стадіях розвитку. Із 88 деконсервованих ембріонів 76,1 % мали високу морфологічну оцінку і лише 23,9 % були з ознаками дегенерації. Приживлення пересаджених ембріонів становило 47,7 %.

Мікроскопічне дослідження морфоструктури ембріонів показало, що кріопошкодження зустрічаються в окремих бластомерів, а вид пошкоджень залежить від стадії розвитку ембріона. Так, із 20 компактних морул - 16 (80,0 %) зберегли нормальну морфологічну структуру, їх приживлення після трансплантації було найвищим і становило 56,2 %. Аналогічні результати отримані при заморожуванні ранніх і пізніх бластоцист. Після розморожування із 17 ранніх бластоцист придатними до пересадки реципієнтам виявилось 14 (82,3 %), а з 21 розмороженої пізньої бластоцисти - 17 (80,9 %). При трансплантації ембріонів реципієнтам отримані задовільні результати їх приживлення: 57,1 % та 52,9 % відповідно.

У наших дослідженнях спостерігалась відмінність у життєздатності ембріонів після розморожування, які при морфологічній оцінці перед кріоконсервуванням були відмінної, доброї, та задовільної якості (табл. 2). Із 12 морул відмінної якості після розморожування не виявлено ембріонів незадовільної якості. Ембріони з пошкодженою прозорою оболонкою, порушенням зв'язку між бластомерами класифікували, як задовільні. Від загальної кількості розморожених морул цей показник становив 16,6 %. Відмінних та добрих морул було по 41,7 %. Морули з оцінкою добрі до кріоконсервування, після розморожування були оцінені таким чином: доброї якості - 40,0 %, задовільної - 33,3 % і незадовільної - 26,7 %. Найбільшу кількість незадовільних морул - 55,5 % було отримано при заморожуванні задовільних ембріонів відповідної стадії. Від морул відмінної якості одержано 80,0 % тільних реципієнтів, доброї - 54,5 % і задовільної лише 27,3 %. Аналогічні результати отримані при кріоконсервуванні бластоцист різної якості. Після розморожування 18 відмінних бластоцист 8 із них (44,4 %), були оцінені як ембріони відмінної якості, 38,9 % були доброї якості і 16,7 % задовільної. Бластоцисти з морфологічною оцінкою добрі також успішно перенесли процес кріоконсервування і після розморожування зберегли досить високий рівень життєздатності. Більша половина таких ембріонів - 54,5 % були доброї якості і лише 18,2 % оцінені, як незадовільні і мали значні дефекти прозорої оболонки, рихле з'єднання між бластомерами.

Таблиця 2 Вплив якості ембріонів до заморожування на їх життєздатність після розморожування та приживлення при трансплантації

Встановлена тільність у 75,0 % реципієнтів після пересадки відмінних і відповідно 52,6 % і 23,1 % при використанні добрих і задовільних бластоцист.

Ембріони з морфологічною оцінкою задовільні недоцільно піддавати кріоконсервуванню, оскільки після розморожування більша половина з них були непридатними для пересадки. Такі ембріони економічно вигідно пересаджувати реципієнтам відразу після вимивання. У результаті дослідження встановлено, що найбільш оптимальними стадіями ембріонів для заморожування надшвидким методом є компактні морули, ранні та експандовані бластоцисти. Стадія розвитку ембріонів відіграє важливу роль у збереженні їх життєздатності під час заморожування і розморожування. Одержані нами результати підтверджують необхідність ретельної селекції ембріонів перед їх глибоким заморожуванням.

Використання мембраностабілізуючих речовин у середовищах при розморожуванні ембріонів та їх вплив на приживлення після трансплантації. Методичною особливістю цих досліджень було вивчення необхідності перебування ембріонів у середовищі, яке б сприяло відновленню можливих кріопошкоджень після впливу на них фізико-хімічних факторів, що виникають внаслідок глибокого заморожування. Для вияснення можливих шляхів адаптації ембріонів до надшвидкого охолодження, а також їх регенерації після розморожування, нами вивчався вплив препарату “Філомек”, який є природною субстанцією із тканин морських організмів на основі фосфоліпідного комплексу. Головним компонентом препарату є фосфатидилхолін (70,0 % лецитину). Цей препарат розроблений лабораторією технології біопрепаратів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України і який люб'язно був наданий нам для проведення досліджень.

