Оптимізація технології отримання подвоєних гаплоїдів генотипів м’якої пшениці, що різняться за генами фотоперіодичної чутливості та тривалості яровизації

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

Оптимізація технології отримання подвоєних гаплоїдів генотипів м'якої пшениці, що різняться за генами фотоперіодичної чутливості (Ppd) та тривалості яровизації (Vrd)

Жосонар Марина Василівна

Одеса - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Південному біотехнологічному центрі в рослинництві Української академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Ігнатова Світлана Олександрівна, Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, завідуюча лабораторії культури тканин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Мілкус Борис Наумович Одеський аграрний університет Мінагрополітики України професор кафедри селекції, генетики і захисту рослин;

кандидат біологічних наук, доцент Теплицька Людмила Михайлівна Таврійський національний університет імені В.І. Вернадського МОН України доцент кафедри фізіології рослин і біотехнології

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова

Анотація

гаплоїд пшениця культивування

Жосонар М.В. Оптимізація технології отримання подвоєних гаплоїдів генотипів м'якої пшениці, що різняться за генами фотоперіодичної чутливості (Ppd) та тривалості яровизації (Vrd) - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, 2009.

Дисертація присвячена вивченню ефективності етапів гаплопродукційного процесу в культурі пиляків м'якої пшениці. В експеримент включено зразки, що різняться за генами росту й розвитку (Ppd і Vrd). Досліджено морфогенетичні реакції, у 35 генотипів - сортів, гібридів та ліній в умовах in vitro, що дозволило виділити генотипичні розходження за якісними і кількісними параметрами етапів гаплопродукції зразків, які відрізняються чутливістю до фотоперіоду та тривалістю яровизації. Визначено взаємозв'язок генетичних систем донорів Ppd і Vrd та структурних ознак рослин з умовами культивування пиляків, що збільшило ефективність гаплопродукційного процесу за виходом фертильних подвоєних гаплоїдів.

Встановлено вплив на індукцію андрогенезу генотипу донорних рослин, умов їх вирощування, місця розташування пиляків на рослині, певної фази розвитку мікроспор у пиляках та складу живильного середовища.

Показано, що частота формування новоутворень і регенерації рослин більше у генотипів із нетривалою яровизацією. Найбільшу кількість новоутворень отримано у ізогенної лінії Еритроспермум 604 з тривалістю яровизації 30 діб (Vrd2). За рівнем сформованих новоутворень та виходом з них зелених рослин виділено лінію сорту Mercia із заміщенням 2D хромосоми від сорту Ciano. Розробка біотехнологічних параметрів одержання гомозиготних регенерантів з гаплоїдів у культурі пиляків дозволило створити унікальний лінійний матеріал м'якої пшениці й виділити чотири генетичних джерела з високою гаплопродукційною здатністю.

Ключові слова: культура пиляків пшениці, морфогенез, етапи гаплопродукції, диплоїдизація гаплоїдів, системи генів Ppd й Vrd.

Аннотация

Жосонарь М.В. Оптимизация технологии получения удвоенных гаплоидов генотипов мягкой пшеницы, различающихся по генам фотопериодической чувствительности (Ppd) и продолжительности яровизации (Vrd) - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова, Одесса, 2009.

Диссертация посвящена изучению эффективности этапов гаплопродукционного процесса в культуре пыльников мягкой пшеницы. В эксперименты включены образцы, различающиеся по генам роста и развития (Ppd и Vrd). Исследование морфогенетических реакций, проявленных 35 генотипами - сортами, гибридами и линиями в условиях in vitro позволило выделить генотипические различия по качественным и количественным параметрам этапов гаплопродукции у образцов, отличающихся степенью фотопериодической чувствительности и требовательностью к продолжительности яровизации.

Изучение эффективности этапов морфогенеза в культуре пыльников in vitro проведено в зависимости от влияния разных факторов на генотипы-доноры и при воздействии различных факторов на изолированные пыльники в условиях культивирования. Определено взаимодействие генетических систем доноров Ppd и Vrd и структурных признаков растений с условиями культивирования пыльников, что увеличило эффективность гаплопродукционного процесса по выходу фертильных удвоенных гаплоидов. Показано развитие микроспор в пыльниках двух групп исследованных генотипов с разными системами генов, преимущественно по путям А и В спорофитной программы, успешная реализация которой, требует специфических условий in vitro. Установлено влияние на индукцию андрогенеза донорных растений, условий их выращивания, местоположения пыльников на растении, определённой фазы развития микроспор в пыльниках и состава питательной среды. Эффективность процесса повышалась в 2-7 раз в зависимости от генотипа при пяти дневной предобработке срезанных колосьев при температуре 2 ^оС в темноте и трёх дневной обработке изолированных пыльников в темноте при температуре 30 ^оС, на питательной среде 190-2М - 1,5 мг/л 2,4-Д, 400 мг/л пролина, 400 мг/л глутамина, 0,5 мг/л кинетина и регенерации растений на варианте питательной среды МS - 0,5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК, 200 мг/л пролина и 200 мг/л глутамина. Доминантные аллели генов продолжительности яровизации Vrd1 и Vrd2 линий сорта Эритроспермум 604 способствовали увеличению частоты формирования новообразований и регенерации растений. Показано позитивное влияние на регенерацию зелёных растений у сорта Mercia с замещённой 2D хромосомой. В разработанных условиях выявлено спонтанное возникновение удвоенных гаплоидов у исследованных сортообразцов пшеницы в пределах 25-69%. Разработка биотехнологических параметров получения гомозиготных регенерантов из гаплоидов в культуре пыльников позволила создать уникальный линейный материал мягкой пшеницы и выделить четыре генетических источника с высокой гаплопродукционной способностью.

