Мікроміцети зерна вівса, їх токсигенні властивості та вплив фумонізину В1 на курчат

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

МІКРОМІЦЕТИ ЗЕРНА ВІВСА, ЇХ ТОКСИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ТА ВПЛИВ ФУМОНІЗИНУ В1 НА КУРЧАТ

Спеціальність: Ветеринарна мікробіологія та вірусологія

БІЛАН АНДРІЙ ВАЛЕРІЙОВИЧ

Одеса, 2009 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Овес є однією з цінних зернових культур в годівлі сільськогосподарських тварин, а продукти його промислової переробки використовуються в харчуванні людей, косметологічній та фармацевтичній галузях. Це культура помірного клімату, не вибаглива до тепла, більш поширена в зонах Полісся і Лісостепу.

Різні види мікроскопічних грибів, в тому числі і токсигенні, можуть вражати зернові культури, в тому числі і зерно вівса, тому існує небезпека накопичення в ньому мікотоксинів. Споживання такого зерна сільськогосподарськими тваринами призводить до розвитку мікотоксикозів, які характеризуються зниженням продуктивності та загибеллю тварин (Саркисов А.Х., 1954, Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985).

В Україні періодично діагностуються випадки фузаріотоксикозів у сільськогосподарських тварин та птиці, що викликані споживанням кормів, контамінованих Т-2 та F-2 токсинами. Вони зареєстровані у Київській, Кіровоградській, Вінницькій, Миколаївській, Харківській, Черкаській та Одеській областях, де поряд із токсинами, причетними до захворювання кормів, були виявлені фузарії - продуценти цих токсинів (Рухляда В.В., 2002, Котик А. М., 1999). Останнім часом значна увага приділяється токсинам гриба Fusarium moniliforme у зв'язку із захворюванням конячих на лейкоенцефаломаляцію, набряком легенів у свиней, а також первісним раком стравоходу та гепато- і кардіотоксичністю у людей. Цей гриб продукує ряд фузаріотоксинів, серед яких найбільш важливими є моніліформін (Cole R.J. et al., 1973) та фумонізин (Gelderblom W.C.A. et al., 1988), який вважається причиною захворювання коней та свиней (Harrison L.R. et al., 1990., Ross P.F. et al., 1990). Проте в нашій країні ці токсини майже не вивчалися, хоча токсичні штами гриба були виявлені на зернових, в тому числі і на зерні вівса (Леонов А.Н. та ін., 1991, Погребняк Л.І. та ін., 1998, Харченко С.М., 2003, Труфанова В.О., 2004).

До теперішнього часу цілеспрямованого вивчення мікобіоти зерна вівса не проводилося, тому ще не встановлені види мікроміцетів, що контамінують зерно цієї культури. Не встановлене зональне розповсюдження грибів на зерні вівса і не вивчені види мікотоксинів, які вони продукують. Також залишаються ще невивченими окремі питання біосинтезу, біологічної дії фузаріотоксинів гриба Fusarium moniliforme та профілактики. Тому вивчення зазначених питань є актуальним і буде сприяти покращанню діагностики та профілактики цих фузаріотоксикозів сільськогосподарських тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є розділом науково-дослідної роботи кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського національного аграрного університету ”Вивчення ролі мікроскопічних грибів та їх метаболітів у патології сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації 0103U004470).

Мета роботи - вивчення розповсюдження мікроміцетів на зерні вівса в різних регіонах України, визначення їх токсичних властивостей, дослідження біосинтезу моніліформіну та фумонізину Вэ грибом Fusarium moniliforme, біологічного впливу фумонізину В1 на організм курчат і протективної дії мікосорбу за фумонізин-токсикозу.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

- вивчити кількісний та якісний склад мікобіоти зерна вівса урожаю 2004-2005 років з різних регіонів України;

- дослідити токсичні властивості грибів родів Fusarium та Aspergillus та види мікотоксинів, що вони продукують;

- вивчити вплив факторів зовнішнього середовища на біосинтез моніліформіну та фумонізину Вэ грибом Fusarium moniliforme;

- провести дослідження з вивчення дії культуральної рідини гриба F. moniliforme на організм білих мишей, а також вплив фумонізину В1 на курчат і протективну дію мікосорбу;

- розробити експрес-метод визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати F-2 токсин.