Перш ніж проводити експерименти з вивчення впливу цього препарату на ембріони, проведені дослідження з вивчення його дії на якість деконсервованої сперми бугаїв-плідників. Препарат “Філомек”, у концентраціях від 0,1 до 1,0 %, додавали до деконсервованої у 2,9 % розчині лимоннокислого натрію сперми бугаїв-плідників. Контролем слугувала сперма, розморожена в 2,9 % розчині лимоннокислого натрію. Результати досліджень показали, що препарат “Філомек” у концентрації 0,2 % позитивно впливає на якість деконсервованої сперми. Виживання в годинах і показник абсолютного виживання у досліді дорівнював 13,15 0,24; 33,90 0,97, а у контролі - 10,45 0,27; 27,07 0,68 відповідно. Різниця на користь досліду високо вірогідна (р 0,001).

Отримані результати стали основою для проведення відповідних експериментів із культивування ембріонів корів після розморожування. Було сформовано одну контрольну і три дослідні групи ембріонів, які окремо переносили у середовище для культивування, до якого було додано різні концентрації (0,1 %; 0,2 %; 0,3 %) препарату “Філомек”. З метою розвитку регенераційних процесів у ембріонах у цих середовищах їх культивували при температурі 37 С протягом 36 годин. Найвищий відсоток виживання ембріонів (91,6 %) був у другій дослідній групі, де у середовище для культивування було введено препарат “Філомек” у 0,2 % концентрації. Додавання препарату у середовище привело до плавного повернення об'ємів бластомерів у їх вихідний стан та здатності ембріонів до подальшого розвитку. Наступним етапом наших досліджень було введення у середовище для короткотермінового культивування деконсервованих ембріонів (протягом 30-45 хвилин) 0,2 % концентрації препарату “Філомек” з подальшою трансплантацією ембріонів.

Ембріони контрольної групи, культивування яких проходило у середовищі без вищевказаного препарату, 78,5 % були доброякісними, а 21,5 % ембріонів мали часткове руйнування клітинної мембрани і були оцінені, як непридатні до пересадки. Рівень життєздатності та приживлення ембріонів дослідних груп був значно вищий і становив відповідно 90,9 % та 50,0 %, що на 13,6 відсотка більше, ніж у контрольній.

Такі результати дали нам підставу вважати, що фосфатидилхолін, який міститься у препараті “Філомек”, не тільки бере участь у клітинному механізмі регенерації мембран при їх кріопошкодженні, але, очевидно відновлює фізіологічні властивості ембріонів, що сприяє процесам приживлення їх у статевих шляхах реципієнтів.

Підвищення кількісних та якісних показників ембріонів при введенні в організм корів-донорів вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів. Результати проведених досліджень показали, що введення коровам-донорам дослідних груп вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів із морських організмів (препарат “Філомек”) позитивно вплинуло на поліовуляцію донорів та кількість і якість вимитих ембріонів (табл. 3).

Таблиця 3 Вплив препарату “Філомек” та вітаміну Е на якісні показники ембріонів

Примітка. Тут і надалі: * - р0,05; ** - р0,01; *** - р0,001 - різниці вірогідності у порівнянні з контролем

Відносно високий рівень реакції яєчників у корів-донорів, особливо третьої дослідної групи, можна пояснити очевидно тим, що під впливом вітаміну Е та фосфоліпідного комплексу підвищується реактивність організму тварин на гонадотропіни. Якщо рівень полі овуляції у контрольних тварин становив 7,660,82 жовтих тіл на одного донора, то у тварин І, ІІ та ІІІ дослідних груп відповідно - 9,141,08; 8,710,92; 9,370,85. Це, у свою чергу, сприяло одержанню більшої кількості ембріонів від дослідних донорів.

Вихід ембріонів на одного донора у контрольній групі тварин становив 4,670,32, тоді як у І та ІІ дослідних групах він склав 5,140,42 та 4,860,40 відповідно, а у корів ІІІ групи 5,870,48. Комплексне введення дослідним тваринам вітаміну Е та фосфоліпідів позитивно вплинуло на вихід морфологічно якісних ембріонів. Найбільшу їх кількість було одержано від корів-донорів третьої дослідної групи - 72,3 %, що на 11,5 % більше у порівнянні з контролем. Вихід якісних ембріонів на одного донора у тварин контрольної групи становив 2,830,25; І дослідної групи - 3,280,30; ІІ і ІІІ групах - 3,000,26; 4,250,40 відповідно.

