Особливості відтворення генотипів декоративних форм бука лісового

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державний вищий навчальний заклад

Національний лісотехнічний університет України

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

ОСОБЛИВОСТІ ВІДТВОРЕННЯ ГЕНОТИПІВ ДЕКОРАТИВНИХ ФОРМ БУКА ЛІСОВОГО

Спеціальність: Лісові культури та фітомеліорація

Лісовий Микола Миколайович

Львів, 2010 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми дисертації. Відтворення генотипів декоративних форм бука лісового є актуальним питанням для лісівників України. Декоративні форми досліджуваної породи важко розмножуються насінним способом, а більшість з них в умовах України не плодоносять. Відомо, що найкраще при відтворенні цінних генотипів бука лісового, а саме його декоративних форм, використовувати вегетативні способи розмноження (Каплуновский 1972, Козлов 1991, 2003). При цьому дані про поширеність цих форм у міських, паркових та вуличних насадженнях є суперечливими. Тому інвентаризація та дослідження біології декоративних форм досліджуваної породи, розробка принципово нових та модифікація існуючих сучасних екологічно та економічно ефективних способів вегетативного відтворення цінних генотипів бука лісового допоможуть вирішити низку завдань з вирощування декоративного садивного матеріалу конкретного генотипу для забезпечення потреб зеленого господарства.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Напрямок дослідження дисертаційної роботи узгоджується з науково-дослідною роботою кафедри: "Селекційні основи збереження та відтворення генетичного потенціалу лісотвірних порід мікроклонуванням" (шифр ДБ 08.12-05-06, № державної реєстрації 0105U009088), в якій дисертант брав участь як виконавець відповідних розділів.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка сучасних напрямів і технологій виробництва садивного матеріалу цінних декоративних генотипів бука лісового. Для досягнень поставленої мети було заплановано вирішення таких завдань:

- відбір, дослідження та інвентаризація маточних рослин найбільш поширених декоративних форм бука лісового;

- встановлення найбільш ефективного вегетативного способу розмноження досліджуваних генотипів бука лісового;

- підбір оптимальних умов для циклу мікроклонального розмноження декоративних форм бука лісового;

- розрахунок економічної ефективності різних способів відтворення генотипів бука лісового.

Об'єкт досліджень: процес розмноження декоративних форм бука лісового.

Предмет досліджень: особливості відтворення генотипів декоративних форм бука лісового.

Методи дослідження. У дисертаційній роботі були використані такі методи:

- таксаційні - для визначення біометричних показників досліджуваних дерев;

- математично-статистичні - для обробки експериментальних даних;

- метод культури тканин - для мікроклонального розмноження генотипів бука лісового;

- методи вегетативного розмноження (щеплення та живцювання) для відтворення морфологічних форм бука лісового.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено принципово новий спосіб щеплення ("аблактуванням з використанням живильного середовища"), який підвищує відсоток приживлюваності досліджуваних генотипів бука лісового різних форм до 86-98% для. Модифіковано для декоративних форм досліджуваного виду технологію мікроклонального розмноження, яка забезпечує 95-98% життєздатних експлантатів. Вперше досліджено динаміку нагромадження фітомаси мериклонами декоративних форм бука лісового та встановлено оптимальний термін їх ініціації і час пасажу для фази ризогенезу. Визначено собівартість та вперше проведено порівняльний аналіз економічної доцільності використання сучасних способів розмноження найбільш цінних генотипів бука лісового.

Практичне значення одержаних результатів.

Розроблені автором технологічні карти для різних способів вегетативного розмноження рослин декоративних форм бука лісового, новий спосіб щеплення, модифікована технологія мікроклонального розмноження можуть бути використані при вирощуванні садивного матеріалу господарсько-цінних генотипів досліджуваного виду для забезпечення потреб садово-паркового господарства.

За результатами досліджень автора розроблені та впроваджені у практичну діяльність дочірнього підприємства ЛКП "Зелений Львів" ДП "Бондарівка" "Практичні рекомендації із збереження, відтворення і використання цінних генотипів бука лісового".

Результати дисертаційної роботи можуть бути використані у навчальному процесі НЛТУ України при викладанні дисциплін: "Лісова селекція", "Лісові культури", "Дендрологія", "Декоративна дендрологія", "Озеленення населених міст" для студентів лісогосподарського факультету.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота побудована на особистому виконанні автором комплексу заходів від постановки задачі і планування експерименту до узагальнення і написання дисертаційної роботи. Робота виконувалась на кафедрі лісових культур і лісової селекції Національного лісотехнічного університету України під час навчання в аспірантурі з відривом від виробництва (2006-2009 рр.).

Здобувач особисто проводив експерименти з мікроклонального та вегетативного розмноження генотипів декоративних форм бука лісового. У співавторстві розроблено принципово новий спосіб щеплення досліджуваних генотипів бука лісового ("щеплення аблактуванням з використанням живильного середовища").

Дисертантом модифіковано технологію мікроклонального розмноження, яка є оптимальною для декоративних форм бука лісового.

У наукових працях, які опубліковані у співавторстві, здобувач брав участь у зборі експериментальних матеріалів, опрацюванні теоретичного матеріалу та підготовці тексту.