Ключевые слова: культура пыльников пшеницы, морфогенез, этапы гаплопродукции, диплоидизация гаплоидов, системы генов Ppd и Vrd.

Summary

Gosonar M.V. Optimization technology of obtaining double haploids genotypes of common wheat on genes of wieh have difference for genes of photoperiod sensitivity (Ppd) and duration vernalization (Vrd). - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. degree for the speciality 03.00.20 - biotechnology. Odessa National University by I.I. Mechnikov, Odessa, 2009.

The thesis was devoted to studying of efficiency of the stages haploproduction process in anther culture of common wheat. The samples differing on genes of growth and development are included in experiments (Ppd and Vrd). Research of a morphogenic reactions shown by 35 genotypes - in conditions in vitro has allowed to allocate with cultivars, hybrids and lines genotypic distinctions on qualitative and quantitative parameters of stages haploproduction at the samples distinguished by a degree of photoperiodic sensitivity and insistence to duration vernalisation.

Dominant alleles of genes duration of vernalization Vrd 1 and Vrd 2 lines of cultivar Erytrospermum 604 promoted increase in frequency of developing newformation and regenerations of plants. Positive influence on regeneration of green plants of cutivar Mercia with replaced 2D a chromosome is shown. In the developed conditions spontaneous occurrence double haploids at investigated of samples cultivars of common wheat is revealed within the limits of 25-69 %. Development of biotechnological parameters of reception homozygous regenerants from haploids in anther culture has allowed to create unique linear material of common wheat and to allocate 4 genetic sources with high ability to haploproduction.

Key words: anther culture of common wheat, morphogenesis in vitro, haploids, stages of haploproduction process, diploidization.systems of genes Ppd and Vrd.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Важливими біотехнологіями, що отримали сьогодні широкий розвиток і практичне використання стосовно різних сільськогосподарських культур, є біотехнології на рівні гаплоїдних клітин та рослин. Одна з них - створення гаплоїдів на основі мікроспор, що розвиваються за спорофітною програмою, у системі культивування пиляків in vitro. Інша - одержання гаплоїдів за допомогою гаплопродюсерного методу, що базується на гаплоїдному ембріогенезі гібридного насіння при схрещуванні рослин з генотипом-гаплопродюсером й одержання гаплоїдних рослин в ембріокультурі in vitro. Ідея розробки цих технологій полягає у збагаченні сучасної селекції рослин допоміжними методами одержання гомозиготних ліній з гібридних популяцій з метою прискореного створення лінійних, достатньо продуктивних й високо адаптивних сортів економічно цінних злаків. На сьогодні гаплоїдні технології злаків отримали подальший розвиток у дослідженнях, спрямованих на вдосконалення їх базової основи - систем культивування клітин in vitro. Експериментальний андрогенез виявився успішним для м'якої пшениці, рису та інших культур. Проведені в останньому десятилітті в різних країнах дослідження увінчались тисячами отриманих у короткий термін, стабільних гомозиготних ліній цих видів, окремі з яких, виявили потенційні можливості для створення на їх основі більше 30 сортів пшениці й 80 сортів рису [Han, 1986; Pauk, 1995; Gosal, 1997; Bruins, 1998; Kartha, Graf, 1999; Дьячук, 2003]. Однак, незважаючи на успішні результати, багато проблемних питань, що торкаються цього біотехнологічного методу все ще не вирішено, і ефективної методики для індукції гаплоїдів шляхом культивування не створено. Дуже важливою є проблема залежності ефективності гаплопродукції в культурі пиляків м'якої пшениці від генотипу. У теперішній час виник новий підхід до вирішення цієї проблеми - з'ясовують ефективність гаплобіотехнології на донорах пшениці із чітко визначеними генетичними детермінантами [Шерер, 1992; Данилова, 2000; Torp, 2001]. Для підвищення ефективності гаплобіотехнології пшениці головними завданнями дослідників є забезпечення передбачуваності результатів при роботі з будь-яким генотипом і пошуки можливої активації їх морфогенетичної компетентності в умовах in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН у рамках ДНТП “Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.”, Дослідження провадили за напрямком підпрограми 01. Методи культури тканини й клітини сільськогосподарських рослин (номер державної реєстрації в Укр. ІНТЕІ - 0104U002695), а також - НТП “Сільськогосподарська біотехнологія 2006-2010 рр.”, (номер державної реєстрації - 0106U002674). Дослідження здійснювали у відповідності з підпрограмою “Розробити біотехнологію створення лінійного матеріалу з гібридів пшениці методом культури ізольованих мікроспор” (02.03).

Мета і завдання дослідження: Мета роботи полягала у вивченні морфогенетичного потенціалу форм м'якої пшениці, що розрізняються генетичними системами швидкості й типу розвитку (Ppd і Vrd), у культурі пиляків та розробці, на цій підставі, біотехнології ефективного отримання регенерантів шляхом оптимізуючих впливів.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити шляхи морфогенезу мікроспор за спорофітною програмою та визначити можливість прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків.