Слід відзначити, що збільшення кількісних та покращення якісних показників ембріопродуктивності було більш виражено у корів-донорів ІІІ дослідної групи, яким комплексно вводили вітамін Е та фосфоліпідний комплекс “Філомек”. Основними показниками, які враховувались у подальших дослідженнях, були якість ембріонів до заморожування і після відтавання, збереженість і придатність їх до трансплантації та приживлення у реципієнтів. У результаті розморожування ембріонів встановлено, що рівень життєздатності ембріонів третьої дослідної групи був найвищий і становив 91,2%. У контролі цей показник становив 76,4 % і був нижчим на 6,2 %, 4,5 %, 14,8 % відповідно, ніж у дослідних групах. Приживлення ембріонів третьої групи становило 54,8 %, що на 16,4 % більше ніж у контролі.

Зміни, які виникають у репродуктивній системі корів-донорів при обробці гонадотропними препаратами, осіменінні та вимиванні ембріонів є технологічним стресом для тварин, який може супроводжуватися зростанням вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів у кров'яному руслі та зниженням активності антиоксидантних ферментів, що в свою чергу призводить до зниження вітаміну Е в організмі тварин. Одним із аспектів негативного впливу технологічного стресу на організм корів-донорів і, зокрема, на клітини крові, є інгібуюча дія вільних радикалів на ферментативну антиоксидантну систему.

Біохімічні дослідження крові корів-донорів першої, другої і третьої дослідних груп, показали, що показники антиоксидантного статусу були вірогідно вищими, ніж у крові контрольних тварин (табл. 4). Вміст гідроперекисів ліпідів у крові тварин контрольної групи був значно вищий, ніж у крові дослідних тварин. Введення в організм корів природного антиоксиданту вітаміну Е та фосфоліпідного препарату “Філомек” зменшує утворення продуктів перекисного окиснення ліпідів у крові у 1,7 рази, у порівнянні з контролем, та сприяє нормалізації обмінних процесів у репродуктивних органах тварин. Спільна антиокислювальна дія природного антиоксиданту і фосфоліпідів показала, що дія комплексу більш ефективна, ніж дія кожного із них окремо.

Таким чином, наше припущення щодо мембраностабілізуючої дії речовин та препаратів побічно підтверджено, оскільки зменшується перекисне окиснення ліпідів, яке сприяє порушенню мембран.

Таблиця 4 Активність ферментів антиоксидантного захисту та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у крові корів-донорів, (М±m)

Очевидно, фосфоліпіди спільно з природним антиоксидантом утворюють єдину систему захисту ліпідів від окиснення та регулюють інтенсивність перекисного окиснення ліпідів при стресах у бік нормалізації, тим самим створюють такі умови у репродуктивній системі тварин, які сприяють збільшенню виходу доброякісних ембріонів, підвищують їх здатність до кріоконсервування та покращують приживлення у реципієнтів.

Вплив композиційних кріопротекторів поліфункціональної дії на збереження ембріонів корів при надшвидкому заморожуванні. Враховуючи важливе значення цілісності цитоплазматичних мембран для нормальної життєдіяльності ембріонів та з метою зниження негативного впливу на них фізико-хімічних факторів, що реалізуються на етапах кріоконсервування ембріонів при надшвидкому охолодженні, нами розроблено вітрифікаційне середовище з композиційними кріопротекторами поліфункціональної дії. У склад кріоконсервантів окрім гліцерину і сахарози, було додано препарат “Філомек” у концентрації 0,2 %.

Ембріони дослідної групи, які заморожувались у середовищі з додаванням препарату “Філомек”, виявились більш стійкими до надшвидкого заморожування і після деконсервування нормально розвинених ембріонів було на 11,8 % більше, ніж у контролі. На нашу думку, це зумовлено швидшим включенням регенераційних процесів після розморожування, що сприяло нормалізації розвитку ембріонів. Рівень приживлення дослідних ембріонів у реципієнтів був значно вищий і становив 53,3 %, що більше на 14,9 %, ніж у контрольній групі. Це дає підставу стверджувати, що поряд із дією проникаючих і непроникаючих кріопротекторів, введення у кріоконсервант мембраностабілізуючих речовин має позитивний вплив на процес кріоконсервування ембріонів.