Об'єкт дослідження - мікобіота зерна вівса та біосинтез мікотоксинів.

Предмет дослідження - мікроміцети зерна віса, їх токсигенні властивості та вплив фумонізину Вэ на курчат. Мікотоксини, біохімічні, патолого-анатомічні та гістологічні показники як критерії оцінки токсичного впливу моніліформіну та фумонізину Вэ та протективної дії мікосорбу щодо впливу токсинів.

Методи дослідження. Мікологічні - визначення кількісного та якісного складу епіфітної та ендофітної мікобіоти зерна вівса. Мікотоксикологічні - вивчення здатності виділених грибів продукувати мікотоксини. Клінічні та біохімічні - дослідження показників клінічного статусу та активності аспарагінової трансферази (АСТ), аланінової трансферази (АЛТ), загальної лактатдегідрогенази (ЛДГзаг) та її серцевої фракції - (ЛДГ1), загальної лужної фосфатази (ЛФ) та її кісткового й кишкового ізоферментів, вміст загального, ультрафільтрованого, іонізованого, нейтрального та білокзв'язаного кальцію та рівень сечовини і креатиніну. Патолого-анатомічні та гістологічні - вивчення характеру морфологічних змін в організмі тварин за мікотоксикозів та математично-статистичний метод - для опрацювання отриманих експериментальних даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлений кількісний та якісний склад мікобіоти зерна вівса з різних регіонів України та виявлена достовірна різниця у контамінації грибами родів Aspergillus та Penicillium в зонах Полісся, Лісостепу та Степу.

Серед грибів роду Fusarium встановлені продуценти Т-2 токсину, зеараленону, моніліформіну, фумонізину Вэ, фузарину С та фузарієвої кислоти, а серед грибів роду Aspergillus - продуценти коєвої кислоти. Вперше на території України встановлена здатність гриба Alternaria alternatа синтезувати фумонізин В1.

Встановлені зміни морфологічного та біохімічного складу крові коней за хронічного фузаріотоксикозу та впливу культуральної рідини F. moniliforme на білих мишей.

Експериментально доведено, що фумонізин В1 у курчат спричинив розвиток гепатозу та порушення мінерального обміну, а використання мікосорбу покращувало біохімічні показники та зменшувало негативний вплив токсину на печінку курчат. Новизна розробленого експрес-методу визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати F-2 токсин (зеараленон), підтверджена деклараційним патентом на корисну модель №200508728 від 15.02.2006 “Спосіб експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати F-2 токсин”.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена забрудненість зерна вівса з різних регіонів України мікроміцетами, в тому числі грибами роду Fusarium, що продукують різні фузаріотоксини - Т-2 токсин, F-2 токсин (зеараленон), моніліформін, фумонізин Вэ, фузарин С та фузарієву кислоту, грибами роду Aspergillus - продуцентами коєвої кислоти, що допоможе прогнозувати можливий розвиток мікотоксикозів.

Визначені оптимальні режими біосинтезу моніліформіну та фумонізину Вэ будуть використовуватися для напрацювання токсинів і постановки дослідів та отримання стандартів для мікотоксикологічних досліджень кормів. Встановлені зміни морфологічного та біохімічного складу крові коней за хронічного фузаріотоксикозу будуть використані для діагностики захворювання. Згодовування мікосорбу курчатам в кількості 2% на кг. корму зменшує негативний вплив мікотоксинів на організм птиці, що можна використовувати для профілактики фузаріотоксикозу.

