Размещено на http://www.allbest.ru/

9

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І

ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

УДК 619:616.98:579.873.21:599.323.43

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

ЕПІЗООТОЛОГІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ТА БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКОБАКТЕРІЙ, ВИДІЛЕННИХ ВІД ОНДАТР

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

МАЗУР ВАЛЕРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор,

академік НААН України

Бусол Володимир Олександрович,

Національний університет біоресурсів і

природокористування України,

професор кафедри епізоотології та організації ветеринарної справи

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Галатюк Олександр Євстафійович,

Житомирський національний

агроекологічний університет,

завідувач кафедри мікробіології,

вірусології та епізоотології

доктор ветеринарних наук, професор

Івченко Василь Мусійович,

Білоцерківський національний

аграрний університет,

завідувач кафедри лабораторної діагностики

інфекційних захворювань

сільськогосподарських тварин

Захист дисертації відбудеться «15» червня 2011 р. о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, ауд. 28

Автореферат розісланий «13» травня 2011 р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

туберкульоз ондатра скотарство мікобактерія

Актуальність теми. Туберкульоз великої рогатої худоби є актуальною медико-соціальною, ветеринарною і економічною проблемою світу (Бусол В. О. та співавт. 2002; Овдиенко Н. П. и соавт., 2004; Thoen C. et al., 2006; Shitaye J. E. et al., 2007). Україна залишається століттями неблагополучною щодо мікобактеріальної інфекції продуктивних тварин і людей (Ю. Я. Кассич и соавт., 1990; Горжеєв В. М., 2005; Шевчук В. М., 2007; Москаленко В. Ф., 2010). Такий стан обумовлено недостатністю знань епізоотологічних особливостей, адаптивної мінливості збудника інфекції (Дяченко Г. М., 1998; Романенко В. Ф., 2005; Ткаченко О. А. та співавт., 2009), а також відсутністю будь-яких специфічних засобів профілактики та недосконалістю методів зажиттєвої діагностики туберкульозу продуктивних тварин (Власенко В. В. та співавт., 2003; Донченко А. С. и соавт., 2004; Лисенко А. П., Агеева Т. Н., 2004; Найманов А. Х., 2008). У підтримці стаціонарності епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби особливу роль мають альтернативні джерела збудника інфекції в дикій природі - ссавці (Матвеев В. Н., 1929; Юсковец М. К., 1963; Ротов В. И. и соавт., 1973; Ситнік В. А., 2003; Данко Ю. Ю. и соавт., 2007; Morris R. S., Pfeiffer D. U., 1995; De Vos V. et al., 1995; Chaddock H. M., Langsing M. I., 1998; Тоен Ш. О., 2002; Corner L. A., 2006). Носіями M. bovis можуть бути кліщі (Власенко О., 2007) та інші представники фауни (Тузова Р. В., 1983; Ермакова Р. М. и соавт., 1995; Сорокина А. И. и соавт., 2005). За даними P. G. Livingstone (1991), B. D. O'Neil та H. J. Pharo (1995), P. Caley (1997) наукою поки що не визначено усіх тварин-господарів M. bovis у природі.

Таке розмаїття джерел збудника інфекції M. bovis ускладнює ефективність оздоровлення неблагополучних щодо туберкульозу господарств і адміністративних територій та унеможливлює ліквідацію інфекції. Тому позитивний результат у заходах, спрямованих на зниження активності епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби, значною мірою залежить від знань особливостей розповсюдження та регуляції чисельності природних носіїв М. bovis (Barlow N. D., 1991; Roberts M., 1995), а також використання вакцинних препаратів для імунізації тварин (Ощепков В. Г., 2004; Бажин М. А. и соавт., 2004; Hughes M. S. et al., 1996) та знешкодження збудників інфекції в оточуючому середовищі (Аржаков В. Н., 2002; Завгородній А. І. та співавт., 2010).

Зважаючи на відсутність інформаційних даних щодо цілеспрямованого пошуку нових екологічних ніш збудника інфекції, зокрема серед ондатр внутрішніх водойм України, дослідження в цьому напрямі є актуальними, а отримані результати допоможуть встановити одну з основних причин стаціонарної епізоотичної ситуації з туберкульозу великої рогатої худоби в країні та підвищити ефективність комплексних протитуберкульозних заходів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідної роботи Науково-дослідного інституту здоров'я тварин Національного університету біоресурсів і природокористування України “Розробити засоби специфічної профілактики та оптимізовану систему протитуберкульозних заходів в Україні”, номер державної реєстрації - 0107U004383.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - вивчити епізоотологічне значення та біологічні властивості мікобактерій, виділених від ондатр.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі завдання:

- вивчити закономірності розвитку епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби в просторі і часі в межах континентів та в Україні, встановити можливий зв'язок неблагополуччя скотарства з циркуляцією M. bovis серед свійських і диких тварин;

- встановити епізоотологічне значення ондатр внутрішніх водойм, як джерела збудника туберкульозу великої рогатої худоби;

- вивчити біологічні властивості (вірулентність для морських свинок, кролів, курей і щурів, морфологічні та культуральні характеристики) мікобактерій, виділених від ондатр;

- визначити видову належність мікобактерій, виділених від ондатр, за допомогою методів біопроби та полімеразної ланцюгової реакції;

- вивчити закономірності адаптивної мінливості мікобактерій, виділених від ондатр, при пасажуванні на щільному яєчному живильному середовищі, а також через організм морських свинок, кролів і курей;

- провести порівняльну оцінку ліпідного складу M. bovis польового ізоляту, мікобактерій, первинно виділених від ондатр і пасажованих через організм морських свинок - трикратно та через систему організмів морська свинка-кріль;

- розробити концептуальні положення епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби за умов наявності екологічних ніш M. bovis.

Oб'єкт дослідження - мікобактерії виділені від ондатр та великої рогатої худоби.

Предмет дослідження - вільноживучі ондатри, епізоотичний та інфекційний процеси, алергічні реакції, клінічні та патолого-анатомічні зміни при туберкульозному процесі у ондатр, морських свинок, кролів, курей і щурів, біологічні особливості мікобактерій штаму “Ондатра”.