Введення препарату “Філомек” у склад кріоконсерванту для надшвидкого заморожування далеко не єдиний спосіб, який суттєво покращує підготовку ембріонів до прямого занурення у рідкий азот. Подальші дослідження були спрямовані для пошуку інших речовин і складників, які здатні збільшити в'язкість води при зниженні температури і зменшити ризик токсичного впливу високих концентрацій кріопротекторів на ембріони. Зокрема апробували у складі кріоконсерванта препарат холін-хлорид. Наявність метильних груп у молекулі цієї речовини обумовлює гідрофобний характер її взаємодії з біомакромолекулами, що сприяє реалізації кріозахисних властивостей холінів і підвищує ефективність традиційних кріопротекторів. Дози холін-хлориду підбиралися емпірично: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мг на 1 мл середовища. Дані таблиці 5 свідчать, що введення холін-хлориду в середовище для заморожування в цілому покращило якість відтаяних ембріонів, у третій дослідній групі морфологічно придатних було 92,3 % проти 80,0 % у контрольній групі. У четвертій дослідній групі виживання деконсервованих ембріонів значно зменшилося, що, очевидно, пов'язано з великою дозою препарату. Високі результати приживлення були отримані при пересадці ембріонів реципієнтам усіх дослідних груп. У третій дослідній групі цей показник був на 8,3 % вищим від контролю.

Таблиця 5 Результативність надшвидкого заморожування ембріонів корів з використанням у вітрифікаційному середовищі холін-хлориду

Отже, додавання холін-хлориду у вітрифікаційне середовище підвищує стійкість ембріонів до надшвидкого заморожування, що призводить до покращення приживлення деконсервованих ембріонів у реципієнтів.

Порівняльне вивчення приживлення деконсервованих ембріонів, заморожених загальноприйнятим і надшвидким методами. Для порівняльного вивчення приживлення деконсервованих ембріонів проводили їх заморожування загальноприйнятим - програмним методом та надшвидким з використанням багатокомпонентного кріоконсерванта (табл. 6). Контрольна група ембріонів була заморожена програмним методом, а дослідні групи ембріонів - надшвидким методом у запропонованих вище вітрифікаційних середовищах з додаванням до них мембраностабілізуючих речовин.

Таблиця 6 Життєздатність і приживлення ембріонів при заморожуванні програмним та надшвидким методами

Життєздатність деконсервованих ембріонів першої дослідної групи, які були заморожені надшвидким методом у вітрифікаційному середовищі без додавання мембраностабілізуючих речовин, була найнижчою і становила 80,0 % від кількості заморожених. При морфологічній оцінці ембріонів виявляли розірвані прозорі оболонки, стиснення бластомерів, їх некроз та включення у перивітеліновий простір. При застосуванні надшвидкого заморожування виживання ембріонів становило 80,0 - 91,6 %, а їх приживлення у реципієнтів 50,0 - 60,0 %.

Отже, отримані результати свідчать, що додавання до вітрифікаційного середовища, використаних у експериментах біологічно активних речовин, які мають мембраностабілізуючу дію, дає можливість підвищити результативність надшвидкого заморожування ембріонів.

Висновки

У дисертації теоретично обґрунтовано та подано нове вирішення доцільності кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби надшвидким методом з урахуванням їх стадій розвитку. Вивчено дію мембраностабілізуючих речовин у складі середовищ для заморожування і деконсервування, та вплив антиоксидантних препаратів при внутрішньом'язовому введенні донорам на ембріопродуктивність, життєздатність та приживлення ембріонів у реципієнтів.

1. Кріозахист репродуктивних клітин визначається вмістом у вітрифікаційному середовищі кріопротекторів ендо- і екзоцелюлярної дії та оптимальних швидкостей охолодження. Вітрифікаційне середовище з вмістом 25,0 % гліцерину і 40,0 % сахарози забезпечує 77,2 % життєздатності ембріонів великої рогатої худоби та 47,0 % їх приживлення у реципієнтів.

2. Оптимальними стадіями розвитку ембріонів для заморожування надшвидким методом є компактні морули, ранні та експандовані бластоцисти, трансплантація яких забезпечує приживлення у реципієнтів на рівні 52,0 - 57,0 %. При трансплантації ембріонів відмінної якості тільність реципієнтів досягає 80,0 %, доброї - 54,5 %, задовільної - 27,3 %.