Розроблений експрес-метод визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати F-2 токсин, який придатний для застосування у районних та обласних лабораторіях ветеринарної медицини країни, а також у Республіканській державній лабораторії ветеринарної медицини АР Крим та наукових установах під час діагностики фузаріотоксикозів сільськогосподарських тварин.

Отримані результати досліджень застосовуються в навчальному процесі під час підготовки фахівців ветеринарної медицини у Білоцерківському національному аграрному університеті та у наукових дослідженнях ветеринарних і токсикологічних лабораторій.

Особистий внесок дисертанта. Здобувач розглянув та проаналізував вітчизняні та іноземні літературні джерела з теми дисертаційної роботи, розробив плани та схеми і виконав експериментальні дослідження, провів статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз, узагальнення та сформулював висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на міжнародній науково-практичній конференції “Наукові та практичні аспекти ветеринарної медицини в Україні” (Білоцерківський ДАУ, м. Біла Церква, 2006), V державній науковій конференції аспірантів та докторантів “Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті” (Біла Церква, 2006), V державній науково-практичній конференції “Аграрна наука - виробництву: сучасні проблеми ветеринарної медицини” (Біла Церква, 2006), VI державній науково-практичній конференції “Аграрна наука - виробництву: сучасні проблеми ветеринарної медицини” (Біла Церква, 2007), науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної фармакології, токсикології і фармації” (УААН НАУ, м. Київ, 2006), VI науково-практичній конференції молодих вчених, аспірантів та докторантів “Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті” (Біла Церква, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових статей у фахових виданнях, а саме 4 статті у “Віснику Білоцерківського ДАУ” (2007, 2008), по одній у “Науковому віснику НАУ” (2007), та “Ветеринарній біотехнології” ІВМ (2007 р.), а також 8 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи.

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, загальної методики та основних методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел і додатків. Робота містить 5 розділів, викладена на 125 сторінках комп'ютерного набору, містить 23 таблиці та 15 рисунків. Список літератури включає 227 джерел, з яких 112 - іноземних авторів.

2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Мікроміцети зерна вівса. Мікологічними дослідженнями встановлено, що в одному грамі зерна урожаїв двох років кількість колонієутворювальних одиниць (КУО) коливалась в межах від 1,8 ? 10 до 8,7 ? 104 і в середньому становила 1,78 ? 104 ± 4,55 ? 10.

100 зразків зерна було виділено 562 культури грибів, віднесених до 2-х класів 9 родів, 418 з яких були ідентифіковані і представлені 16-ма видами і 4-ма різновидами. Найчастіше на зерні вівса зустрічалися представники родів Alternaria (92%), Mucor і Aspergillus (по 81%), Fusarium (77%) та Penicilium (39%). Щодо зонального розповсюдження, то в зоні Полісся Alternaria alternate виділялася з усіх проб та з 82 і 91% проб відповідно зон Лісостепу та Степу. Другими за частотою розповсюдження були мукоральні гриби, представлені двома родами Mucor та Absidia, вони найчастіше зустрічалися в зерні із зони Степу та Лісостепу і рідше - із зони Полісся. З такою ж частотою на зерні вівса виявляли гриби роду Aspergillus, їх знаходили в усіх пробах зони Степу, трохи рідше у зоні Лісостепу та зрідка на Поліссі. Перший переважав у регіоні Степу, рідше виділяли у зоні Лісостепу та зрідка на Поліссі. Aspergillus niger зустрічався рідше попередніх, хоча в зоні Степу його знаходили в половині досліджених проб, а в зоні Полісся - у третині зразків і зрідка в Лісостепу. Aspergillus terreus теж переважав у регіоні Степу, а в інших зонах був ізольований у поодиноких випадках, а єдиний ізолят гриба Aspergillus ohraceus був виділений в зерні вівса, вирощеного у зоні Степу. Вони представлені п'ятьма видами і найчастіше зустрічалися види Aspergillus flavus та Aspergillus fumigatus, що були знайдені в усіх пробах зони Степу, рідше - Лісостепу та у двох третинах проб з Полісся (табл. 1).