Апробація результатів дисертації.

Основні положення дисертаційної роботи були викладені та обговорені на таких наукових та науково-практичних конференціях: Материалы Третьих Мелеховских чтений "Проблемы лесоведения и лесоводства" (г. Архангельськ, 2005 г.), 57-ма студентська наукова конференція УкрДЛТУ (м. Львів, 2005 р.), перша науково-практична конференція "Захист навколишнього середовища. Збалансоване природокористування" (м. Львів, 2008 р.), наукова конференція "Екологія - шляхи гармонізації відносин природи та суспільства" (м. Умань, 2009 р.), ІІ-га міжнародна науково-практична конференція "Захист навколишнього середовища. Збалансоване природокористування" (м. Львів, 2009 р.).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи висвітлено у 11 наукових працях, з них 7 - у наукових фахових виданнях.

Структура і об'єм дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, п'яти розділів, висновків та рекомендацій, списку використаних літературних джерел (258 найменувань, з них 51 іноземною мовою, 47 електронних ресурсів) та п'яти додатків. Загальний обсяг рукопису становить 189 сторінок комп'ютерного тексту, містить 38 таблиць та 53 рисунки.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літературних джерел.

Дослідженню бука лісового, а саме його ареалу, способам відтворення та раціонального застосування присвячено багато праць вітчизняних та зарубіжних авторів: Антонюк Н.Е. (1984), Арманаш В.А. (2000), Білоус В.І. (1961, 1962, 1963), Криницький Г.Т. (1973, 2004), Гаврусевич А.М. (1958, 1960), Гоморі Д. (1995), Гречаник Р.М. (2000, 2001, 2004), Гузь М.М. (2009), Калінін М.І. (1992), Каплуновский П.С. (1972), Козлов В.Г. (1988, 1989, 1990, 1991, 2003), Мальцев П.М. (1964, 1980, 1988), Миклуш С.І. (2001, 2005), Молотков П.І. (1959, 1966, 1985), Мякушко В.К. (1991, 1993), Соколов С.Я. (1951), Третяк Ю.Д. (1954, 1958, 1960), Швадчак І.М. (1994, 1995), Ahuja M.R.(1982, 1988), Chalupa V. (1985), Denk T. (2003), Hazler K. (1997) та ін.

Проведено критичний аналіз літературних джерел та зроблено висновок про необхідність дослідження та пошуку сучасних економічно та екологічно доцільних, ефективних способів відтворення генотипів декоративних форм бука лісового.

Матеріали та методи досліджень.

Для вирішення питань відтворення генотипів декоративних форм бука лісового використовували загальноприйняті методики досліджень. Досліджували: насінне, вегетативне (живцювання і щеплення) розмноження та мікроклональне розмноження.

Насінне розмноження. Заготівля плодів бука лісового проводили у жовтні та першій декаді листопада. Після чого їх закладали на зберігання. Стратифікацію проводили наступним чином: зволожували плоди до 31% і витримували при температурі 3°С 1,5-2,5 місяці, поки проросте 10%, після чого висівали в ґрунтовий субстрат.

Живцювання. Для живцювання використовували зелені живці 1-2 річних пагонів декоративних форм бука лісового, які заготовляли з середньої частини крон дерев для запобігання явища топофізису, починаючи з кінця лютого і до середини травня. Зберігання проводили у холодильній шафі при температурі -2-+2°С. Висаджували живці з початку травня до кінця першої декади червня у культиваційних спорудах з "біопідігрівом" та туманоутворувальною установкою.

Як стимулятори використовувалась нафтилоцтова кислота (НОК), індомілоцтова кислота (ІОК) та індомілмасляна кислота (ІМК) у концентраціях від 30 до 100 мг/л.

Щеплення. При проведенні наших досліджень були вибрані наступні способи щеплення: у розщеп, вприклад, покращене зближення та розроблений нами спосіб "зближенням із застосуванням поживного середовища". Пагони для прищеп заготовляли довжиною 15-20 см. у другій декаді березня та зберігали при температурі +2-0°С у холодильній шафі. Щеплення проводили з початку до середини квітня. Як підщепи використовували 5-річні саджанці бука лісового. Мікроклональне розмноження. У якості експлантатів, ми використовували апекси верхівкових та бічних бруньок. Стерилізацію посуду та інструментів проводили сухим жаром у сушильній шафі при температурі 180°С протягом 1-1,5 год., попередньо загорнувши їх у алюмінієву фольгу.

Перед початком садіння експлантатів, інструменти знову стерилізували замочивши їх у 96%-й етанол та профламбувавши над спиртівкою. Після проведення кожної операції по садінню експлантатів на середовище стерилізацію фламбуванням повторювали. Стерилізацію ламінарної кімнати проводили за допомогою бактерицидних ультрафіолетових ламп протягом 1,5-2 год. Експлантати стерилізували наступними реагентами: етанол (С2Н5ОН), вода з господарським милом, "Білизна" (NaClO), перекис водню (Н2О2), нітрат срібла (AgNO3). Для ініціації використовували наступні види живильних середовищ: Р-24, WPM, та Мурасіге-Скуга (МS) модифіковані різною кількістю ауксинів та цитокінінів. Після отримання достатньої кількості мериклонів їх пересаджували на вкорінення, де використовували середовище МS із зменшеною у 2-4 рази концентрацією мінеральних солей. Кількість цукрози зменшували до 0,5-1% і повністю виключали із складу цитокініни. Приріст та нагромадження фітомаси експлантатів виражали відносно вихідних параметрів.