2. Визначити ефективність індукції новоутворень в умовах культивування in vitro пиляків озимої м'якої пшениці - сортів і гібридів, залежно від стадії розвитку мікроспор, умов вирощування донорного матеріалу, місця розташування досліджуваних пиляків у колосі та ярусної належності пагонів.

3. Виявити здатність новоутворень до регенерації рослин за використання в якості донорів пиляків пшениць різних генотипів та методів отримання подвоєних гаплоїдів.

4. Оптимізувати параметри проходження етапів морфогенезу досліджуваних генотипів за впливу різних факторів на ізольовані пиляки (рівень розвитку мікроспор у пиляках; попередня обробка донорних рослин; варіанти живильних середовищ і умов культивування) з метою збільшення ефективності гаплопродукційного процесу.

5. Визначити ефективність етапів гаплопродукції в культурі пиляків генотипів м'якої пшениці, що різняться алелями генів фотоперіодичної чутливості й тривалості яровизації.

Об'єкт дослідження: процес гаплопродукції in vitro в культурі пиляків злакових культур.

Предмет дослідження: етапи процесу гаплопродукції генотипів м'якої пшениці залежно від впливу абіотичних, трофічних та гормональних факторів на морфогенетичний потенціал мікроспор в умовах in vitro.

Методи дослідження: метод культури пиляків in vitro, світлова мікроскопія, мікрофотографія, цитологічні методи дослідження. Методи статистичного аналізу даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено вивчення андрогенезу в умовах in vitro у ліній і сортів, які містять домінантні та рецесивні алелі генів Ppd і Vrd. Виявлено, що в генотипів з нетривалим періодом яровизації (30 діб) частота формування рослин-регенерантів вище, ніж з тривалим. Вперше проведено вивчення андрогенезу в культурі пиляків генотипу озимої м'якої пшениці Mercia із заміщеними хромосомами по другій гомеологічній групі від сорту Ciano, що дозволило виявити вплив хромосом 2А, 2В, 2D на процес гаплопродукції, а, зокрема, хромосоми 2D - на збільшення регенерації зелених рослин. При вивченні процесу морфогенезу в пиляках генотипів різних сортів та гібридів м'якої пшениці вдосконалено комплекс умов, що включає добір матеріалу при певному рівні розвитку рослин-донорів, попередні температурні обробки пагонів з колоссям й ізольованими пиляками, варіанти живильного середовища та диплоїдизації гаплоїдних рослин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано оригінальний лінійний матеріал озимої м'якої пшениці на основі майже ізогенних ліній за генами Vrd сорту Еритроспермум 604 та заміщених ліній за генами Ppd-D1. Виділено генетичні джерела з високою здатністю до регенерації гаплоїдів, які рекомендовано для використання у якості партнерів при створенні гібридного матеріалу для селекційних цілей. Отримано патент на корисну модель «Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків». Рекомендовано як технологічний етап ввести тестування донорного матеріалу на етапах андрогенезу для досягнення максимальної ефективності процесу гаплопродукції будь-якого генетичного матеріалу. Видано методичні рекомендації «Отримання подвоєних гаплоїдів м'якої пшениці в культурі пиляків».

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проведено інформаційний пошук, та у представленому огляді зроблено аналіз літературних даних щодо розвитку й практичного використання методів гаплоїдії. Планування й проведення експериментів, обговорення, аналіз, інтерпретація даних проводилась разом з керівником д.б.н. Ігнатовою С.О. і к.б.н. Файтом В.І. Автором особисто сформульовано основну мету досліджень і робочу гіпотезу, проведено методичні експерименти. В процесі роботи над матеріалом дисертації розроблено методичні рекомендації з використання розробок у практиці одержання гаплоїдів пшениці, сформульовано основні висновки і опубліковано наукові статті. Написання дисертації та її оформлення здійснено автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на Міжнародному симпозіумі «Biotechnology aproaches for exploitation and preservation of plant resouerces» (Yalta, 2002); Всеукраїнській конференції молодих вчених (Київ, 2002); 8-й Міжнародній конференції «Біологія клітин рослин in vitro і біотехнологія» (Саратов, 2003); Міжнародній конференції молодих вчених (Харків, 2003); IV Міжнародній конференції «Геном рослин» (Одеса, 2003); ІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів (Львів, 2006).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у чотирьох статтях спеціалізованих видань і шести тезах, представлених у збірниках матеріалів конференцій. Отримано патент на корисну модель. Видано методичні рекомендації.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках комп'ютерного тексту. Складається із вступу, 5 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, що включає 190 найменувань, у тому числі 139 - іноземними мовами, і 7 додатків. Таблиць - 21, рисунків - 26.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури

Гаплоїдія - як природний феномен і основа біотехнологій для одержання гомозиготних ліній важливих сільськогосподарських рослин

У розділі представлений аналіз літературних даних, що відбивають ретроспективу розвитку гаплоїдних біотехнологій, які використовуються в цей час у світі для селекційно-генетичного поліпшення економічно важливих оброблюваних рослин, і, зокрема, пшениці. Наведено наявні в літературі дані, що стосуються біологічної природи феномену гаплоїдії і його значення, як основи гаплоїдних методів. Описано шляхи вдосконалення методу культивування пиляків in vitro при його використанні на пшениці. Представлено дані вивчення різних факторів, що впливають на рівень ефективності біотехнологічної системи одержання гомозиготних ліній злаків за допомогою культури пиляків.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження з культури пиляків пшениці проводили за наведеною схемою експерименту (рис. 1.).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Схема етапів роботи з культури пиляків in vitro м'якої пшениці