Таблиця 1. - Частота контамінації мікроміцетами зерна вівса в різних зонах України:

Фузарії також належать до широко розповсюджених грибів, їх найчастіше знаходили у пробах зерна поліської зони, а також у двох третинах зразків зі степової і лісостепової зон. Серед них домінував вид F.sporotrichiella та два його варіанти var. poae та var. tricinctum, що на Поліссі та в Степу були виділені з двох третин досліджених проб та з третини зразків із Лісостепу. Види F.moniliforme та F.oxysporum зустрічалися значно рідше, особливо в зоні Лісостепу, більша кількість їх була ізольована із проб степового регіону. Всі інші види були виділені у зразках зерна поліської зони. Пеніциліі зустрічалися у половині досліджуваних проб зерна лісостепового регіону, та дещо рідше в зонах Полісся та Степу.

Вивчення токсигенних властивостей виділених грибів.

Токсикологічними дослідженнями за мікробіологічним тестом встановлено, що зі 42 культур фузаріїв токсичними властивостями володіли 14 культур, в тому числі три культури двох видів F. oxysporum та F. moniliforme, дві - виду F. sporotrichiella і одна F. semitectum. Чотири культури виду F. sporotrichiella та F. sporotrichiella var. poae, дві культури F. moniliforme і по одній F. semitectum і F. sambucinum були слаботоксичними, а решта - атоксичними.

Із 74 досліджених культур грибів роду Fusarium Т-2 токсин продукували 9, у тому числі по 2 культури грибів виду F. semitectum, F. sporotrichiella та F. sporotrichiella var. poae і по одній культурі грибів F. sambucinum var. minus, F. sporotrichiella var. tricinctum та Fusarium spp.. Три культури двох видів F. oxysporum та F. moniliforme і F. moniliforme var. lactis продукували не ідентифіковані трихотеценові мікотоксини. F-2 токсин (зеараленон) продукували 9 ізолятів чотирьох видів, фузарієву кислоту - 8 культур трьох видів та трьох різновидів, моніліформін - 13 культур трьох видів та одного різновиду і фузарин С - 4 культури двох видів і одного різновиду. Нами вперше на Україні була встановлена здатність трьох культур F. moniliforme var. lactis, по дві F. oxysporum і F. moniliforme та двох Alternaria alternatа продукувати фумонізин В. Нами також досліджено 20 культур A. flavus на здатність синтезувати афлатоксини з негативним результатом, і лише половина з них продукували коєву кислоту. З метою виявлення потенційних продуцентів моніліформіну та фумонізинів були проведені дослідження токсичності культуральної рідини 21 ізоляту грибів роду Fusarium біопробою. Для цього гриби культивували на 20 мл. середовища Чапека-Докса у 50 мл. колбах протягом двох тижнів за температури 24°С та впродовж однієї доби за 4°С, і культуральну рідину вводили білим мишам внутрішньочеревно в дозі 0,5 мл. Взагалі ж, із 53 встановлених токсин-продукуючих ізолятів фузаріїв 11 культур синтезували одночасно по декілька видів токсинів: зеараленон, моніліформін, фумонізин (табл. 2).

Таблиця 2. - Токсиноутворення грибів роду Fusarium:

Дослідження показали, що культуральна рідина 13 ізолятів, у тому числі семи культур виду F. moniliforme, по два F. oxysporum і F. semitectum та по одному F. culmorum і F. gibbosum спричинила загибель мишей в перші три доби. Під час гістологічного дослідження серця мишей, загиблих від культуральної рідини F. moniliforme, встановили виражений набряк строми, повнокрів'я судин міокарду та відсутність поперечної посмугованості в кардіоміоцитах, а також надриви та розриви м'язових волокон, а в печінці - гостру застійну гіперемію та гепатит. Аналогічні зміни, за даними ряду дослідників (Kriek N.P.J. et al., 1977, Fan L.L. et al., 1991), відмічені за підгострого токсикозу, викликаного дією моніліформіну та фумонізину В. Вивчення впливу факторів зовнішнього середовища на біосинтез токсинів грибом F. moniliforme Sheldon та напрацювання фумонізину Вэ.