Розрахунок проводили за формулою Капліна (1946):

Де:

М - відносний приріст експлантата;

W0 - вихідний розмір (маса) експлантата;

W1 - кінцевий розмір (маса) експлантата.

При розрахунку собівартості одиниці садивного матеріалу користувались діючими нормами виробітку, тарифними ставками та ринковими цінами на необхідні матеріали.

Інвентаризація досліджуваних генотипів бука лісового.

Як піддослідні (маточні) дерева ми обрали морфологічні форми, які зростають у ботанічних садах та парках Львівщини. Для заготівлі рослинного матеріалу було відібрано 29 дерев семи декоративних форм бука: f. 'Quercifolia' (дуболиста - 1 шт.), f. 'Luteo-variegata' (жовто-строката - 1 шт.), f. 'Fastigiata rotundifolia' (пірамідальна круглолиста - 1 шт.), f. 'Pendula' (плакуча - 5 шт.), f. 'Roseo-marginata' (рожево-облямована - 2 шт.), f. 'Laciniata' (розсіченолиста - 2 шт.), f. 'Purpurea' (пурпуроволиста - 17 шт.). Також було проведено фотофіксацію та заміри біометричних показників досліджуваних маточних дерев.

Відтворення генотипів бука лісового.

Насінне розмноження генотипів декоративних форм бука лісового. У 2007-2008 рр. було зібрано 12714 плодів пурпуроволистої форми (f. 'Рurpurea') бука лісового (інші форми не плодоносять або дають невиповнене насіння). Відбір повного насіння проводили методом флотації, яким отримали близько 160 плодів, що становило 1,29% від загальної кількості зібраних. Через 1,5-2 місяці після висівання зійшло 3-3,5% сходів, що є недостатнім для масового відтворення досліджуваних форм. Слід зазначити, що аналогічна ситуація спостерігається із природним поновленням декоративних форм бука лісового.

Живцювання генотипів декоративних форм бука лісового. Живці (1-2 річні пагони) заготовляли з кінця зими до середини весни із пурпуроволистої (f. 'Рurpurea'), повислої (f. 'Pendula'), рожево-облямованої (f. 'Roseo-marginata') форм та бука лісового для контролю. Живцювання проводили протягом трьох років, щоб мати достатньо часу для перевірки впливу різних чинників (віку живців, часу проведення живцювання, терміну зберігання пагонів, виду стимулятора вкорінення та його концентрації) на приживлюваність живців. з кінця зими до середини весни. Як стимулятори вкорінення застосовували НОК, ІМК, ІОК у концентраціях 30, 50 та 100 мг/л. Для контролю використовували водопровідну воду. Найбільшою життєздатністю (більше 96%) відзначались живці, які зберігалися 2-3 тижні, або були заготовлені безпосередньо перед проведенням живцювання. На 30-35 день вирощування спостерігали припинення росту та всихання частини живців, що залежало від виду та концентрації стимулятора росту. Спочатку гинули живці, які оброблялись звичайною водопровідною водою (на 35 день культивування загинуло 96,6% живців). Найбільше життєздатних живців бука лісового через 35 днів після пікірування спостерігалось при використанні таких стимуляторів росту: НОК (30 мг/л) - 94,3%, ІОК (50 мг/л) - 91,3%, ІОК (30 мг/л) - 87,7%, НОК (50 мг/л) - 82,7%. Найменше - при обробці пагонів водопровідною водою - 3,4%. Також незадовільними є результати застосування ІМК у всіх концентраціях.

Загальний термін вирощування живців складав 65-70 днів. Утворення калюсу та корінців нами не було відмічене у жодного живця. Отже, відтворення декоративних форм бука лісового способом вкорінення стебловими живцями є недоцільним, що підтверджуються дослідженнями ряду авторів. Щеплення генотипів декоративних форм бука лісового. Розмноження проводили способами щеплення, які є найбільш придатними для бука лісового, а саме: в розщеп, вприклад та зближенням (аблактуванням).

Як підщепи використовували 5-річні саджанці бука лісового, а як прищепи - 1-2-річні пагони рожево-облямованої (f. 'Roseo-marginata'), жовтолистої (f. 'Zlatia'), круглолистої (f. 'Rotundifolia'), повислої (f. 'Pendula') та пурпуроволистої (f. 'Рurpurea') форм бука лісового.

При щепленні врозщеп через 8-12 днів спостерігалось бубнявіння бруньок після цього розвиток вегетативних органів припинявся і всі прищепи морфологічних форм всихали.

При використанні способу вприклад найкраща приживлюваність відмічена у пурпуроволистої (64%) та плакучої (56%) форм бука лісового, а найгірша - у жовтолистої форми (лише 14%) форми. У прищепи рожево-облямованої та круглолистої форм відмічена приживлюваність 24 і 36% відповідно. Це може бути спричинене різними факторами: віком та індивідуальними особливостями материнських дерев і підщепи.