У роботі використані озимі сорти, форми й гібриди м'якої пшениці, які розрізнялися за чутливістю до фотоперіоду й тривалістю яровизації, люб'язно надані відділом генетики Селекційно генетичного інституту - Національного центру насінництва та сортовивчення (СГІ - НЦНС), 12 генотипів, що характеризуються сильним ступенем фотоперіодичної чутливості, 5- середнім і 16 - слабким. Були використані популяції F₁ яро-озимих гібридів: сорту Superb (канадської селекції) з лініями 5/20-91, 1/74-91 та з сортом Вимпел одеський. А також популяції міжсортових гібридів F₂: Чайка х Avalon, Одеська червоноколоса х Мercia, Одеська 16 х Ciano, і гібрид між сортом Еритроспермум 604 і рекомбінантною лінією Capelle.

Матеріалом дослідження також були набори майже ізогенних ліній за системою генів тривалості яровизації (Vrd) сорту Еритроспермум 604 та ізогенні лінії за системою генів фотоперіодичної чутливості (Ррd-А1) сорту Миронівська 808, створені в СГІ - НЦНС [Файт, 2003]. Використано заміщені лінії, що відрізняються від сортів Avalon, Ciano, Mercia, Norman, Brimstoune, Brigand за системою генів Ppd-D1 [Балашова, 2002], і лінії сорту Mercia із заміщенням по хромосомах 2A, 2B і 2D [Worland, 2001].

Донорні рослини вирощували в польових умовах у 2001-2004 роках. В умовах штучного клімату яровизацію паростків озимих форм пшениці проводили при температурі 2 єС і цілодобовому освітленні протягом 40-60 діб в кліматичній камері. Після яровизації рослини вирощували при 16-годинному фотоперіоді, інтенсивності освітлення 10 тис. люкс і температурному режимі: 22-24 єС вдень і 18-20 єС вночі.

У дослідах з вивчення попередніх обробок донорного матеріалу зрізані колосся різних сортів і гібридів пшениці, поміщене у воду, витримувалося у темряві при температурі 2 єС протягом певних проміжків часу: 2, 4, 7 і 10 діб. Далі асептично виділяли пиляки, поміщали на тверде живильне середовище й культивували в стандартних умовах - у темряві при температурі 24-26 єС. У дослідах з вивчення впливу місця розташування пиляків на рослині досліджували чутливість генотипів залежно від ярусу продуктивних пагонів і частини колосу. У дослідах з вивчення впливу стадії розвитку мікроспор пиляки висаджували на живильне середовище в ранній та пізній фазах. За висадки пиляки з одного колосу поміщали в окрему пробірку. Для можливості прогнозування рівня чутливості генотипу до андрогенезу in vitro проводили тестування морфогенезу мікроспор в процесі їх розвитку за спорофітною програмою на першому етапі культивування пиляків. Тестування проводилось шляхом випадкового добору з пробірки 10 пиляків, які використовували для приготування тимчасових оцетокармінових препаратів. На предметне скло клали 3-4 пиляка в краплю оцетокарміну, скальпелем роздрібнювали їх до кашоподібної маси, накривали покривним склом і злегка натискали. При попаданні повітря між предметним та покривним склом добавляли краплю 45 % оцтової кислоти. Виготовлені препарати досліджували під мікроскопом при збільшенні окуляра 10Х і об'єктиву 10Х. В 10 полях зору підраховували кількість мікроспор, що розвиваються за спорофітним шляхом, розбиваючи їх на класи за морфологією - багатоядерні, багатоклітинні, ембріоїдоподібні. Кожний генотип досліджували темпорально три рази: через 10, 15 та 20-25 діб культивування in vitro. До ембріогенних пиляків відносили візуально змінені зовні за розміром й формою пиляки, скручені з опуклостями, готові розтріснутися. Новоутвореннями вважали візуально спостережувані макроструктури, що з'явилися з ембріогенних пиляків.

У дослідженнях використовували три основні живильні середовища: Potato-2 [Chen, 1976], 190-2 [Wang, 1984] і MS [Murashige, Skoog, 1964], а також на їх основі варіанти у нашій модифікації. Для вивчення впливу якісного спектру світла на пиляки і новоутворення, що культивуються, сортів Фантазія одеська й Еритроспермум 604 на первинному живильному середовищі 190-2 й середовищі MS на етапі регенерації, їх інкубували в темряві, на світлі й під світлофільтрами: червоним (600 нм) або синім (468 нм) при температурі 24 єС. Новоутворення, що приступили до регенерації, поміщали в рідке живильне середовище MS з половинним вмістом солей в умовах 10-годинного фотоперіоду і зниженої температури - 9 єС вночі й 12 єС вдень.

Диплоїдизацію рослин проводили, коли регенеранти добре розкущились і утворили розвинену кореневу систему, в умовах культивування на рідкому живильному середовищі з додаванням 0,03 % колхіцину, протягом 10 діб при вище вказаній температурі та фотоперіоді. Після проведення диплоїдизації, рослини висаджували в ґрунт і яровизували протягом 40-60 діб. Потім рослини дорощували в умовах штучного клімату, зазначених вище.