Дослідження питань біосинтезу моніліформіну та фумонізину В штамами 608/2 та 1170/5 F. moniliforme на 10 зернових субстратах показали, що найбільше моніліформіну виявили в зерні пшениці та ячменю, а фумонізину В - в зерні пшениці та рису. Дещо менший вміст токсинів був в зерні вівса, гречки, проса та кукурудзи, і токсини не виявляли в зерні сої, насінні соняшнику, а моніліформіну - ще й у горосі.

Щодо впливу вологості, то найкращій синтез моніліформіну відбувався на рисі за вологості від 50 до 70%, а фумонізину В - 50-60%. За 20%-ної вологості ріст мікроміцетів не спостерігався, а за 80%-ної вологісті фумонізину В не виявлено.

Дослідженням впливу температури на токсиноутворення було встановлено, що температура 24°С сприяла найкращому росту міцелію, і синтез токсинів обома штамами був найкращим, але штам 1170/5 продукував більше фумонізину В ніж штам 608/2. За температури 10°С ріст грибів був задовільним і продукція токсинів була дещо меншою. За температури 4 та 37°С ріст був майже непомітним і обидва штами гриба F. moniliforme не продукували токсини за температури 37°С.

Отримані результати були використані для напрацювання фумонізину В з метою постановки досліду на курчатах. Для цього штам 1170/5 F. moniliforme вирощували на зерні пшениці протягом трьох тижнів у матрацах. Субстрат висушували, подрібнювали та екстрагували сумішшю ацетонітрил-вода (1:1) і розчинник випаровували. Оскільки штам 1170/5 F. moniliforme продукував фумонізин В і моніліформін, провели їх розподіл виходячи з вивченої хроматографічної рухливості обох токсинів у різних розчинниках. Для цього залишок розчинили в суміші етанол-вода (3:1), в яку переходив лише фумонізин В, а моніліформін залишився в екстракті, що було підтверджено методом ТШХ.

Окрім того, наявність та кількість фумонізину В в розчині підтвердили методом ІФА у хіміко-токсикологічному відділі Державного науково-дослідного інституту діагностики і ветсанекспертизи м. Київ.

Вивчення впливу фумонізину В на організм курчат та протективної дії мікосорбу. У досліді були використані 3 групи курчат п'ятитижневого віку по 10 голів у кожній, живою масою 208 ± 3 грами. Курчатам першої групи щоденно задавали перорально по 8,0 мг. фумонізину В у 5%-ному водному етанолі, курчата другої групи отримували таку ж дозу токсину і мікосорб у кількості 2% на кілограм корму, курчата контрольної групи отримували лише комбікорм. У птахів, що споживали фумонізин В1, спостерігали незначне пригнічення та періодичне розрідження калових мас. У курчат, які отримували токсин і мікосорб, починаючи з другого тижня, встановлювали дещо більші середньодобові прирости у порівнянні з контрольною групою. Біохімічними дослідженнями крові курчат встановлено, що активність загальної лужної фосфатази під впливом фумонізину В спочатку досліду дещо знизилася і становила 679,6 ± 38,6 Од/л. Наприкінці другого тижня вона зросла до 1003 ± 22,7 Од/л за рахунок кісткового ізоферменту (736,6 ± 15,84 Од/л), а потім знову зменшилась до 667,3 ± 22,1 Од/л. У курчат, що отримували токсин і мікосорб, зміни носили аналогічний характер, але вони були значно слабше виражені, тоді як у контрольній групі відмічали поступове підвищення активності ферменту (рис. 1 А).