Спосіб щеплення зближенням показав високі результати для усіх декоративних форм бука лісового - 70% і більше приживлюваності. Тому нами було розроблено модифікацію цього способу - "щеплення аблактуванням із використанням поживного середовища".

Найбільш близьким прототипом пропонованого способу щеплення бука лісового є щеплення 2-3-річними живцями форм бука "вприклад за модифікацією В.Г. Козлова" (2003).

Відмінність пропонованого нами способу полягає у застосуванні живильного середовища для підтримання життєздатності прищепи і стимулювання морфо-фізіологічних процеси під час зростання з підщепою підвищує приживлюваність щеплених дерев.

Хімічний склад поживного середовища, який використовувався у наших дослідженнях містить всі необхідні елементи для росту та розвитку рослин і є наближеним за складом до поживних середовищ, які застосовують при мікроклональному розмноженні.

Щеплення декоративних форм бука лісового способом "щеплення аблактуванням із використанням живильного середовища" дає найвищий відсоток приживлюваності: від 84% для пурпуроволистої і до 98% для круглолистої форм. Проведена порівняльна характеристика застосованих способів щеплення декоративних форм бука лісового.

Як контроль використовували результати щеплення "вприклад за модифікацією В.Г. Козлова". Слід відмітити, що використання запропонованого нами способу щеплення для декоративних форм бука лісового підвищує приживлюваність у порівнянні із контролем на 105,4-235,0% для всіх, без винятку, морфологічних форм. При цьому, приживлюваність плакучої та пурпуроволистої форм бука лісового при щепленні зближенням перевищує контроль на 140,6 та 120,6% відповідно. Приживлюваність прищеп рожево-облямованої форми цим способом є аналогічною до контролю. У всіх інших випадках приживлюваність контролю є вищою. Отже, запропонований нами спосіб щеплення декоративних форм бука лісового "покращеним зближенням із застосуванням живильного середовища" дає найкращі результати (від 86 до 98%) приживлювання всіх декоративних форм бука лісового і тому може бути використаний для масового промислового виробництва садивного матеріалу досліджуваних господарсько-цінних генотипів бука лісового.

Таблиця 1. - Приживлюваність декоративних форм бука лісового при різних способах щеплення:

Розмноження генотипів декоративних форм бука лісового методом in vitro. Проведені нами дослідження з відтворення генотипів бука лісового in vitro можна умовно розділити на 4 основні етапи: стерилізація вихідного рослинного матеріалу, культивування експлантатів на поживному середовищі, укорінення експлантатів на поживному середовищі та адаптація отриманих клонів до ґрунтових умов.

Стерилізація експлантатів виконувалась почерговим їх занурюванням у відповідні реагенти-стерилізатори з певною експозицією: етанол (С2Н5ОН) (в концентрації 50-96%), протічну воду з детергентом (мило господарське) (тривалістю 2-24 год.), гіпохлорид натрію (NaClO) (в концентрації 30-70%), двоокис водню (Н2О2) (в концентрації 1-3%), нітрат срібла (AgNO3) (у концентрації 0,1-0,3%). Після обробки кожним реактивом експлантати промивались три рази дистильованою стерильною водою протягом 5-8 хвилин. Для подолання внутрішньої інфекції експлантатів використовували 10%-й розчин антибіотику "Цефазолін-КМП".

Найбільший вихід асептичних експлантатів спостерігався при стерилізації виконанням наступних послідовних операцій: занурення бруньок на 15 сек. у 96%-й етанол (видалення воскового нальоту), знімання верхнього шару лусок бруньки, промивання експлантатів протягом 24 год. протічною водою з господарським милом (для видалення механічних домішок), занурення на 15 хв. у 30%-й розчин хлорки, занурення на 10 сек. у 70%-й етанол, занурення на 15 сек. у 2%-й розчин перекису водню, занурення на 10 хв. у 0,2%-й нітрат срібла. Після кожного реагенту - триразове промивання стерильною дистильованою водою.

Ініціація експлантатів на живильному середовищі. Простерилізовані експлантати переміщували до ламінарної кімнати і висаджували у пробірки з живильним середовищем, які щільно закривали корками із фольги. Культивування проходило у культуральній кімнаті на стелажах із 16-годинним фотоперіодом (3000 Лк) при температурі 21-22°С і відносній вологості повітря 33-35%.

Для культивування експлантатів декоративних форм бука лісового використовували три типи базових живильних твердих середовищ (Р-24, WPM, MS), модифікувавши їх з допомогою різного співвідношення та концентрації ауксинів (НОК, ІОК, ІМК) та цитокінінів (БАП, кінетин).

При культивуванні на середовищах з підвищеним вмістом цитокінінів, експлантати поступово накопичували в їх тканинах більше необхідного фізіологічного рівня. Це явище призводило до появи токсичної реакції. Також спостерігається пригнічення проліферації пазушних меристем та зниження здатності рослин до вкорінення.

Культивування генотипів бука лісового тривало 28-32 днів. Через 10-15 днів від початку вирощування спостерігалось пригнічення росту експлантатів, а згодом і повне припинення розвитку на живильних середовищах, де концентрація цитокінінів перевищувала 2 мг/л.