Цитологічні спостереження проводили на тимчасових мікроскопічних препаратах, забарвлених оцетокарміном відповідно до загальноприйнятої методики Паушевої [1988].

Математичну обробку отриманих результатів проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Доспехов, 1965]. Отримані дані наведено як середнє арифметичне та похибка середньої. Вибірка в середньому складала десять колосів з десяти рослин.

Ефективність гаплопродукційного процесу в культурі пиляків in vitro у генотипів озимої м'якої пшениці залежно від впливу різних факторів на донорні рослини й пиляки, оптимізація етапів процесу

Дослідження шляхів морфогенезу мікроспор у культурі пиляків сортів озимої м'якої пшениці з метою розробки системи попереднього тестування генотипів на чутливість в умовах in vitro. Проведено аналіз індукції й розвитку морфогенезу мікроспор у пиляках двох пар різних генотипів, що різняться за чутливістю до андрогенезу in vitro. Визначено головні шляхи андрогенезу А, В, С, що проходять за спорофітною програмою розвитку мікроспор у пиляках, які культивуються. Однак, за темпами проходження подій, характерних для всіх шляхів андрогенезу і за окремими деталями, що виявились при вивченні життєздатності різних типів мікроструктур, які виникають у пиляках, була представлена порівняльна оцінка подій, що відбувались в пиляках на всіх фазах культивування до 35-40 доби. На цій підставі виявилося можливим скласти прогноз результативності етапу індукції у досліджених генотипів. Після одержання регенерантів і вивчення їхнього рівня плоїдності й насіннєвої продуктивності колосся, можна судити про гаплопродукційну здатність генотипу в цілому. Виявлені вище описані закономірності ми пропонуємо використовувати за необхідності одержання орієнтовного прогнозу чутливості гібридних популяцій в умовах in vitro.

Вивчення індукції й розвитку процесу морфогенезу в пиляках пшениці залежно від фази розвитку мікроспор, місця розташування пиляків на рослині й умов вирощування донорного матеріалу. Вивчення впливу фізіологічного стану донорного генотипу на чутливість у культурі пиляків злакових культур, визначило його важливим для кінцевого результату. Багато в чому його прояв залежить від умов вирощування рослин. Несприятливі умови культивування рослин можуть призводити до стерильності зрілого пилка, і впливати на весь фізіологічний статус донора в фазі вакуолізації мікроспор. При вирощуванні донорів у польових умовах і в умовах оранжереї, нами, на трьох колекційних сортах, що характеризуються сильним ступенем фотоперіодичної чутливості (ФПЧ), виявлено, що умови оранжереї не сприяли індукції шляхів морфогенезу в пиляках, дослідженої групи генотипів за спорофітною програмою розвитку (табл. 1).

Таблиця 1. Вплив умов вирощування донорного матеріалу озимої м'якої пшениці на результативність етапів гаплопродукції в культурі пиляків

* - різниця між показниками окремого генотипу за різних умов вирощування достовірна при Р<0,05

Одним з факторів, що визначає успішний старт спорофітної програми розвитку мікроспор в пиляках злаків у культурі in vitro, є фаза їх розвитку [Круглова, 2002]. При роботі з набором генотипів пшениці, що розрізняються за чутливістю до фотоперіоду і за вимогливістю до тривалості періоду яровизації, а також з яро-озимими гібридними формами м'якої пшениці, одним із перших завдань досліджень було - простежити вплив стадії розвитку мікроспор у пиляках донорів на ембріоїдогенез у культурі in vitro. Це здійснено на прикладі трьох комбінацій яро-озимих гібридів F₁. Виявлено, що кількість ембріогенних пиляків і новоутворень підвищувалась, коли пиляки поміщали на живильне середовище на пізній фазі вакуолізації мікроспор.

Вивчення морфогенетичної активності мікроспор в культурі пиляків з різних частин колосcя у генотипів пшениці показало, що якщо гібрид, або сорт здатний утворювати новоутворення, то це властиво, тією чи іншою мірою, і кожній з частин його колосся. Найбільша результативність індукції новоутворень виявлялася у пиляках з середньої частини колосу.

Проведено вивчення рівня «біотехнологічної цінності» продуктивних пагонів за чутливістю їх пиляків у культурі in vitro, виходячи із черговості виходу їх з вузла кущіння, і зроблена спроба виділення впливу ярусності колосся на результативність процесу гаплопродукції всієї рослини за рівнем ембріогенності пиляків. Виявлено, що пиляки колосся перших двох ярусів володіли вірогідно більшою ембріогенною здатністю, ніж пиляки з колосся третього ярусу. Відмінності за ембріогенною здатністю пиляків колосся різних ярусів у даних генотипів пшениці можуть бути обумовлені екологічними факторами вирощування рослин конкретного календарного року, а саме, неоднаковим впливом стресових температурно-світлових режимів на рослини в різні стадії формування частин колосся й, зокрема, у період формування органів генеративної сфери. Як наслідок - різниця у рівні ендогенних гормонів у пиляках колосся різних ярусів, що вступають у комплекс із екзогенним гормональним рівнем та іншими компонентами живильного середовища при культивуванні, могла у такий спосіб відобразитись на результатах досліду.