Методи дослідження. Епізоотологічні (історико-статистичний і порівняльно-географічний опис), експериментальні, клінічні, імунологічні (алергічні), бактеріологічні (виділення та ідентифікація збудника туберкульозу), патолого-анатомічні, біохімічні (визначення ліпідного складу мікобактерій) та молекулярно-генетичні (ПЛР).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше у світі, на основі патолого-анатомічних та бактеріологічних досліджень, встановлено носійство ондатрами внутрішніх водойм України патогенних мікобактерій та вивчено їх біологічні, культурально-морфологічні, тинкторіальні та молекулярно-генетичні властивості.

Встановлено, що мікобактерії, виділені від ондатр:

- високовірулентні та високопатогенні для морських свинок, кролів і курей, а також здатні викликати інфекційний процес у білих щурів;

- мають тинкторіальні і морфологічні характеристики, наближені до M. bovis і M. tuberculosis;

- проявляють ознаки росту після першого посіву на щільне яєчне середовище при температурі 22, 37 і 45 єС на 37-, 28- і 29-у доби відповідно, а також прискорюють ріст, змінюють деякі морфологічні та культуральні властивості при послідовному пасажуванні через організм морської свинки та кроля і проявляють стабільність первинних властивостей при пасажуванні через системи організмів: морська свинка-морська свинка та морська свинка-курка;

- посилюють ознаки патогенності до третього пасажу (період досліду) через організм морських свинок, викликають у тварин утворення виразок зі значними некрозами тканин на місці введення мікобактерій, зумовлюють розвиток шкірної, генералізованої та септичної форми туберкульозного процесу;

- змінюють вміст вільних жирних кислот після пасажування: через організм морських свинок підвищується вміст арахінової, нонадеканової, тетракозанової, ліноленової та знижується - тридеканової, генейкозанової, міристинової, лінолевої кислот; через систему організмів морська свинка-кріль підвищується вміст арахінової, генейкозанової, бегенової, трикозанової, тетракозанової і знижується - міристинової, тридеканової, лінолевої, маргаринової, пентадеканової кислот;

- не можуть бути ідентифіковані щодо належності до виду за показниками біопроби у зв'язку з високою патогенністю для лабораторних тварин (морських свинок, кролів і курей);

- за показниками полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) належать до виду M. bovis.

Практичне значення одержаних результатів. Обґрунтовано зв'язок стаціонарності туберкульозу із циркуляцією M. bovis серед свійських і диких тварин, а також людей. Встановлено, що вільноживучі ондатри України можуть бути резервуаром високовірулентного для морських свинок, кролів, курей та патогенного для щурів штаму M. bovis і виконувати певну роль у підтримці стаціонарності епізоотичного неблагополуччя скотарства країни з туберкульозу та унеможливлюють використання як стандарту існуючої методики постановки біологічної проби для встановлення виду патогенних мікобактерій. Для визначення виду мікобактерій може бути використаний метод ПЛР.

Вищенаведені дані щодо вірулентності мікобактерій штаму “Ондатра”для лабораторних тварин та здатності їх викликати інфекційний процес з патолого-анатомічним проявом у високостійких до M. bovis щурів вказують на їх епізоотологічне, можливо і епідеміологічне значення, а також на роль ондатри як підсилювача вірулентності патогенних мікобактерій.

Мінливість біологічних властивостей досліджуваних мікобактерій при пасажуванні in vitro та in vivo потребує нового методичного підходу щодо проведення епізоотологічного моніторингу, діагностики та протитуберкульозних заходів.

Уперше отримані високовірулентні мікобактерії від ондатр (штам “Ондатра”) поповнять українську колекцію музейних штамів мікроорганізмів, визнану як національне надбання. Вони є підставою для започаткування нового напряму у ветеринарній фтизіатрії України, зокрема вивчення закономірностей функціонування природного джерела і підсилювача патогенності збудників туберкульозу тварин.

Результати досліджень використані при розробці “Інструкції з профілактики та боротьби з туберкульозом тварин” (2009 р.), при проведенні епізоотологічних і лабораторних досліджень у Волинській регіональній державній лабораторії ветеринарної медицини, використовуються у навчальному процесі Національного університету біоресурсів і природокористування України, Білоцерківського національного аграрного університету, Національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С. З. Гжицького, при написанні монографій.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто виконав пошук та аналіз матеріалу з літературних джерел, визначив і обґрунтував методи наукових досліджень. Самостійно провів весь обсяг експериментальних досліджень, здійснив статистичну обробку одержаних результатів. Спільно з науковим керівником визначено мету і завдання роботи, сплановано експериментальні дослідження, проаналізовано отримані результати, сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи апробовані на трьох міжнародних конференціях: “Моніторинг, прогнозування та профілактика інфекційних хвороб тварин з використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології” (м. Феодосія, 2009 р.), “Епізоотологічний моніторинг та системи ліквідації хвороб тварин” (м. Рівне, 2010 р.) і “Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц” (м. Єкатеринбург, 2010 р.); конференції з міжнародною участю з питань ветеринарної медицини “Проблеми, новітні здобутки та перспективи розвитку епізоотології” (м. Харків, 2009 р.); чотирьох наукових конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів ННІ ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції тваринництва Національного університету біоресурсів і прородокористування України (м. Київ, 2008-2011 рр.); на Всеукраїнських семінарах: “Профілактика і методи боротьби з туберкульозом великої рогатої худоби” (м. Суми, 2008 р.), “Діагностика, профілактика і заходи боротьби з туберкульозом великої рогатої худоби” (м. Черкаси, 2010 р.).