Активність кишкового ізоферменту у курчат дослідних груп в кінці першого тижня була вдвічі нижча (100,6 ± 9,0 Од/л), а впродовж другого і третього тижнів зросла відповідно до 269,6 ± 12,6 та 283,6 ± 24,7, а у птиць, що отримували мікосорб, - до 136,3 ± 15,27 та 188,6 ± 19,2 Од/л. У курчат контрольної групи встановлювали поступове зниження активності з 199,6 ± 19,0 до 122,3 ± 2,6 Од/л на кінець досліду (рис. 1 В).

Рис. 1. - Зміни активності загальної лужної фосфатази:

Рис. 2. - Зміни активності АСТ (А) і АЛТ (В) під дією фумонізину В1:

Під дією токсину активність кислої фосфатази спочатку трохи підвищувалась, а в кінці досліду знизилась, але ці зміни були статистично не достовірними, тоді, як у контрольній групі протягом досліду відмічали поступове вірогідне підвищення активності ферменту з 8,02 ± 0,1 Од/л до 12,6 ± 0,54 Од/л (Р < 0,05).

Активність загальної лактатдегідрогенази (ЛДГ) у групах курчат під дією токсину достовірно зростала (Р < 0,01) протягом усього досліду до 424 ± 8,7-499,3 ± 5,4 Од/л, тоді як у контрольній групі активність не підвищувалася і була на рівні 335 ± 23,6-380 ± 14,8 Од/л.

Фумонізин В зумовив достовірне підвищення активності аспарагінової трансферази (АСТ) у курчат дослідної групи до 1,92 ± 0,08-2,0 ± 0,08 ммоль/годЧл, хоч мікосорб трохи зменшував вплив токсину до 1,69 ± 0,07-1,86 ± 0,04 ммоль/годЧл, тоді як у контрольній групі активність була в межах 1,36 ± 0,14-1,42 ± 0,05 ммоль/годЧл (рис. 2 А). Особливо значно підвищувалась під дією токсину активність аланінової трансферази (АЛТ) до 0,76 ± 0,08-0,94 ± 0,04 ммоль/годЧл і меншою мірою у курчат, що отримували мікосорб - до 0,46 ± 0,04-0,72 ± 0,1 ммоль/годЧл, а у контрольній групі активність була в межах 0,29 ± 0,07-0,27 ± 0,02 ммоль/год Чл (рис. 2 В). Уміст сечовини і креатиніну під дією токсину достовірно (Р < 0,01) підвищувався протягом усього досліду відповідно до 1,72 ± 0,11-1,82 ± 0,13 ммоль/л та 132,3 ± 6,4-140,3 ± 8,5 ммоль/л. Використання мікосорбу знижувало ступінь зростання до 1,36 ± 0,04-1,56 ± 0,12 та 104,9 ± 6,5-114,4 ± 15,5 ммоль/л. Концентрація загального, ультрафільтрованого, нейтрального та білокзв'язаного кальцію, неорганічного фосфору та загального магнію в сироватці крові курчат під дією фумонізину В була дещо нижчою у порівнянні з контрольною групою. Під час гістологічного дослідження печінки курчат, що отримували токсин, встановлювали множинні та досить великі казеозні некрози, які займали в окремих місцях до ? - ј печінкової часточки та містили білково-жировий детрит. По всій структурі некрозу виявляли поодинокі епітеліоїдні клітини, що свідчили про заміщення некротичної маси ретикулярною тканиною. У печінці курчат, які отримували токсин і мікосорб, виявляли лише поодинокі некрози, в яких казеозна некротична маса поступово заміщувалась молодими ретикулярними клітинами. Отже, під дією фумонізину В1 у курчат розвивався гепатит, що переходив в гепатоз, та порушувався мінеральний обмін, а використання мікосорбу покращувало біохімічні показники та зменшувало негативний вплив токсину на печінку курчат.