3. Культивування ембріонів протягом 36 годин у середовищі з додаванням препарату “Філомек” у концентрації 0,2 %, забезпечує виражену мембраностабілізуючу та регенераційну дію, що дозволяє відновити до нормального рівня фізіологічні функції у 91,6 % ембріонів, дає можливість регенерувати пошкоджені, при кріоконсервуванні, компоненти мембран клітин, у результаті чого підвищується виживання ембріонів після розморожування на 16,6 %.

4. Короткотривале культивування деконсервованих ембріонів після заморожування надшвидким методом, у середовищі з фосфоліпідним комплексом “Філомек”, сприяє відновленню фізіологічних функцій ембріонів та підвищує їх приживлення після трансплантації на 13,6 %.

5. Комплексне внутрішньом'язове введення коровам-донорам під час гормональної обробки природного антиоксиданту вітаміну Е та фосфоліпідного препарату “Філомек” підвищує активність ферментів антиоксидантної системи: глутатіонпероксидази і каталази (р0,05 - 0,01), вірогідно зменшується утворення продуктів перекисного окиснення ліпідів (малоновий діальдегід р0,001), що забезпечує 72,3 % виходу повноцінних ембріонів, підвищує їх життєздатність після деконсервування до 91,2 % і приживлення у реципієнтів на рівні 54,8 %.

6. Введення до складу кріоконсерванта композиційних кріопротекторів поліфункціональної дії та мембраностабілізуючих речовин, зокрема, холін - хлориду у концентрації 0,3 % та препарату “Філомек” у концентрації 0,2 %, підвищує стійкість ембріонів до надшвидкого охолодження, забезпечує понад 90,0 % їх збереження після деконсервування та приживлення у реципієнтів на рівні 55,0 - 60,0 %.

7. Заморожування ембріонів надшвидким методом з використанням мембраностабілізуючих речовин (препарату “Філомек” та холін-хлориду) забезпечує 91,6 % їх збереження та 60,0 % приживлення у реципієнтів, при програмному заморожуванні відповідно - 84,6 і 54,5 %. Це вказує на доцільність широкого використання надшвидкого заморожування у технології трансплантації ембріонів великої рогатої худоби.

Пропозиції виробництву

1. Для підвищення життєздатності деконсервованих ембріонів та їх приживлення у реципієнтів доцільно, при заморожуванні ембріонів надшвидким методом, у середовищах для вітрифікації і культивування застосовувати мембраностабілізуючі речовини, зокрема, препарат “Філомек” та холін-хлорид у концентрації 0,2 % та 0,3 %.

2. З метою покращення кількісних та якісних показників ембріопродуктивності корів-донорів та підвищення стійкості ембріонів до кріоконсервування у схему гормональної обробки на 2 і 12 добу синхронізованого статевого циклу необхідно включати вітамін Е та препарат “Філомек” у дозі по 200 мг на голову.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби / В.П. Буркат, В.В. Влізло, Р.Й. Кравців, С.Г. Шаловило, М.М. Шаран, М.Д. Пасіцький, А.В. Мадіч, А.А. Гамота, Л.В. Мадісон, В.В. Мадісон, І.М. Яремчук, В.О. Дудчак / За ред. С.Г. Шаловила - Львів, 2004. - 150 с. (Автор брала участь в організації, впорядкуванні та редагуванні довідника, а також написанні розділів “Лабораторна робота з ембріонами”, “Морфологічна оцінка якості ембріонів”, “Культивування ембріонів”, “Кріоконсервування ембріонів”).

Яремчук І.М., Шаловило С.Г. Заморожування ембріонів надшвидким методом з використанням різних концентрацій кріопротекторів // Науковий вісник Львівської нац. академії вет. медицини ім. С.З. Ґжицького. - Львів, 2001. - Т. 3, №4, Вип. 3. - С. 115-119. (Дисертантом проведено визначення оптимальної концентрації кріопротекторів у середовищі для заморожування ембріонів мишей та корів).

Яремчук І.М. Морфофункціональні властивості деконсервованих ембріонів заморожених надшвидким методом на різних стадіях їх розвитку // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - Львів, 2001. - Вип. 1-2. - С. 307-309.

Яремчук І.М., Даценко З.М. Вплив фосфоліпідів на підвищення життєздатності деконсервованих ембріонів великої рогатої худоби // Науковий вісник Львівської нац. академії вет. медицини ім. С.З. Ґжицького. - Львів, 2002. - Т. 4, №3. - С. 125-129 (Дисертант особисто провела експериментальні дослідження, статистично опрацювала результати, проаналізувала отримані дані).