Публікації. За результатами досліджень дисертації опубліковано 13 наукових праць, з них шість - у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, а також рекомендацій для науки і виробництва, додатків (5) і списку використаних літературних джерел. Дисертаційна робота викладена на 176 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 19 таблицями, 36 рисунками. Список використаної літератури включає 351 джерело, з них українською та російською мовами - 255, латиницею - 96.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи виконання роботи

Робота виконана з 2007 по 2011 рр. на кафедрі епізоотології та організації ветеринарної справи Національного університету біоресурсів і природокористування України. Експерименти з визначення виду виділених від ондатр мікобактерій проводили в лабораторії ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, Інституті сільськогосподарської мікробіології НААН України, Українській лабораторії якості та безпеки продукції АПК, у відділах бактеріології Київської і Волинської регіональних державних лабораторій ветеринарної медицини. Ліпідний склад мікобактерій визначали в НДІ біології Дніпропетровського національного університету. Вивчення циркуляції патогенних мікобактерій серед ондатр, що населяють внутрішні водойми, проводили у Вінницькій, Київській і Черкаській областях.

Матеріалами досліджень слугували: дані ветеринарної статистики та публікацій, 24 ондатри, 182 морські свинки, 12 кролів, 12 курей, 12 щурів. Всього проведено 57 посівів та 44 експерименти на лабораторних тваринах.

Для виконання поставлених завдань були використані епізоотологічний (Бакулов И. А., 1979), клінічний (Левченко В. І. та співавт., 1995), імунологічний, бактеріологічний (Манченко В. М. та співавт., 1994), патолого-анатомічний (Тогунова А. И., 1973; Забелло Є. М., 1997), біохімічний (Кейтс М., 1975) та молекулярно-генетичний (Завгородній А. І. та співавт., 2009) методи досліджень.

Вивчення біологічних характеристик мікобактерій, виділених із гомогенату органів ондатр на щільному яєчному живильному середовищі, проводили в чотири етапи (Рис. 1).

Під час вивчення вірулентних і патогенних характеристик мікобактерій дослідним тваринам вводили 1 мг культури, суспендованої в 1 см³ стерильного 0,9 %-го розчину натрію хлориду: морським свинкам - підшкірно; кролям - у крайову вену вуха; курям - у підкрильцеву вену; щурам - внутрішньочеревно, в середину каудальної третини черевної стінки (5 мг у 2 см³). Визначення вірулентності виділених культур мікобактерій проводили за методиками Р. О. Драбкіної (1963) і П. Ю. Савченко (1998).

Особливості прояву патолого-анатомічних змін у тварин визначали за методикою А. І. Тогунової (1973).

Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали на персональних комп'ютерах з використанням програмного забезпечення Microsoft Offise Exell, оцінюючи вірогідність показників (р<0,05, р<0,01, р<0,001) за критерієм Стьюдента (t).

Результати досліджень

Просторово-часовий розподіл напруженості епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби. Результати епізоотологічного моніторингу на територіях п'яти частин світу вказують на існування ознак панзоотії інфекції M. bovis. За показниками загальної оцінки епізоотичної ситуації у 2009 році зі 174 аналізованих країн (табл. 1) тільки у 13 (7,5 %) хворобу не реєстрували, 87 (50,0 %) визнані неблагополучними, у 26 (14,9 %) епізоотична ситуація залишалася невивченою.

Із 48 оздоровлених країн у 26 (54,1 %) туберкульозна інфекція виникала повторно. Аналіз інформаційних даних свідчить, що рецидив туберкульозної інфекції у великої рогатої худоби може бути обумовлений: наявністю у стаді тварин з латентним мікробізмом; існуванням мікобактерій в абіотичному середовищі; циркуляцією M. bovis у популяціях різних видів свійських і диких тварин та серед людей. Особливе значення щодо підтримки стаціонарності епізоотичного неблагополуччя великої рогатої худоби з туберкульозу відіграють джерела M. bovis серед інших свійських і диких тварин та людей. Так, із 84 аналізованих щодо туберкульозу великої рогатої худоби країн у 61 (72,6 %) реєстрували інфекцію M. bovis у людей та інших видів свійських і диких тварин, що з певною часткою достеменності зумовлено носійством невластивими господарями мікобактерій бичачого виду.

Таблиця 1

Епізоотична ситуація щодо туберкульозу великої рогатої худоби в країнах світу(2009 р.)

Частина світу	Аналізовано країн	Епізоотична ситуація в країнах
		благополучні	неблагополучні	невивчена
		хвороба ніколи не реєструвалася	оздоровлені від туберкульозу	зі значним поширенням інфекції	з регіональним проявом інфекції	з підозрою на захворювання (є позитивно реагуючі)	відсутні дані про епізоотичну ситуацію
Європа	41	1	16	23	1	-	-
Азія	47	4	16	18	1	2	6
Америка	33	4	6	18	3	1	1
Африка	46	-	9	19	3	3	12
Австралія і Океанія	7	4	1	1	-	-	1
Всього	174	13	48	79	8	6	20

Україна понад 100 років залишається стаціонарно неблагополучною з туберкульозу великої рогатої худоби. Ретроспективні дослідження за 16 попередніх років (1992-2007) до початку наших досліджень свідчать, що в країні благополучними щодо туберкульозу були тільки Автономна Республіка Крим та Рівненська область. У 1999-2007 рр. 21 область мала стаціонарний прояв інфекції, де виявлено 380 нових неблагополучних щодо туберкульозу великої рогатої худоби пунктів та 72621 голову хворих тварин.

Причинами стаціонарного епізоотичного неблагополуччя України та широкого розповсюдження туберкульозу великої рогатої худоби у більшості областей країни можуть бути: суб'єктивні та об'єктивні чинники, а також наявність джерел збудника M. bovis у природі, зокрема серед гризунів, на що у 2002-2003 роках звертали увагу В. О. Бусол та В. А. Ситнік. Однак, в офіційних даних Державної ветеринарної та фіто-санітарної служби України та публікаціях відсутні дані щодо виявлення серед диких тварин циркуляції M. bovis.

Для підтвердження або спростування можливої ролі диких ссавців, зокрема ондатр, у підтримці епізоотичного неблагополуччя України з туберкульозу великої рогатої худоби нами проведені відповідні дослідження.

Вивчення можливості циркуляції M. bovis серед ондатр. Основні дослідження проведені в Київській області - найбільш неблагополучній місцевості щодо туберкульозу великої рогатої худоби (2005-2008 рр.) За контроль обрано водоймища двох населених пунктів Черкаської та Вінницької областей, де тривалий час не спостерігали прояву інфекції.