Розробка методики експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати F-2 токсин (зеараленон).

Мікологічні дослідження під час діагностики фузаріотоксикозів передбачають виділення культур грибів і встановлення їх токсичності. З цією метою фузарії культивують протягом місяця на зернових субстратах, що займає багато часу, тому була поставлена мета - розробити експресний варіант дослідження зеараленонпродукуючої здатності фузаріїв. Нами були апробовані 8 живильних середовищ, до складу яких входили у різному співвідношенні глутамінова кислота, пептон, дріжджовий екстракт, середовище Чапека та сусло-агар, а також 3 режими культивування (12 діб за tє 24°С та 3 доби за 4°С, 8 діб за 24°С та 4 доби за 4°С і 7 діб за tє 24 та 3 доби за tє 4°С). Дослідженням встановлено, що оптимальним середовищем для накопичення зеараленону виявився сусло-агар із глутаміновою кислотою (10 г/л) та агар Чапека, а режим культивування - 8 діб за 24°С та 4 доби за 4°С. Шість культур фузаріїв (4 F. graminearum та по одній F. culmorum і F. sporotrichiella v. poae), які вирощували в пробірках на сусло-агарі з глютаміновою кислотою, показали повний збіг результатів під час дослідження класичним і розробленим методами. Проведене порівняльне дослідження 14 культур гриба F. moniliforme, з яких 5 виявилися продуцентами зеараленону. Таким чином, був значно скорочений термін дослідження фузаріїв до 12 діб і відпала необхідність вирощування їх на зерновому субстраті. На розроблений експрес-метод визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати зеараленон був отриманий деклараційний патент на корисну модель №200508728 від 15.02.2006.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведені результати вивчення кількісного та якісного складу епіфітної та ендофітної мікобіот зерна вівса урожаю 2004 та 2005 рр. з різних фізико-географічних регіонів України, виявлені продуценти Т-2 токсину, зеараленону, фумонізину Вэ, моніліформіну, фузарину С, фузарієвої та коєвої кислот. Експериментально встановлені оптимальні умови біосинтезу фумонізину Вэ та моніліформіну грибом Fusarium moniliforme, вивчено вплив цих токсинів на організм білих мишей та фумонізину Вэ на організм курчат і встановлено протективну дію мікосорбу;

2. В одному грамі зерна вівса урожаю 2004 та 2005 років кількість колонієутворювальних одиниць (КУО) грибів коливалась від 1,8 ? 10 до 8,7 ? 104 і в середньому становила 1,78 ? 104 ± 4,55 ? 10. При цьому у 2004 році кількість КУО становила 2,16 ? 104 ± 8,1 ? 10, а у 2005 році - 1,5 ? 104 ± 2,6 ? 10і, що свідчить про відсутність суттєвої різниці;

3. Зі 100 зразків зерна виділено 562 культури грибів, віднесених до 2-х класів 9 родів, 418 з яких були ідентифіковані і представлені 16-ма видами і 4-ма різновидами. Найчастіше на зерні вівса виявлялися гриби родів Alternaria, Aspergillus, Mucor та Fusarium. На Поліссі переважали гриби родів Alternaria та Fusarium, в регіонах Лісостепу та Степу родів Mucor та Aspergillus, а також в останньому фузарії;

4. Із токсикологічно досліджених 74 культур фузаріїв 53 володіли токсигенними властивостями: у тому числі по 9 ізолятів продукували Т-2 токсин і зеараленон, 8 - фузарієву кислоту, 13 - моніліформін, 7 - фумонізин В та 4 - фузарин С. Вперше на Україні встановлена здатність F. moniliforme, F. moniliforme var. lactis, F. oxysporum та Alternaria alternatа продукувати фумонізин В;