Аналогічною була реакція мериклонів на середовищах з високим (більше 5 мл/л) вмістом ауксинів. Тут пригнічення розвитку наступало трохи пізніше - через 18-22 дні. У середовищах з повністю відсутніми ауксинами ріст експлантатів взагалі був відсутнім.

Найкращі результати при культивуванні експлантатів морфологічних форм бука лісового ми отримали при використанні таких живильних середовищ: MS, 2,0 мг/л, НОК, 0,5 мг/л, ІМК, 0,5 мг/л, К, 0,5 мг/л, БАП (98%) (тут загинув лише один експлантат після 25 днів (2-й етап), MS+1,0 мг/л НОК+0,5 мг/л ІОК+0,5 мг/л ІМК+1,0 мг/л К (82%) (після першого етапу загинуло 5 експлантатів, після другого - 4), MS+1,0 ІОК+1,0 ІМК+0,5 БАП (78%) (після першого етапу загинуло 6 експлантатів, після другого - 5), WРМ, 2,0 мг/л, НОК, 0,5 мг/л, ІМК, 0,5 мг/л, К, 0,5 мг/л, БАП (56%) (після першого етапу загинуло 7 експлантатів, після другого - 15). Живильні середовища, де життєздатність експлантатів менше 50%, на нашу думку, застосовувати недоцільно.

Через 32-35 днів ріст та розвиток експлантатів припинявся, а після 60 днів клони починали всихати. Це спричинено тим, що експлантати використали усі поживні елементи середовища. Тому після вирощування клонів протягом 28-32 днів ми пересаджували їх для вкорінення на нове живильне середовище.

Фаза ризогенезу експлантатів. Для укорінення експлантатів готували агаризоване живильне середовище, яке розливали у скляні посудини об'ємом 250 мл., по 50 мл. у кожну. Пересаджування клонів проводили у простерилізованій протягом 1-1,5 год. ультрафіолетом ламінарній кімнаті. Інструмент стерилізували як і на першому етапі. Пересаджування експлантатів на вкорінення виконували у наступній послідовності: максимально швидко відкривали пробірку та діставали з неї експлантати, клон поміщали на чашку Петрі та видаляли нижню пару листків, поміщали експлантати у 10%-й розчин антибіотику "Цефазолін-КМП" (для запобігання зараження), висаджували клон на нове живильне середовище у банки, які щільно закривали корком із фольги. Після пересаджування кожного окремого експлантата проводили стерилізацію інструменту фламбуванням, а після садіння десяти клонів - заміняли розчин антибіотику на новий.

На цьому етапі досліджень використовували лише середовище MS, але модифікували основний його склад наступним чином: зменшували у 2-4 рази концентрацію мінеральних солей, кількість сахарози зменшували до 0,5-1,0% і в деяких варіантах повністю виключали із складу цитокініни. Спостереження за процесом коренеутворення експлантатів проводили протягом 35 днів на різних живильних середовищах.

У всіх, без винятку, середовищах, де у складі були цитокініни, процес укорінення не спостерігався. Найбільший відсоток експлантатів, які утворили кореневі системи, культивувались на живильному середовищі 0,5 MS, 1,0 мг/л, НОК, 1,0 мг/л, ІМК. У цьому варіанті досліду перші вкоріненні експлантати з'явились вже на 17 день, а на 29 день укорінилось 48 експлантатів, після чого утворені корінці досить швидко росли і на 37-40 день досягли розміру 4-5 см.

Після того, як у всіх експлантатів утворились та добре розвинулись корені їх пересаджували у субстрат.

Адаптація експлантатів до ґрунтових умов. Як компоненти субстрату ми використовували крупнозернистий пісок, дерновий ґрунт, торф та готові торфотаблетки. Усі види приготованих субстратів стерилізували у сушильній шафі при температурі близько 90°С протягом 1,5 год., попередньо обробивши 0,5% розчином марганцевокислого калію.

Щоб підібрати оптимальний субстрат для пересаджування та адаптації рослин-регенерантів генотипів бука лісового використовували наступні ґрунтосуміші (рН усіх типів субстратів рівний 5,75):

- крупнозернистий пісок;

- дерновий ґрунт з крупнозернистим піском (1:1);

- дерновий ґрунт з крупнозернистим піском та торфом (1:1:1);

- готові пресовані торфотаблетки ("Jiffy-7 Forestry").

Дослідження показали, що на процес адаптації суттєво впливає склад субстрату. Найбільш придатними для адаптації є готові торфотаблетки (життєздатність рослин 94% через 30 днів) та суміш дернового ґрунту з крупнозернистим піском та торфом у співвідношенні 1:1:1 (життєздатність рослин 74% через 30 днів).

Адаптацію рослин до ґрунтових умов проводили поступово. На перший період (25-30 днів) рослини зверху накривали простерилізованими скляними ємкостями. Під склом вологість повітря становила близько 100%, що запобігало пересиханню експлантатів. На вирощування рослини-регенеранти поміщались у культуральну кімнату. Культивування проводилось при фотоперіоді, аналогічному як для ініціації та фази вкорінення.