У двох з п'яти ондатр, виловлених у водоймищі Київської області, виявлено збільшення селезінки та печінки в 1,3-1,5 раза, порівняно із органами інших тварин. Після посіву гомогенату органів ондатр на щільне яєчне живильне середовище на 50 добу досліду виявлено ріст мікобактерій. У біопробі на морських свинках, заражених гомогенатом органів ондатр, виявлені клінічні і патолого-анатомічні зміни, характерні для туберкульозу. На 35-40-у доби досліду в морських свинок на місці уведення гомогенату виявлено некроз шкіри (рис. 2), а на 45-50-у доби - виразки, які не загоювались і з часом збільшувались до 1,2-1,4 см у діаметрі. У зв'язку з погіршенням клінічного стану морських свинок евтаназовано на 90-у добу досліду. Патолого-анатомічними дослідженнями виявлено на печінці сіруваті туберкули округлої форми, завбільшки від макового до просяного зерна та збільшення селезінки у 1,3-1,5 раза порівняно з органами тварин групи контролю.

У мазках-відбитках, виготовлених з глибоких шарів печінки і пофарбованих за методом Ціля-Нільсена, виявляли поодинокі короткі рубінового кольору палички із закругленими кінцями.

Рис. 2. Некроз шкіри у морської свинки на місці введення суспензії внутрішніх органів ондатр.

Морфологічні характеристики мікобактерій, виділених від ондатр і при пасажуванні in vitro. Первинний ріст мікобактерій із органів ондатр на щільному яєчному живильному середовищі характеризувався дрібними колоніями (діаметром 0,5-1,0 мм) кольору слонової кістки, напівсферичної та сферичної форми, з гладенькою сухою поверхнею (рис. 3).

Рис. 3. Колонії мікобактерій із внутрішніх органів ондатр на щільному яєчному живильному середовищі.

Імерсійною мікроскопією мазків із колоній, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена, виявляли мікроорганізми у вигляді товстих, прямих та вигнутих із закругленими кінцями паличок червоно-малинового кольору, завбільшки 1,5-2,0Ч0,3-0,6 мкм. Деякі з них містили по 1-3 більш інтенсивно зафарбовані зерна.

У трьох пасажах in vitro (етап 1) виділені мікобактерії прискорювали ріст (табл. 2), що обумовлювало збільшення діаметра колоній до 4 мм за вирощування при температурі 22, 37 та 45 єС. Деякі колонії мали матову поверхню.

Таблиця 2

Культуральні характеристики мікобактерій, виділених від ондатр при пасажуванні на щільному яєчному живильному середовищі

Номер пасажу	Початковий ріст на ж. с.*, діб, t єC	Особливості росту колоній мікобактерій, t єC
	22	37	45	22	37	45
І	37	28	29	слабкий ріст, 0,5-1,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (дисгонічний ріст, S-форма)	0,5-1,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (дисгонічний ріст, S-форма)	0,5-1,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (дисгонічний ріст, S-форма)
ІІ	32	20	27	слабкий ріст, 0,5-1,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)	1,0-1,5 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)	0,5-1,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)
ІІІ	29	18	23	2,0-4,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)	інтенсивний ріст, 2,0-4,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)	2,0-4,0 мм, округлі, кольору слонової кістки (S, SR-форма)

Примітка. ж. с. - живильне середовище

Порівняно з розмірами мікобактерій первинного росту мікроорганізми другого і третього пасажів in vitro характеризувались значним діапазоном довжини: за умов вирощування при температурі 37 єС - від 0,9 до 2,5 мкм; при 45 - були короткими - до 0,8 мкм; при 22 єС - їх довжина зменшувалась до 0,6 мкм. Отримані дані показують, що мікобактерії, первинно виділені від ондатр, за швидкістю росту на живильних середовищах при температурі 37 єС не відрізнялися від M. bovis і M. tuberculosis, описаними А. С. Донченко та співавт. (2004). Ріст мікобактерій у пересівах за температур 22 і 45 єС вказує на наявність у виділених мікобактерій достатньо великої адаптивної здатності розмножуватися за різних температурних режимів, подібної M. avium або іншого виду атипових мікобактерій.

Для встановлення вірулентних ознак виділених мікобактерій проведено інфікування ними високо сприйнятливих до M. bovis морських свинок.

Вірулентність мікобактерій штаму “Ондатра” для лабораторних тварин. На другому етапі досліджень вивчали вірулентність первинно виділених мікобактерій від ондатр у двох дослідах. В експерименті на п'яти морських свинках вивчено вірулентні характеристики досліджуваних мікобактерій. У експериментальних тварин через 21-27 діб досліду на місці підшкірного введення первинної культури мікобактерій (1 мг/см³ 0,9 % NaCl) виявлені клінічні ознаки розвитку інфекції - почервоніння шкіри з наступним припуханням, розвитком некрозу та виразок, а з часом схуднення та порушення рухливості. Двох морських свинок евтаназовано на 50-у добу, три інших загинули на 72-, 85-у та на 101-у добу досліду. На селезінці та печінці виявлені туберкули. Наявність туберкульозного процесу підтверджено при мікроскопії мазків-відбитків поверхні розрізів органів на скельцях, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена та посівів гомогенату органів на щільне яєчне живильне середовище.

Для вивчення біологічних характеристик виділених мікобактерій та визначення їх видової належності проведено біопробу на морських свинках кролях і курях (рис. 1). У п'яти морських свинок, експериментально заражених суспензією культури мікобактерій, виділених від ондатр, виявлено клінічні та патолого-анатомічні зміни, характерні для туберкульозу. У всіх дослідних кролів і курей, також виявлено специфічні для туберкульозу патолого-анатомічні зміни. Високу вірулентність, виділених із органів вказаних тварин мікобактерій, підтверджено послідуючими бактеріологічними дослідженнями.

Вище наведені дані дозволили культуру мікобактерій, виділених від ондатр і пасажованих через організм морської свинки, вважати штамом “Ондатра.”