Яремчук І.М., Шаловило С.Г. Використання мембраностабілізуючих речовин у середовищах при розморожуванні ембріонів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - Львів, 2002. - Вип. 4, №1. - С. 171-173 (Дисертант особисто провела експериментальні дослідження, статистично опрацювала результати, проаналізувала отримані дані).

Яремчук И.М., Шаловило С.Г., Шаран Н.М. Усовершенствование среды для размораживания эмбрионов крупного рогатого скота // Сборник научно-технических трудов “К 55 - летию Института животноводства”. - РУП Институт животноводства НАН Беларуси. - Жодино, 2004. - Т. 36. - С. 170-173 (Дисертантом особисто проведено експериментальну частину, статистичну обробку результатів досліджень та їх аналіз).

Яремчук І.М., Шаловило С.Г. Підвищення кількісних та якісних показників ембріонів при введенні в організм корів-донорів вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів // Вісник Дніпропетровського ДАУ (науково-теоретичний, науково-практичний журнал). - 2006. - №1. - С. 114-116 (Дисертант особисто провела дослідження, виконала аналіз і узагальнила результати).

Яремчук І.М., Шаловило С.Г. Вплив композиційних кріопротекторів поліфункціональної дії на збереженість ембріонів корів при надшвидкому заморожуванні // Розведення і генетика тварин. - Київ, 2007. - Вип. 41. - С. 302-307 (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку отриманих результатів та їх аналіз).

Пат. 62361 А Україна, UА 7 А61D19/04. Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів заморожених надшвидким методом / І.М. Яремчук, С.Г. Шаловило, М.М. Шаран, М.Д. Пасіцький. - №2003032130; Заявлено 11.03.03; Опубл. 15.12. 03; Бюл. №12. - 2 с.

Анотація

Яремчук І.М. Надшвидке заморожування та відтавання ембріонів корів з використанням мембраностабілізуючих речовин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20.- біотехнологія. - Інститут біології тварин УААН. - Львів, 2007.

Дисертація присвячена вивченню впливу умов надшвидкого заморожування ембріонів великої рогатої худоби на їх морфофункціональні властивості, життєздатність та приживлення у реципієнтів. Встановлено, що вітрифікаційне середовище з вмістом у ньому 25,0 % гліцерину, 40,0 % сахарози та 35,0 % культурального середовища з 20,0 % фетальною сироваткою забезпечує 77,2 % життєздатності деконсервованих ембріонів та 47,0 % їх приживлення у реципієнтів. Оптимальними стадіями розвитку ембріонів для заморожування надшвидким методом є компактні морули, ранні та експандовані бластоцисти.

Розроблено та експериментально перевірено ефективний “Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів заморожених надшвидким методом”. Встановлено, що короткотривале культивування ембріонів після розморожування у середовищі для культивування з фосфоліпідним комплексом сприяє відновленню фізіологічних властивостей ембріонів та підвищує їх приживлення після трансплантації на 13,6 %.

Розроблено вітрифікаційне середовище з композиційними кріопротекторами поліфункціональної дії, вплив яких проявляється у забезпеченні нативних властивостей цитоплазматичних мембран у процесі дегідратації клітин. Додавання до складу середовища мембраностабілізуючих речовин, зокрема холін - хлориду у концентрації 0,3 % та препарату “Філомек” у концентрації 0,2 %, підвищує стійкість ембріонів до надшвидкого охолодження, забезпечує понад 90,0 % їх збереження після деконсервування та приживлення у реципієнтів на рівні 55,0 - 60,0 %.

Встановлено, що введення в організм корів-донорів під час гормональної обробки вітаміну Е та комплексу фосфоліпідів підвищує активність ферментів антиоксидантної системи, сприяє нормалізації обмінних процесів у репродуктивних органах тварин, забезпечує 72,3 % виходу повноцінних ембріонів, підвищує їх життєздатність після деконсервування до 91,2 % і приживлення у реципієнтів на рівні 54,8 %.

Ключові слова: корови-донори, ембріони, кріоконсервування, вітрифікаційне середовище, надшвидке заморожування, кріопротектори.

Аннотация

Яремчук И.М. Сверхбыстрое замораживание и оттаивание эмбрионов коров с использованием мембраностабилизирующих веществ. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук за специальностью 03.00.20. - биотехнология. - Институт биологии животных УААН. - Львов, 2007.