Через 30 днів вирощування і адаптації рослин-клонів під скляними посудинами вони збільшили свої лінійні розміри на 50-60%. Це свідчило про їх приживлюваність до умов застосованого субстрату. Далі ми почали поступове загартовування їх до умов відкритого ґрунту.

Загартовування проводили поступовим зниженням вологості повітря, що спричинило утворення нових фотосинтезуючих листків. Через 35 днів після пікірування рослин-регенерантів, ми знімали скляні ємкості вдень на термін з 900 до 1700 протягом 12 днів, після чого рослини повністю відкрили. На 50 день рослини переносили у культивувальні теплиці, де за ними проводився догляд, як за звичайними сіянцями. У клонів спостерігався дуже добрий ріст, що спричинено відсутністю хвороб та шкідників при культурі in vitro. Через три місяці після перенесення клонів у теплицю вони досягали висоти надземної частини більше 6-7 см.

Нагромадження експлантатами фітомаси при культивуванні. Для визначення оптимального терміну культивування експлантатів генотипів бука лісового і час пересаджування їх на вкорінення ми визначили динаміку нагромадження клонами фітомаси. Для цього було відібрано експлантати, які характеризувалися відносно однаковою довжиною і масою та були, порівняно, найбільшими за лінійними розмірами (для зручності виконання замірів). Клони були висаджені на початку квітня і культивувалися 50 днів на підібраному нами поживному середовищі: MS+2,0 мг/л НОК+0,5 мг/л ІМК+0,5 мг/л К+ 0,5 мг/л БАП.

Заміри виконували кожні 10 днів. Довжину визначали з точністю до 0,5 мм, а масу - до 0,01 г.

Встановлено, що найінтенсивніше нагромадження фітомаси та ріст експлантатів спостерігається у період з 20 по 30 дні культивування (на 50-60%). До сорокового дня вирощування спостерігається незначний розвиток клонів і лише в окремих варіантах. На 50 день культивування ми, практично, не спостерігаємо жодних змін у масі та розмірах експлантатів.

Отже, достатнім терміном культивування експлантатів, за який вони накопичують максимальну фітомасу та лінійну довжину є 30-32 дні.

Надалі їх ріст та розвиток припиняється і рослини-регенеранти необхідно пересаджувати у нове живильне середовище на вкорінення або проводити мультиплікацію пагонів.

Розмноження садивного матеріалу декоративних форм бука лісового. Підібравши експериментальним шляхом найкращий спосіб стерилізації, оптимальний термін заготівлі рослинного матеріалу, оптимальний склад живильних середовищ та субстрату для адаптації рослин-регенерантів, ми провели мікроклональне розмноження різних декоративних генотипів бука лісового. Отримані результати свідчать, що приживлюваність клонів генотипів бука лісового, практично, однакова для всіх форм і становить 94-98%. Для проведення порівняльної характеристики ефективності мікроклонального розмноження декоративних форм бука лісового, як контроль використали результати способу щеплення аблактуванням з використанням поживного середовища, оскільки при його застосуванні нами були отримані найкращі результати. Ефективність відтворення генотипів бука методом культури тканин є вищою порівняно із запропонованим нами способом щеплення (табл. 2).

Таблиця 2. - Приживлюваність рослин декоративних форм бука лісового методом in vitro:

Слід відмітити, що розмноження бука лісового мікроклональним способом характеризується високою стабільністю для всіх морфологічних форм, тому цей спосіб ми рекомендуємо для масового вирощування садивного матеріалу рідкісних декоративних форм бука лісового.

Найбільша ефективність відтворення генотипів бука лісового методами щеплення, отримана при використанні запропонованого нами способу щеплення - від 86% до 98%. Найнижчі результати отримані при розмноженні методом щеплення вприклад - від 14% до 64% (для пурпуроволистої форми). Найвищі та стабільні результати отримані при розмноженні генотипів бука лісового методом культури тканин - від 95% (для жовтолистої форми) до 98% (для круглолистої форми). Це пояснюється тим, що при використанні методу мікророзмноження, на відміну від щеплення, діаметр та довжина живців, а також індивідуальні особливості прищепи не мають значення. Тут, як експлантати, використовуються лише бруньки, які можна вважати однаковими для усіх маточних дерев. Зведена порівняльна характеристика результатів досліджень з відтворення генотипів бука лісового усіма застосованими нами способами, наведена у табл. 3.

Таблиця 3. - Зведені результати приживлюваності декоративних форм бука лісового:

Отже, для вирощування декоративного садивного матеріалу досліджуваної породи доцільно використовувати два методи розмноження: запропонований нами спосіб щеплення та метод культури тканин з використанням підібраного нами способу стерилізації та поживних середовищ. Економічна ефективність способів розмноження декоративних форм бука лісового та їх застосування.

Для того щоб зробити остаточні висновки ефективності різних способів розмноження досліджуваних генотипів бука лісового необхідно обов'язково враховувати собівартість розмноження одиниці садивного матеріалу та перспективу застосування рослин декоративних форм бука лісового.