Стресовий вплив низькими позитивними температурами на пиляки перед їх інокуляцією на живильне середовище сприяє переключенню гаметофітної програми розвиту спорогенних клітин пиляка на спорофітну і дозволяє підвищити ефективність андрогенезу in vitro [Батыгина, 2002]. В ході досліджень вивчено вплив тривалості попередньої обробки в темряві при температурі 2 єС зрізаних пагонів з колоссям чотирьох яро-озимих гібридів пшениці на частоту формування новоутворень у пиляках. Показано, що попередня обробка тривалістю більше семи днів була неефективною для успішного проходження індукційних етапів, і навіть знижувала гаплопродукційну здатність генотипів.

Вплив різних факторів на пиляки ізольовані з колосся генотипів м'якої пшениці, що культивуються в умовах in vitro. Вивчено можливість використання на етапі індукції двох прописів живильних середовищ - 190-2 і Рotato-2, що найчастіше використовують різні автори для роботи з м'якою пшеницею . Живильне середовище 190-2 виявилось більш сприятливим, ніж Рotato-2, для всіх досліджених генотипів пшениці. Запропоноване додавання в первинне живильне середовище 190-2 - 1,5 мг/л 2,4 дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д), 400 мг/л проліну й 400 мг/л глутаміну, а також 0,5 мг/л кінетину дозволило збільшити вихід новоутворень і зелених рослин (табл. 2).

Таблиця 2. Результативність етапів гаплопродукції у генотипів озимої пшениці на модифікованому живильному середовищі

* - різниця між показниками окремого генотипу за різного складу живильного середовища достовірна при Р<0,05

Примітка: 190-2М - модифіковане живильне середовище

Для регенерації рослин зі структур, що утворилися у культурі пиляків пшениці, розроблено оптимальний варіант МS живильного середовища в нашій модифікації - пролін 200 мг/л, глутамін 200 мг/л, індолілоцтова кислота (ІОК) 0,1 мг/л, кінетин 0,5 мг/л. При застосуванні запропонованих модифікацій ефективність культури пиляків м'якої пшениці підвищилась у 2-7 разів залежно від генотипу.

Отже, в результаті проведених досліджень підібрано оптимальні умови для отримання подвоєних гаплоїдів в культурі пиляків in vitro м'якої пшениці.

Ефективність етапів гаплопродукції в культурі пиляків різних колекційних зразків озимої м'якої пшениці, що розрізняються за фотоперіодичною чутливістю й потребою до тривалості яровизації

Гаплопродукційна здатність генотипів, що розрізняються за фотоперіодичною чутливістю (Ppd) й тривалістю яровизації (Vrd). Отримані результати роботи в методичних експериментах, метою яких було вивчення окремих факторів, що впливають через генотип на проходження етапів гаплопродукційоного процесу в культурі пиляків сортів і ліній м'якої пшениці, а також проведення оптимізації варіантів живильних середовищ і умов прямого впливу на пиляки, використано в подальших експериментах з вивчення ефективності етапів морфогенезу і впливу окремих систем генів росту і розвитку пшениці на реалізацію морфогенетичного потенціалу мікроспор. Так, проведено вивчення проходження гаплопродукційоного процесу у сортів озимої пшениці англійської селекції, із присутністю генів, що обумовлюють сильний ступінь ФПЧ, і заміщених ліній цих сортів, що містять гени Ppd-D1а із слабкою ФПЧ (табл. 3).

Таблиця 3. Показники гаплопродукції генотипів озимої м'якої пшениці, що містять різні алелі гену Ppd-D1

* - різниця між показниками сорту та лінії одного генотипу достовірна при Р<0,05

Незважаючи на різний рівень показників етапів процесу гаплопродукції у зразків, що можна пояснити впливом їхніх генотипів, виявилась загальна тенденція: зразки сортів, що характеризуються рецесивним алелем гену, мали підвищений рівень досліджених показників, у порівнянні зі зразками, що мають домінантний алель гену Ppd-D1a.

У наступній серії експериментів на колекційних зразках, що відрізняються за тривалістю яровизації, проведено вивчення гаплопродукції в культурі пиляків майже ізогенних ліній, за системою генів Vrd сорту Еритроспермум 604. Виявилось, що майже ізогенні лінії за системою генів Vrd, виділились як більш чутливі при культивуванні їхніх пиляків, у порівнянні з сортом, а його лінія, із присутністю домінантного алеля Vrd 2, характеризувалась і найвищим рівнем сформованих у пиляках новоутворень.

Представлені дані показують, що система генів Vrd, уведених у генотипи озимої м'якої пшениці, позитивно впливає на проходження етапів гаплопродукційного процесу в культурі пиляків, особливо на регенераційну здатність отриманих новоутворень.

При вивченні генотипових особливостей відгуку в культурі in vitro сортів і ліній озимої пшениці, що різняться за чутливістю до фотоперіоду та тривалістю яровизації (ТЯ), створених у різних зонах оброблення цієї культури, визначено ефективність гаплопродукції тринадцяти колекційних зразків з даними ознаками. В цілому, за отриманими даними, можна відзначити диференційовану генотипову специфічність у вивчених зразків, за розглянутими показниками гаплопродукції. Відзначено тенденцію до збільшення даних показників у генотипів слабко чутливих до фотоперіоду з нетривалим періодом яровизації - в 30-40 діб.

У середньому, група слабко чутливих до фотоперіоду генотипів, характеризувалась достовірно більш високими показниками вивчених ознак, у порівнянні з групою генотипів сильно чутливих до фотоперіоду.

Проте, розходження в потребі до тривалості яровизації не відзначалось на частоті новоутворень.