Узагальнюючи дані біологічних проб на трьох видах тварин, можна зробити висновок, що мікобактерії штаму “Ондатра” відрізняються від відомих видів мікобактерій туберкульозу унікальною вірулентністю, здатністю викликати активний туберкульозний процес у морських свинок, кролів та курей. Така вірулентність може бути властива новому виду мікобактерій, або M. bovis, які в організмі ондатр набули більш високої вірулентності. На першому етапі вивчення ми не виключали можливого виділення змішаної культури M. bovis та M. avium, а можливо і M. tuberculosis.

Для відповіді на ці запитання проведено пасаж виділеної культури мікобактерій через організм високосприйнятливих тварин до M. bovis та стійких до M. avium - морських свинок. Такий методичний підхід дає змогу ще раз провести відселекціонування культур мікобактерій, принаймні на 2 різновиди: M. bovis-M. tuberculosis і M. avium.

Мінливість мікобактерій, виділених від ондатр, при пасажуванні через організм лабораторних тварин. На третьому етапі досліду оцінювали мінливість мікобактерій, виділених від ондатр, при пасажуванні через організм лабораторних тварин. При триразовому пасажуванні первинно виділених з організму ондатр мікобактерій через організм морських свинок, з виділенням культури на живильному середовищі після кожного пасажу, визначали їх вірулентні та культуральні характеристики. При першому пасажі початкові клінічні ознаки інфекції були виявлені на 21-27-у доби досліду, а загибель тварин наставала на 71-101-у доби, при наявності патолого-анатомічних змін від поодиноких туберкулів в печінці і селезінці до генералізованої форми туберкульозу.

Гомогенат патматеріалу внутрішніх органів морських свинок, заражених первинно виділеними від ондатр мікобактеріями висівали на щільне яєчне живильне середовище. Перші ознаки росту мікобактеріальних колоній виявили на 28-у добу. Отриманою культурою мікобактерій першого пасажу проведено зараження морських свинок другої групи. У вказаних тварин відмічали почервоніння шкіри на місці введення і ознаки місцевого прояву інфекції на 20-28-у доби. У послідуючий період у двох морських свинок спостерігали поступовий перехід місцевого прояву туберкульозного процесу у загальний - схуднення та виснаження. Патолого-анатомічно туберкульозний процес у цих тварин проявлявся утворенням туберкул розміром з просяне зерно на поверхні легень та печінки. В інших трьох тварин виразки загоїлись, а на 62-, 90- і 94- доби досліду виявлено туберкульозне ураження шкіри шиї, спини, черева і меншою мірою інших ділянок поверхні тіла - у вигляді алопецій та кірочок із серозно-кров'яного ексудату. Патолого-анатомічним розтином трупів встановлено ураження печінки туберкулами завбільшки з просяне зерно, лімфаденіт, катаральну та геморагічну пневмонії і збільшення поверхневих шийних лімфовузлів.

У мазках-відбитках із легень виявлено рубіново-червоні коки завбільшки 0,3-0,5 мкм. Після посіву суспензії ураженої шкіри на живильне середовище на 25-у добу виявлено ріст мікобактерій. Колонії мікобактерій характеризувались напівсферичною формою, кольором слонової кістки з гладенькою сухою поверхнею. Отриманою культурою мікобактерій проведено третій пасаж на п'яти морських свинках. У тварин поява виразок на місці зараження спостерігалася на 20-25-у доби досліду. Відмічали загибель однієї морської свинки на 37-, другої - 42-у доби. Патолого-анатомічними дослідженнями у тварин виявлено ознаки септичного процесу туберкульозного походження - збільшення селезінки та токсичну дистрофію печінки. У мазках-відбитках із внутрішніх паренхіматозних органів виявляли прямі кислотостійкі палички завбільшки 0,2-0,3Ч1,0-1,6 мкм, а на щільному яєчному живильному середовищі - ріст колоній мікобактерій на 28-у добу. У трьох інших тварин експерименту спостерігали алергічну реакцію на внутрішньошкірне введення туберкуліну та загибель - на 83-, 96- та 122-у доби. При патолого-анатомічному досліджені у перших двох загиблих морських свинок встановлено виснаження, численні туберкули в печінці та селезінці, поодинокі туберкули в легенях. У третьої тварини, яка загинула на 122-у добу, виявлено великовогнищевий туберкульоз легень і тотальне ураження селезінки (дифузний казеоз). Печінка усіяна туберкулами світло-жовтого кольору із зеленуватим відтінком, завбільшки з горохове зерно.

У досліді на кролях, інфікованих мікобактеріями штаму “Ондатра”, встановлено активний розвиток туберкульозного процесу. Тварини загинули на 9-10-у доби досліду. На розтині встановлено ознаки спленомегалії (рис. 4).

Підтвердженням мікобактеріального походження ураження селезінки було виявлення у мазках-відбитках із селезінки та печінки прямих та дещо вигнутих кислотостійких паличок завдовжки 2-4 мкм. З гомогенату внутрішніх органів кролів на живильних середовищах виділені мікобактерії, ріст яких проявився на 7-у добу після посіву. Колонії мікобактерій мали напівсферичну форму, помаранчеву пігментацію та слизову поверхню.

Виділеною культурою мікобактерій проведено зараження (другий пасаж) кролів-аналогів другої групи. На відміну від попереднього експерименту в дослідних тварин погіршення клінічного стану відмічали значно пізніше - на 34-41-у доби після інфікування. На 46-57-у доби кролі загинули. При патолого-анатомічному розтині виявлено: виснаження та генералізовану форму туберкульозу. На 32-у добу після посіву на живильне середовище гомогенату органів виявили ріст колоній мікобактерій напівсферичної форми з гладенькою сухою поверхнею, кольору слонової кістки.

Рис. 4. Спленомегалія у кроля, зараженого суспензією культури мікобактерій штаму “Ондатра”.