Розрахунок собівартості розмноження форм бука лісового щепленням. Проведені розрахунки свідчать, що вартість вирощування 1000 шт. садивного матеріалу декоративних форм бука лісового методом щеплення становить 2731,65 грн. і 3074,25 грн. - при застосуванні способу щеплення аблактуванням з поживним середовищем (сюди включена ціна поживного розчину). Для достовірності розрахунку фактичної ціни одиниці декоративного садивного матеріалу форм бука лісового необхідно врахувати коефіцієнт розмноження, за який ми беремо відсоток прищеп, які прижилися. Встановлено, що з економічної точки зору, найефективнішими методами розмноження генотипів бука лісового є щеплення запропонованим нами способом та щеплення аблактуванням. Тут отримано, практично, однакові результати - від 3,06 грн./шт. (щеплення плакучої форми аблактуванням) до 3,90 грн./шт. (щеплення дуболистої форми аблактуванням). Слід зазначити, що при застосуванні запропонованого нами способу щеплення "аблактуванням з використанням поживного середовища" отримано більш стабільні результати (3,14-3,57 грн./шт.) Використовувати спосіб щеплення вприклад є економічно недоцільно, оскільки при використанні цього способу вартість коливається від 4,27 до 19,51 грн./шт.

Розрахунок собівартості розмноження форм бука лісового методом культури тканин. Розрахункова собівартість розмноження та вирощування 1000 шт. садивного матеріалу морфологічних форм бука лісового методом культури тканин становить 5366,73 грн. Із врахуванням коефіцієнту розмноження собівартість розмноження 1 рослини декоративної форми бука лісового мікроклонуванням є практично рівноцінною для всіх форм і коливається в межах 5,48-5,65 грн./шт.

У порівнянні із вартістю вирощування садивного матеріалу способами щеплення ціна при розмноженні in vitro є трохи вищою. Але слід враховувати, що термін вирощування щеп у двічі більший, ніж при розмноженні in vitro. Необхідно брати до уваги можливий негативний вплив умов навколишнього середовища на підщепу та можливість несумісності підщепи та прищепи. Крім того, при розмноженні генотипів бука лісового методом культури тканин потрібно набагато менше вихідного рослинного матеріалу (живців) порівняно із щепленням, оскільки використовуються лише бруньки. Аналіз асортименту декоративного садивного матеріалу, що реалізується в торговій мережі Львівщини, виявив, що морфологічні форми, хоча і користуються великим попитом, але асортимент їх обмежується кількома формами (плакуча, круглолиста, плакуча пурпуроволиста та пурпуроволиста). Тому, враховуючи ринкову ціну та розраховану нами собівартість, можна зробити висновок про доцільність промислового виробництва декоративного садивного матеріалу бука лісового запропонованим нами способом щеплення та методом культури тканин.

Враховуючи біолого-екологічні особливості, зокрема декоративні якості досліджуваного виду, є зміст його пропонувати для проектування основних компонентів міських парків: солітерів, алей та біогруп.

Включення всіх наявних дерев досліджуваних генотипів бука лісового до складу природоохоронних об'єктів забезпечить їх збереження та дасть можливість використовувати їх як джерело вихідного матеріалу для створення дослідних культур, родинних і клонових плантацій, лісонасінних плантацій, клонових архівів і колекції цінних генотипів. Це створить передумови для подальшого дослідження декоративних форм бука лісового на генетичному рівні та дасть можливість виведення абсолютно нових господарсько-цінних генотипів методами гібридизації та гетерозису, мутагенезу, розмноження in vitro, соматичної гібридизації та добору.

ВИСНОВКИ

Удосконалення та покращення методів відтворення генотипів декоративних форм бука лісового є важливим та актуальним, оскільки досліджуваний вид набув широкого застосування. Проведена інвентаризація, відібрано та досліджено 29 маточних дерев семи декоративних форм бука. Експериментально перевірено ефективність та доцільність різних способів розмноження цінних генотипів бука лісового. Підтверджено дослідження ряду авторів про недоцільність використання насінного способу розмноження для відтворення декоративних форм бука лісового. Застосування способу укорінення зеленими живцями також є недоцільним, оскільки ризогенез у живців відсутній. Економічно обґрунтовано доцільність вирощування декоративного садивного матеріалу на комерційній основі досліджуваними методами, та наведено шляхи застосування рослин декоративних форм бука лісового:

1. Встановлено, що насінне розмноження є не ефективним для більшості декоративних форм бука лісового. Перспективним напрямом відтворення досліджуваних генотипів бука лісового є вегетативне розмноження, а саме щеплення та культура тканин;

2. Із досліджуваних способів щеплення бука лісового найбільш ефективним є модифікований нами спосіб щеплення аблактуванням ("зближенням з використанням живильного середовища"), який підвищує відсоток приживлюваності для рожево-облямованої форми - 92%, жовтолистої форми - 94%, круглолистої форми - 98%, плакучої форми - 94%, пурпуроволистої форми - 86%. Інші способи щеплення є менш ефективними (вприклад: 24, 14, 36, 56 та 64% відповідно, щеплення зближенням: 70, 80, 86, 90 та 82% відповідно);