Але при цьому, генотипи з 30-40 добовою потребою в яровизації, характеризувались достовірно найбільш високою частотою регенерації і виходом з їх новоутворень зелених рослин, у порівнянні з групою генотипів, яким для переходу до розвитку генеративних органів необхідна 50-60 добова яровизація. Ефективність гаплопродукційного процесу в культурі пиляків заміщених ліній м'якої пшениці за хромосомами 2А, 2В та 2D. При вивченні гаплопродукційної здатності у трьох ліній озимої м'якої пшениці англійського сорту Mercia, що відрізняються від вихідного сорту, заміщеними хромосомами 2А, 2В і 2D з мексиканського ярого сорту м'якої пшениці Ciano (висока гаплопродукційна здатність), відзначено, що мікроспори в пиляках всіх, вивчених у наборі генотипів, тією чи іншою мірою, реалізували свій морфогенетичний потенціал у культурі пиляків. (табл. 4).

Таблиця 4. Ефективність етапів гаплопродукції сорту озимої пшениці Mercia у порівнянні з його заміщеними лініями

* - різниця між генотипами достовірна при Р<0,05

Кращою за всіма показниками гаплопродукційного процесу виявилась лінія із заміщенням у геномі 2D хромосоми, у якої визначена локалізація домінантного гену Ppd-D1a, що характеризує слабку ФПЧ. Вона показала значне збільшення морфогенетичних показників на всіх трьох етапах процесу, у порівнянні з іншими генотипами, і, особливо, у порівнянні з лінією із заміщеною 2А хромосомою. Рівень показника «кількість ембріогенних пиляків», у заміщеної по 2D хромосомі лінії, перевершив даний показник вихідного сорту Mercia в три рази. Трохи вище цього, була перевага лінії із заміщенням 2D хромосоми по кількості сформованих новоутворень. За частотою загальної регенерації рослин ця лінія перевищила всі зразки даного набору і значно переважала по виходу зелених рослин: у порівнянні із сортом - в чотири рази, перевершивши інші лінії по цьому показнику, майже в десять разів. Таким чином, лінію сорту Mercia із заміщенням 2D хромосоми, можна використовувати як генетичне джерело підвищеної гаплопродукційної здатності для генотипів що не володіють нею.

Вся проведена експериментально-методична робота з оптимізації етапів гаплопродукції в культурі пиляків пшениці представлена на рисунку 2.

Рис. 2. Оптимізація процесу одержання подвоєних гаплоїдів озимої м'якої пшениці на основі культури пиляків in vitro

Таким чином, отримані результати дозволили провести оптимізацію етапів даної системи in vitro і стали основою для її вдосконалення з метою використання для одержання подвоєних гаплоїдів м'якої пшениці генотипів з важливими для селекції генетичними ознаками.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичні та практичні результати досліджень морфогенетичних реакцій в культурі пиляків in vitro м'якої пшениці, що дозволило виділити позитивні особливості вивчених генотипів за якісними і кількісними параметрами гаплопродукції. Визначено вплив генетичних систем Ppd і Vrd рослин-донорів на ефективність гаплопродукційного процесу (кількість фертильних подвоєних гаплоїдів) в культурі пиляків озимої м'якої пшениці.

1. На основі проведених біотехнологічних досліджень процесу гаплопродукції в культурі пиляків in vitro встановлено вплив на індукцію андрогенезу умов вирощування донорних рослин, місця розташування пиляків на рослині та фази розвитку мікроспор у пиляках.

2. Оптимізовано умови попередньої обробки зрізаного колосся донорних рослин - п'ять діб, у темряві за температури 2 °С та обробки ізольованих пиляків на протязі трьох діб при температурі 30 °С. Модифіковано живильні середовища: 190-2 для культивування пиляків (190-2М) з додаванням 1,5 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л кінетину, 400 мг/л проліну і 400 мг/л глутаміну і МS для регенерації рослин із 0,5 мг/л кінетину, 0,1 мг/л ІОК, 200 мг/л проліну і 200 мг/л глутаміну. При застосуванні запропонованих модифікацій ефективність культури пиляків м'якої пшениці підвищилась у 2-7 разів залежно від генотипу.

3. У генотипів із нетривалим періодом яровизації виявлено високий рівень показників «частота формування новоутворень» і «регенерація рослин». Найбільшу кількість новоутворень 7,31 0,29 % отримано у ізогенної лінії Еритроспермум 604 з тривалістю яровизації 30 діб (Vrd 2).

4. Виявлено позитивний зв'язок між ефективністю гаплопродукції та нечутливістю до фотоперіоду генотипів озимої м'якої пшениці англійської селекції. Визначено загальну тенденцію: зразки сортів з рецесивним алелем гену, під контролем якого знаходиться сильна ФПЧ, мали підвищений рівень досліджених показників, у порівнянні зі зразками, що мають домінантний алель гену Ppd-D1a - слабка фотоперіодична чутливість.

5. За рівнем сформованих новоутворень та виходом з них зелених рослин виділено лінію сорту Mercia із заміщенням 2D хромосоми від сорту Ciano, яка в три і чотири рази, відповідно, перевищувала даний показник вихідного сорту Mercia, та являє собою генетичне джерело гаплопродукційної здатності серед зразків озимої м'якої пшениці.