Дослід із вивчення впливу пасажування мікобактерій штаму “Ондатра” через організм птиці на морфологічні та вірулентні характеристики проведено на шістьох курях. При першому пасажі в усіх трьох курей дослідної групи на 15-17-у доби досліду відмічали анемічність гребеня і борідок, пригнічення, у двох курей - діарею. Птиця загинула на 20-23-у доби після зараження. На патолого-анатомічному розтині трупів курей встановлено викривлення кільової кістки, наявність міліарних туберкулів у печінці та селезінці або ознак септицемії (зі збільшенням селезінки у 5-7 та печінки у 2-2,5 раза порівняно з органами птиці групи контролю). На живильному середовищі з висіяним гомогенатом внутрішніх органів на 14-у добу після посіву виявлено ріст колоній мікобактерій кольору слонової кістки, напівсферичної форми з гладенькою сухою поверхнею. Отриманою культурою мікобактерій проведено другий пасаж на трьох курях. У дослідної птиці погіршення клінічного стану відмічали на 38-44-у доби досліду. Загибель птиці мала місце на 50-63-ю доби. Як і вдослідах на кролях знижувався показник інтенсивності розвитку інфекційного процесу. Патолого-анатомічним розтином встановлено значне виснаження, міліарні туберкули на печінці, збільшення селезінки в 1,5 раза в порівнянні з птицею групи контролю. Після посіву гомогенату органів на щільне яєчне живильне середовище виявлено ріст мікобактерій через 28 діб, що свідчить про сповільнення швидкості росту колоній на 14 діб порівняно з попереднім дослідом. Колонії були діаметром 0,5-1 мм, напівсферичної форми, кольору слонової кістки, з гладенькою сухою поверхнею.

Вивчення вірулентних властивостей мікобактерій штаму “Ондатра” за міжвидового пасажування. На третьому етапі досліду оцінювали вплив міжвидового пасажу на біологічні характеристики мікобактерій штаму “Ондатра”. З цією метою проводили шість дослідів у системах: морська свинка-кріль; кріль-морська свинка; кріль-курка; курка-кріль; курка-морська свинка; морська свинка-курка.

У дослідах були отримані однозначні результати. У тварин усіх видів проявлялися ознаки активного розвитку туберкульозного процесу.

Результати досліджень показали, що міжвидове пасажування мікобактерій штаму “Ондатра” не знижує патогенність збудника інфекції для дослідних ссавців і курей. Такі результати орієнтують нас на те, що мікобактерії, виділені від ондатр, представлені одним видом з надзвичайними вірулентними властивостями.

Висока вірулентність мікобактерій штаму “Ондатра” для дослідних лабораторних тварин була підставою для вивчення розвитку туберкульозного процесу у білих щурів, стійких до M. bovis, M. tuberculosis і M. avium (Драбкіна Р. О., 1963) при інфікуванні мікобактеріями, виділеними від ондатр.

Сприйнятливість щурів до мікобактерій, виділених від ондатр. У щурів (четвертий етап досліджень), заражених внутрішньочеревно мікобактеріями первинно виділеними від ондатр, спостерігали через 48-53 доби на місці введення суспензії культури почервоніння і припухання шкіри, а через 55-69 діб розвиток виразок, які через 24-30 діб спонтанно загоїлись. У подальшому тварини не проявляли ознак інфекції впродовж 150 діб (період досліду). Патолого-анатомічним розтином евтаназованих щурів не виявлено макроскопічних змін у внутрішніх органах. З гомогенату органів щурів на живильному середовищі через 26 діб культивування отримали ріст культури мікобактерій, яка характеризувалась колоніями діаметром 3-4 мм напівсферичної форми, кольору слонової кістки із сухою шорсткою поверхнею.

Безпосередньо перед евтаназією у щурів відбирали кров і вводили її в дозі 0,5 мл підшкірно трьом морським свинкам. Усі тварини на 30-, 60- та 90-у доби досліду, позитивно реагували на введення ППД-туберкуліну для ссавців. В послідуючих двох дослідженнях впродовж 60 діб у двох морських свинок не виявляли стану алергії. На 150-у добу досліду у евтаназованої морської свинки із збереженою алергічною реакцією на туберкулін після патолого-анатомічного розтину виявлено туберкули в печінці завбільшки з просяне зерно. У морських свинок із зниклою алергічною реакцією до кінця досліду (300 діб) не виявляли алергічних реакцій і змін загального стану, а після евтаназії і розтину - будь-яких патолого-анатомічних ознак туберкульозного процесу.

Досліджувані мікобактерії, при другому пасажі через організм щурів проявляли ознаки вірулентності. На 90-у добу досліду у двох із трьох тварин після розтину виявили утворення туберкулів на брижі кишечнику та збільшення в 1,5-2,0 рази селезінки порівняно з органом тварин групи контролю.

У морських свинок, інфікованих мікобактеріями однократно пасажованими через організм щурів, виникли стан алергії до ППД-туберкуліну для ссавців та виразки на 25-28-у доби, які загоїлись через 2-3 тижні. В період досліду у морських свинок не виявлено клінічних та патологоанатомічних змін.

Отже, мікобактерії, виділені від ондатр, спричиняють в організмі щурів розвиток латентного мікробізму при первинному інфікуванні та підвищують ознаки вірулентності, при другому пасажі - викликаючи розвиток ознак туберкульозного процесу.

Високі вірулентні властивості мікобактерій ізоляту від ондатр для лабораторних тварин спонукали до пошуку причин вказаних особливостей у хімічному складі мікробної клітини, зокрема ліпідної структури збудника туберкульозу.

Ліпідний склад мікобактерій, виділених від ондатр. Результати досліджень показали, що вміст загальних ліпідів мікобактерій первинного ізоляту у два рази більший ніж у польового - M. bovis (контроль). Загальні ліпіди мікобактерій обох ізолятів мають шість фракцій: фосфоліпіди, дигліцериди, стерини, вільні жирні кислоти, тригліцериди та ефіри стеринів. Встановлено, що мікобактерії первинного ізоляту із органів ондатр у складі загальних ліпідів мають підвищений вміст фосфоліпідів порівняно з контрольним зразком мікроорганізмів. Як вказує М. М. Авербах (1976), вищий вміст ліпідів цієї фракції у зумовлює підвищення вірулентності патогенних мікобактерій.