3. Отримано 98% асептичних експлантатів декоративних форм бука лісового в культурі in vitro при проведенні стерилізації застосуванням таких реагентів та експозиції у наступній послідовності: 96%-й етанол (С2Н5ОН) - 15 сек., протічна вода з господарським милом - 24 год., 30%-й розчин "Білизни" (NaClO) - 15 хв., 70%-й етанол (С2Н5ОН) - 10 сек., 2%-й перекис водню (Н2О2) - 15 сек., 0,2%-й нітрат срібла (AgNO3) - 10 хв., з триразовим промиванням після застосування кожного реагенту;

4. Високу життєздатність клонів (98%) забезпечує застосування у мікроклональному розмноженні для ініціації досліджуваних генотипів бука модифікованого живильного середовища: MS + 2,0 мг/л, НОК + 0,5 мг/л, ІМК + 0,5 мг/л, К + 0,5 мг/л, БАП;

5. Оптимальна тривалість фази ініціації експлантатів складає 30 днів. Після цього ріст та розвиток припиняється і рослини-регенеранти слід пересаджувати на укорінення чи проводити мультиплікацію пагонів;

6. Ризогенез рослин-регенерантів декоративних форм бука лісового найкраще проходить при використанні модифікованого живильного середовища: 0,5MS, 1,0 мг/л, НОК, 1,0 мг/л, ІМК, що забезпечує 96% укорінення клонів;

7. Адаптація укорінених експлантатів до ґрунтових умов найкраще проходить при застосуванні у якості субстрату готових торфотаблеток. Використання такого субстрату забезпечує збереження життєздатності у 94% рослин;

8. Масове розмноження декоративних форм бука лісового методом культури тканин забезпечує 95-98% приживлюваності рослин бука лісового різних морфологічних форм;

9. Собівартість розмноження одиниці декоративної форми бука лісового становить: при щепленні запропонованим нами методом (зближенням з поживним середовищем) - 3,14-3,57 грн./шт., при щепленні приклад - 4,27-19,51 грн./шт., при щепленні аблактуванням - 3,06-3,90 грн./шт., методом культури тканин - 5,48-5,65 грн./шт.;

10. Для збереження цінних генотипів бука лісового лісогосподарським підприємствам регіону необхідно створювати дослідні культури, лісонасінні плантації, архівно-маточні плантації, колекції з насіння і живців плюсових дерев та морфологічних, екологічних і фенологічних форм та проводити роботи щодо впорядкування існуючих та відведення нових об'єктів ПЛНБ досліджуваного виду, заходи по включенню дерев цінних генотипів бука лісового у природоохоронні об'єкти;

11. Для масового вирощування садивного матеріалу декоративних форм досліджуваної породи доцільно застосовувати розроблений нами метод культури тканин, а при відсутності відповідно обладнаної лабораторії - модифікований нами спосіб щеплення (зближенням з використанням поживного середовища). лісовий бук дерево

СПИСОК ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гречаник Р.М. Участь екзометаболітів опаду ялиці білої у мікроклональному розмноженні бука лісового / Р.М. Гречаник, А.В. Краснянський, М.М. Лісовий // Науковий вісник УкрДЛТУ: зб. наук. техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 2001. - Вип. 11.4. - С. 78-80 (збір та опрацювання теоретичного матеріалу, участь у написанні статті).

2. Гречаник Р.М. Біометричні особливості мінливості географічних культур бука лісового / Р.М. Гречаник, Г.Г. Гриник, М.М. Лісовий // Науковий вісник УкрДЛТУ: зб. наук. техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 2004. - Вип. 14.5. - С. 236-239 (проведення польових і лабораторних досліджень, участь у написанні статті).

3. Гречаник Р.М. Фізико-хімічні властивості ґрунтів географічних культур бука лісового (Fagus sylvatica L.) на Розточчі / Р.М. Гречаник, С.Б. Марутяк, М.М. Лісовий // Науковий вісник УкрДЛТУ: зб. наук. техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 2004. - Вип. 14.1. - С. 83-91 (проведення польових і лабораторних досліджень, узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

4. Гузь М.М. Сучасний стан генофонду бука лісового (Fagus sylvatica L.) на Львівщині / М.М. Гузь, Р.М. Гречаник, М.М. Лісовий // Науковий вісник НЛТУ України: зб. наук. техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2009. - Вип. 19.7. - С. 44-51 (збір та опрацювання теоретичного матеріалу, участь у написанні статті).

5. Гузь М.М. Стерилізація вихідних експлантантів морфологічних форм бука лісового при розмноженні in vitro. М.М. Гузь, Р.М. Гречаник, М.М. Лісовий // Науковий вісник НЛТУ України: зб. наук. техн. праць. - Львів: НЛТУ України. - 2009. - Вип. 19.10 - С. 7-10 (проведення лабораторних досліджень, узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

6. Лісовий М.М. Поліморфність бука лісового / М.М. Лісовий // Науковий вісник НЛТУ України. - Львів, 2008. - Вип. 19.3. - С. 33-37.

7. Мельник Ю.А. Формове різноманіття бука лісового на Львівщині / Ю.А. Мельник, Р.М. Гречаник, М.М. Лісовий // Науковий вісник УкрДЛТУ: зб. наук. техн. праць. - Львів: УкрДЛТУ. - 2003. - Вип. 13.4. - С. 83-88 (проведення польових досліджень, узагальнення отриманих результатів, участь у написанні статті).

Размещено на Allbest.ru