Диссертация посвящена изучению влияния условий сверхбыстрого замораживания эмбрионов крупного рогатого скота на их морфофункциональные свойства, жизнеспособность и приживление у реципиентов. Криозащита репродуктивных клеток определяется содержанием в витрификационной среде криопротекторов эндо - и экзоцелюлярного действия. Среда с содержанием в ней 25,0 % глицерина, 40,0 % сахарозы и 35,0 % культуральной среды с 20,0 % фетальной сывороткой обеспечивает 77,2 % жизнеспособности деконсервированных эмбрионов и 47,0 % их приживления у реципиентов.

Микроскопическое исследование морфоструктуры деконсервированных эмбрионов показало, что криоповреждения встречаются в отдельных бластомеров, а вид повреждений зависит от стадии развития эмбриона. Оптимальным возрастом эмбрионов для замораживания сверхбыстрым методом являются компактные морулы, ранние и экспандированные бластоцисты. Полученные результаты свидетельствуют о рациональности использования отличных и добрых эмбрионов для криоконсервирования и подтверждают необходимость тщательной их селекции перед глубоким замораживанием.

Разработан и экспериментально проверен эффективный “Способ повышения качества деконсервированных эмбрионов, замороженных сверхбыстрым методом”. Установлено, что кратковременное культивирование эмбрионов после размораживания в культуральной среде с фосфолипидным комплексом способствует возобновлению физиологических свойств и повышает их приживление после трансплантации на 13,6 %. Научная новизна подтверждена решением о выдаче декларационного патента на изобретение 62361 А Украина, UА 7 А61D19/04.

Учитывая важное значение целостности цитоплазматических мембран для нормальной жизнедеятельности эмбрионов и с целью снижения негативного влияния на них физико-химических факторов, которые реализуются на этапах криоконсервирования эмбрионов при сверхбыстром замораживании, разработана витрификационная среда с композиционными криопротекторами полифункционального действия. Мембраностабилизирующее действие компонентов криоконсерванта проявляется в обеспечении нативних свойств цитоплазматических мембран в процессе дегидратации клеток. Добавление в состав среды мембраностабилизирующих веществ, в частности, холин - хлорида в концентрации 0,3 % и препарата “Филомек” в концентрации 0,2 %, повышает стойкость эмбрионов к сверхбыстрому охлаждению, обеспечивает свыше 90,0 % их сохранения после деконсервирования и приживление у реципиентов на уровне 55,0 - 60,0 %. Это дает основание утверждать, что вместе с действием проникающих и непроникающих криопротекторов, введение в криоконсервант мембраностабилизирующих веществ позитивно влияет на процесс криоконсервирования эмбрионов и открывает новые пути повышения его эффективности.

Теоретически обосновано и установлено, что введение в организм коров-доноров во время гормональной обработки витамина Е и комплекса фосфолипидов повышает активность ферментов антиоксидантной системы: глутатионпероксидазы и каталазы (р0,05 - 0,01), в результате чего достоверно уменьшается образование продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид р0,001). Это способствует нормализации обменных процессов в репродуктивных органах животных, обеспечивает 72,3 % выхода полноценных эмбрионов, повышает их жизнеспособность после деконсервирования до 91,2 % и приживлення у реципиентов на уровне 54,8 %. Таким образом, в репродуктивной системе животных можно создать такие условия, которые способствуют увеличению выхода доброкачественных эмбрионов, повышают их способность к криоконсервированию и улучшают приживление у реципиентов.

Ключевые слова: коровы-доноры, эмбрионы, криоконсервирование, витрификационная среда, сверхбыстрое замораживание, криопротекторы.

Abstract

I.M. Yaremchuk. Ultra rapid freezing and thawing of bovine embryos using membranestabilizing substances. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree of agricultural sciences on the speciality 03.00.20. - biotechnology. - Institute of Animal Biology of UAAS. - L'viv, 2007.

The dissertation is dedicated to the study of the influence of conditions of the ultra rapid freezing of bovine embryos on their morphofunctional characteristics, viability and closing up with recipients. It has been improved the vitrification medium with the content of 25,0 % of glycerol, 40,0 % of sucrose and 35,0 % of cultural medium with 20,0 % fetal calf serum provides for 77,2 % of viability after cryopreservation embryos and 47,0 % of their closing up with recipients. The compact morula, early and expanded blastocysts are the optimal age of embryos' ultra rapid freezing.