Мікрорганізми досліджуваного ізоляту мікобактерій від ондатр містили 17 вільних жирних кислот, які за числом атомів вуглецю в молекулі -поділяються на групи з: 13-16 атомами вуглецю - 29,52 %; 17-19 атомами - 65,66 %; 20-21 атомом - 0,74 %; 22-25 атомами - 4,08 %. Склад аналогічних груп жирних кислот польового ізоляту Mycobacterium bovis мав показники: 30,59 %, 67,58, 0,17, 1,66 % відповідно. У спектрі жирних кислот мікобактерій цього ізоляту знайдені лише сліди (менше 0,01 %) лінолевої (середньоланцюгова), генейкозанової та пентакозанової (довголанцюгові) кислот. Його відрізняє від виділених мікобактерій з організму ондатр менший вміст вільних жирних кислот: маргаринової - в 4,9, пентадеканової - в 4,1, пальмітоолеїнової - в 3,0, трикозанової - в 2,9, бегенової в - 2,0 рази та більш високий вміст нонадеканової - в 3,1, арахінової - в 2,4 та олеїнової кислоти - в 1,6 раза.

Встановлено, що пасажування мікобактерій первинного ізоляту через організми морської свинки і кроля змінює співвідношення вмісту довго- і коротколанцюгових кислот в сторону підвищення довголанцюгових: арахінової, генейкозанової, бегенової, трикозанової, тетракозанової, пентакозанової, в 6,9 раза та зниження коротколанцюгових - тридеканової і міристинової до мінімальних показників (рис. 5).



Рис. 5. Вміст вільних жирних кислот мікобактерій первинно виділених від ондатр (суцільна лінія) і пасажованих через організми морської свинки і кроля (пунктирна лінія). Показники відкладено на логарифмічній шкалі (lg).

Виявлені більш вищі вірулентні властивості мікобактерій, виділених від ондатр, мають прямий зв'язок з вищим вмістом загальних ліпідів у 2,0 рази; довголанцюгових вільних жирних кислот - у 2,9 раза, ніж у мікобактерій польового ізоляту. Отримані дані співзвучні з результатами досліджень Л. М. Пінчук і А. Л. Лазовської (1989).

Ідентифікація виділених від ондатр мікобактерій за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції. Неможливість встановлення виду виділених із організму ондатр мікобактерій за допомогою офіційно рекомендованої біологічної проби на лабораторних тваринах зумовило використання для досягнення мети полімеразно-ланцюгової реакції. Досліджували ізоляти мікобактерій штаму “Ондатра” пасажовані: двократно і трикратно через організм морських свинок; через систему організмів морська свинка - морська свинка - кріль. Встановлено, що отримані мікобактерії як і контрольного ізоляту належать до виду Mycobacterium bovis.

На основі даних молекулярно-генетичних досліджень можемо з високою ймовірністю вважати, що мікобактерії штаму “Ондатра” належать до виду Mycobacterium bovis, а пасажування через організм морських свинок і кролів не змінює їх генотипових ознак.

Вищенаведені дані щодо високої патогенності, мінливості вірулентних, культуральних і морфологічних характеристик мікобактерій штаму “Ондатра” вказують на їх здатність ефективно адаптуватися до змін у біотичному й абіотичному середовищах та за певних умов включатися у розвиток епізоотичного процесу, підтримуючи стаціонарність функціонування останнього.

Встановлена нами циркуляція Mycobacterium bovis серед ондатр, а іншими дослідниками (Buddle B. M. et al., 2000; Livingston P. G., 2000) і серед інших ссавців дикої фауни, дозволила розробити концептуальні положення щодо існування епізоотичного процесу туберкульозу великої рогатої худоби у дворівневому вимірі зі зворотним зв'язком: вищий рівень обумовлюють ланки ланцюга прямого зв'язку - інфікована велика рогата худоба-механізм передачі збудника-продуктивні і дикі тварини; нижчий - ланки ланцюга зворотної дії - джерело мікобактерій екологічних ніш-механізм передачі патогенних мікобактерій-велика рогата худоба.

Висновки

У дисертації наведено епізоотологічні особливості поширення туберкульозу великої рогатої худоби в просторі і часі та обґрунтовано можливу підтримку стаціонарності неблагополуччя скотарства ссавцями дикої фауни - ондатрами. Вперше експериментально доведено, що ондатра внутрішніх водойм України є однією з екологічних ніш М. bovis, а виділений із її органів штам мікобактерій має високі вірулентні та патогенні властивості для лабораторних тварин. Розроблена концепція дворівневого ланцюга епізоотичного процесу інфекції M. bovis зі зворотним зв'язком є теоретичною основою побудови системи протитуберкульозних заходів.

1. У ХХ і на початку ХХІ століть епізоотичному процесу туберкульозу великої рогатої худоби притаманні панзоотичність і нерівномірність напруженості в часі та просторі, що обумовлено, в значній мірі, наявністю джерел і екологічних ніш М. bovis серед тварин дикої фауни та сприйнятливих до цього виду мікобактерій свійських тварин.

2. Уперше встановлено, що в організмі ондатр внутрішніх водойм інфекційний процес обумовлений М. bovis, які, перебуваючи в невластивому господарі, досягають надзвичайно високої вірулентності, що обумовлює активний розвиток туберкульозного процесу у морських свинок, кролів і курей та унеможливлює використання загальновизнаної методики ідентифікації видів мікобактерій - біологічної проби на вказаних видах лабораторних тварин.

3. Ондатра внутрішніх водойм може виступати в епізоотичному процесі туберкульозу великої рогатої худоби в триєдності - природного резервуару, джерела збудника інфекції та підсилювача вірулентних ознак M. bovis, що може сприяти стаціонарності туберкульозу в окремих господарствах, регіонах, країнах і континентах.

4. Первинно виділені із органів ондатр мікобактерії здатні: рости на щільних яєчних живильних середовищах, змінюючи при трикратному пасажі in vitro швидкість росту при температурі 37 єС з 28- до 18-и діб, при t 45 єС з 29-и до 23-х і при 22 єС з 37- до 29-и діб; формувати дрібні ізольовані, кольору слонової кістки колонії кислотостійких мікобактерій; фарбуватися за методом Ціля-Нільсена у червоно-малиновий колір; змінювати в процесі пасажування in vitro довжину мікобактерій з 1,5-2,0 до 0,9-2,5 мкм та форму - з прямих із заокругленими краями паличок до зігнутих і чітко визначеними внутрішньоклітинними включеннями.