5. Найкращим з 10 досліджених зернових субстратів для синтезу моніліформіну грибом F. moniliforme виявились зерна рису та ячменю вологістю від 50 до 70%, у процесі культивування 21 добу за температури 24°С а фумонізину В - зерна пшениці, рису та вівса з вологістю 50-60%, у ході культивування 14 діб за 24°С та 7 діб за 4°С або 21 добу за 24°С. Токсини не виявляли в зерні сої і соняшнику, а моніліформіну - ще й на зерні гороху;

6. Культуральна рідина 13 ізолятів фузаріїв із 21 дослідженого, у тому числі семи культур виду F. moniliforme, по два F. oxysporum і F. semitectum та по одному F. culmorum і F. gibbosum, викликала загибель мишей у перші три доби. В міокарді та печінці встановлено зміни, притаманні дії моніліформіну та фумонізину В;

7. Пероральне введення п'ятитижневим курчатам фумонізину Вэ у дозі 8 мг. на голову впродовж трьох тижнів призводило до ураження печінки, міокарда та нирок; мікобіота зерно гриб

8. Включення в раціон курчат мікосорбу в кількості 2% на кілограм корму, зменшує негативний вплив токсину;

9. Розроблений метод дослідження зеараленонпродукуючих властивостей культур Fusarium spp. шляхом вирощування їх на сусло-агарі з глутаміновою кислотою протягом 8 діб за 24°С і 4 доби за 4°С, без культивування на зернових субстратах скорочує дослідження до 12 діб (новизна методу підтверджена деклараційним патентом на корисну модель №200508728).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Жила І.А., Рухляда В.В., Білан А.В. Зміни морфологічного та біохімічного складу крові коней при хронічному фузаріо-Т-2-токсикозі // Вісник Білоцерківського ДАУ. - Біла Церква, 2007. - Вип. 44. - С. 51-54. (Дисертант опрацював результати та оформив статтю).

2. Рухляда В.В., Білан А.В., Соколова О.В. Розповсюдження мікроміцетів на зерні вівса у різних регіонах України // Вісник Білоцерківського ДАУ. - Біла Церква, 2007. - Вип. 44. - С. 146-150. (Дисертант провів експериментальні дослідження, опрацював результати та оформив статтю).

3. Рухляда В.В., Андрійчук А.В., Білан А.В. Розробка способу експресного визначення здатності грибів роду Fusarium продукувати зеараленон // Наук. вісн. НАУ - К., 2007. - С. 130-133. (Дисертант провів експериментальні дослідження).

4. Рухляда В.В., Білан А.В., Соколова О.В. Поширення грибів роду Fusarium Lк:Fr та продуцентів фузаріотоксинів на зерні вівса в різних регіонах України // Бюл. “Ветеринарна біотехнологія” ІВМ - К., 2007. - Вип. 11. - С. 204-211. (Дисертант провів експериментальні дослідження, опрацював результати та оформив статтю).

5. Білан А.В. Вплив факторів зовнішнього середовища на біосинтез моніліформіну та фумонізину Вэ грибом Fusarium moniliforme Sheldon // Вісник Білоцерківського ДАУ. - Біла Церква, 2007. - Вип. 48. - С. 14-17.

6. Рухляда В.В., Білан А.В., Утеченко М.В. та ін. Вивчення впливу фумонізину Вэ на організм курчат і протективної дії мікосорбу // Вісник Білоцерківського ДАУ. - Біла Церква, 2008. - Вип. 51. - С. 72-78. (Дисертант провів експериментальні дослідження, опрацював результати та оформив статтю).

7. Пат. UA, 12712С12N 5/00 В23Н3/00. Спосіб експресного визначення здатності грибів Fusarium spp. продукувати зеараленон / В.В. Рухляда, А.В. Андрійчук, А.В. Білан. - №200508728, Заявл. 13.09.2005, Опубл. 15.02.2006, Бюл. №2. (Дисертант провів експериментальні дослідження, опрацював результати та оформив деклараційний патент України на винахід).

Размещено на Allbest.ru