6. У досліджених тринадцяти зразків сортів пшениці виявлено спонтанне виникнення подвоєних гаплоїдів у межах 25-69 %. Застосування колхіцину виявилось неефективним, у порівнянні зі спонтанною диплоїдизацією гаплоїдних рослин.

Практичні рекомендації

1. Розроблений комплекс умов, що включає добір матеріалу при певному рівні розвитку рослин-донорів, попередні температурні обробки пагонів з колоссям та ізольованими пиляками, а також модифікованих варіантів живильного середовища для ефективного проходження етапів гаплоплопродукційного процесу в культурі пиляків м'якої пшениці, рекомендується використовувати з метою прискореного створення гомозиготних ліній з популяцій гібридного й сортового матеріалу озимої м'якої пшениці.

2. Для збільшення чутливості до умов in vitro у культурі пиляків м'якої пшениці, рекомендується використовувати виділені в експериментах чотири генетичних джерела - сорти Чайка, Одеська червоноколоса, Маra, лінія Mercia із заміщеною хромосомою 2D від сорту Ciano, що володіють високою гаплопродукційною здатністю й високим виходом спонтанно подвоєних фертильних форм з підвищеною насіннєвою продуктивністю.

3. Рекомендуються для використання у селекційному процесі та генетичних дослідженнях 147 гомозиготних ліній, отриманих з гібридних і сортових популяцій озимої м'якої пшениці.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Ігнатова С.О. Прогнозування відгуку генотипів озимої м'якої пшениці в культурі пиляків на основі тестування етапів морфогенезу / С. О. Ігнатова, В.І. Файт, М.В. Жосонар, О.Л. Шестопал // Аграрний вісник Причорномор'я. - Одеса, 2002. - № 18. - С. 14-17.

2. Жосонарь М.В. Регенерационная способность различных по продолжительности яровизации и фотопереодической чувствительности сортов озимой пшеницы в культуре пыльников in vitro / М.В. Жосонарь, С.А. Игнатова, В.И. Файт, В.Р. Фёдорова // Вісник Харківського національного аграрного університету. - Харків, Серія: біологія. - 2004. - Вип. 2 (5). - С. 79-83.

3. Жосонарь М.В. Гаплопродукционная способность в культуре пыльников сортов и линий озимой мягкой пшеницы, различающихся по генам роста и развития / М.В. Жосонарь // Вісник Харківського національного аграрного університету. - 2005. - Вип. 2, (7). - С. 94-99.

4. Лобанова К.І. Шляхи реалізації регенераційного потенціалу в культурі пиляків у різних генотипів озимої м'якої пшениці / К.І. Лобанова, М.В. Жосонар С.О. Ігнатова // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 52-57.

5. Пат. 33983 Україна МПК (2006) А01Н 1/04 Спосіб прогнозування гаплопродукційної здатності генотипів озимої м'якої пшениці на основі цитологічного моніторингу першого етапу культури пиляків in vitro / Ігнатова С.О., Шестопал О.Л., Лобанова К.І., Жосонар М.В.; заявник і патентовласник Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН. - № u200801382; заявка - 04.02.2008; опубл. 25.07.2008, Бюл. № 14.

6. Ігнатова С.О. Отримання подвоєних гаплоїдів м'якої пшениці в культурі пиляків / С.О. Ігнатова, М.В. Жосонар, К.І. Лобанова. - Одеса: Півден. біотехнолог. центр в рослинництві УААН., 2008. - 12 с. - (Методичні рекомендації).

7. Жосонар М.В. Вивчення ефективності етапів морфогенезу в культурі пиляків / М.В. Жосонар, О.Л. Шестопал // Засади сталого розвитку аграрної галузі: Мат. всеукр. конф. молодих вчених, 28-30 жовтня 2002 р. - Київ, 2002. - С. 124-125.

8. Ignatova S.A. The micropropagation in anther culture of wheat - possible way multiplication of obtaining gjmjzigous forms / S.A. Ignatova, M.V. Jhosonar // Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources: International Conference, 26-31 may 2002.: abstracts. - Yalta, Ukraine, 2002. - P. 20.

9. Jhosonar M.V. Intensity morphogenes microspores in anther culture common wheat and approaches to forecast of haploproduction / S.A. Ignatova, M.V. Jhosonar // The biology of plant cell in vitro and Biotechnology: VIII International Conference, 9-13 sept. 2003.: abstracts. - Saratov, 2003. - P. 380.

10. Жосонарь М.В. Регенерационная способность сортов озимой мягкой пшеницы в культуре пыльников / М.В. Жосонарь, С.А. Игнатова, В.И. Файт // Геном растений: IV Междунар. конф., 10-13 июня 2003 г.: тезисы докл. - Одесса, 2003. - С. 53.

11. Жосонарь М.В. Влияние системы генов Vrd на гаплопродукцию озимой мягкой пшеницы / Жосонарь М.В. // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: Тр. II Междунар. конф. молодых учёных, 19-23 мая 2003 г.: тезисы докл. - Харьков, 2003. - С. 37.

12. Жосонар М.В. Типи макроструктур та їх регенераційна здатність у культурі пиляків м'якої пшениці / М.В. Жосонар, К.І. Лобанова, С.О. Ігнатова // Молодь та поступ біології: ІІ Міжнародна наукова конф. студентів та аспірантів, 21-24 березня 2006 г.: зб. тез. - Львів,. 2006 - С. 337-338.

Размещено на Allbest.ru