5. Біологічними особливостями мікобактерій штаму “Ондатра” є здатність:

- розмножуватись та викликати розвиток специфічної патології в органах морських свинок, кролів і курей;

- викликати шкірну форму туберкульозу у морських свинок;

- зумовлювати розвиток латентного перебігу інфекції у білих щурів та посилювати ознаки вірулентності для цього виду тварин після першого пасажу;

- проявляти сенсибілізуючу і токсичну дію на організм досліджуваних тварин.

6. При пасажуванні первинно виділених від ондатр мікобактерій через організми: морських свинок - три рази; кролів - два рази; курей - два рази; кроля і морської свинки; морської свинки і кроля; кроля і курки; курки і кроля; курки і морської свинки; морської свинки і курки зберігається висока вірулентність для птиці і кролів та підвищується - для морських свинок.

7. Мікобактерії штаму “Ондатра”, порівняно із польовим ізолятом мікобактерій (контроль) мають: вищий у 2,0 рази вміст сумарних ліпідів і у 2,9 раза довголанцюгових вільних жирних кислот, переважно за рахунок генейкозанової та пентакозанової; здатність підвищувати за умов триразового пасажування через організм морських свинок і систему - морська свинка-кріль, вміст вільних жирних кислот довголанцюгової та знижувати - коротколанцюгової фракції.

8. Мікобактерії штаму “Ондатра” за генетичними ознаками, виявленими в ПЛР, належать до збудника туберкульозу бичачого виду, а за проявом високої вірулентності для лабораторних тварин - до зміненого різновиду М. bovis, потенційно здатного обумовлювати епізоотичний процес туберкульозу серед ссавців і птиці.

9. Циркуляція М. bovis серед ссавців дикої фауни, може обумовлювати виникнення, поширення і стаціонарність (довготривалість) неблагополуччя скотарства щодо туберкульозу у зв'язку з існуванням епізоотичного дворівневого ланцюга зі зворотнім зв'язком, в якому взаємодіють: ланки ланцюга прямого зв'язку - джерело і механізм передачі збудника інфекції-продуктивні і дикі тварини; ланки ланцюга зворотнього зв'язку-мікобактерії екологічних ніш-механізм їх передачі-сприйнятлива велика рогата худоба.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. При оцінці епізоотичної ситуації, визначенні причин повторного спалаху та стаціонарності епізоотичного процесу туберкульозу тварин, а також організації профілактичних і оздоровчих протитуберкульозних заходів у господарствах необхідно вивчати наявність джерел і екологічних ніш серед тварин дикої фауни, у т.ч. ондатр.

2. Результати досліджень щодо існування в природі екологічних ніш хвороботворних мікобактерій використовувати при плануванні та проведенні науково-дослідних робіт з питань епідеміології й епізоотології та диференційної діагностики туберкульозу, а також плануванні і проведенні протитуберкульозних заходів.

3. Одержані дані щодо особливостей розвитку епізоотичної ситуації у світі й Україні та біологічної характеристики нововиявленого високовірулентного штаму мікобактерій використовувати в лабораторній справі, навчальних програмах підготовки студентів, післядипломного навчання фахівців за спеціальністю “Ветеринарна медицина” та проведенні науково-дослідних робіт з туберкульозу.

4. При неможливості встановлення виду патогенних мікобактерій, виділених із органів тварин, за допомогою біологічної проби використовувати молекулярно-генетичні методи досліджень культур мікобактерій - полімеразно-ланцюгову реакцію.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бусол В. О. Вірулентність мікобактерій, виділених від ондатр / В. О. Бусол, В. М. Мазур // Ветеринарна медицина: міжвід. темат. наук. зб. / матеріали Міжнар. конгресу з ветеринарної медицини, присвяч. 85-річчю Нац. наук. центр “Ін-т експериментальної і клінічної вет. медицини”. - Х., 2008. - Вип. 91. - С. 87-89. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).

2. Бусол В. О. Туберкульоз шкіри у тварин / В. О. Бусол, В. М. Шевчук, В. М. Мазур // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2008. - Вип. 127. - С. 53-56. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).

3. Бусол В. О. Динаміка розвитку патологічного процесу у морських свинок, інфікованих мікобактеріями штаму “Ондатра” / В. О. Бусол, В. М. Шевчук, В. М. Мазур // Науково-технічний бюлетень. Ін-т біології тварин УААН; М-во аграр. політики України, Держ. наук.-дослід. контрол. ін-т вет. препаратів та кормових добавок - Львів, 2009. Вип. 10. - № 4. - С. 121-124. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).

4. Бусол В. О. Екологія Mycobacterium bovis / В. О. Бусол, В. М. Шевчук, В. М. Мазур // Ветеринарна медицина: міжвід. темат. наук. зб. / Нац. наук. центр «Ін-т експериментальної і клінічної вет. медицини». - Х., 2009. - Вип. 92. - С. 77-80. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).

5. Бусол В. А. К вопросу эпизоотологического и эпидемиологического значения микобактерий, выделенных от ондатр / В. А. Бусол, В. Н. Мазур, В. А. Сытник, В. Н. Шевчук // Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц: Сборник научных трудов ведущих учёных России и Зарубежья. - Екатеринбург: Уральское изд-во, 2010. - Вып. 3 - С. 93-97. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).

6. Мазур В. М. Ліпідний склад мікобактерій, виділених від ондатр / В. М. Мазур // Науковий вісник ветеринарної медицини: Зб. наук. праць. - Біла Церква, 2010. - Вип. 6 (79). - С. 92-93.

7. Бусол В. О. Порівняльна оцінка сприйнятливості лабораторних тварин різних видів до мікобактерій штаму “Ондатра” / В. О. Бусол, В. М. Мазур // Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України. - 2010. - Вип. 151, Ч. 2. - С. 32-37. (Здобувач провів експериментальні дослідження і брав участь у підготовці статті до друку).