Клональне мікророзмноження і отримання оздоровленого садивного матеріалу винограду в культурі in vitro

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Бугаєнко Людмила Олександрівна,

професор кафедри біології, екології

і безпеки життєдіяльності.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Клітинні технології, засновані на культивуванні in vitro органів і тканин рослин, досить ефективні для одержання генетично ідентичного потомства та вільного від вірусів й інших патогенів садивного матеріалу (Калінін Ф. Л. та ін., 1980; Катаєва Н. В., Бутенко Р. Г., 1983; Висоцький В. О., 1986). Особливо актуальним є використання цих методів для розмноження багаторічних рослин і, зокрема, винограду.

Пріоритетне значення для прискореного одержання оздоровленого садивного матеріалу винограду мають методи клонального мікророзмноження в культурі in vitro. Методики клонального мікророзмноження винограду розробляються впродовж декількох десятиріч (Galzy R., 1977; Абраменко Н. М., 1980; Голодрига П. Я, 1986; Дорошенко Н. П., 1999; Батукаєв А. А., 1999), однак для широкого практичного використання окремі етапи вимагають оптимізації. Встановлено (Бургутін А. Б., 1991; Дорошенко Н. П., 2004), що процеси морфогенезу в культурі ізольованих меристем винограду характеризуються високою видовою специфічністю, тому розроблена для одного сорту методика не завжди може бути ефективною для іншого. У значній мірі це стосується живильного середовища і умов культивування експлантів, адаптації їх до умов in vivo. Не вивченими є питання реалізації морфогенетичних потенцій апікальних меристем, виділених із зимуючих бруньок (вічок) винограду.

У зв'язку з переводом розсадництва винограду на сертифіковану основу, важливими є питання оздоровлення рослин від найбільш шкодочинних вірусів (Мулюкіна Н. А., 2005, 2008), одним з найбільш ефективних методів боротьби з якими є метод культури апікальних меристем.

Таким чином, актуальність дисертаційної роботи зумовлена необхідністю оптимізації існуючих і розробки нових методів і прийомів культивування винограду in vitro, що дозволить удосконалити систему виробництва сертифікованого садивного матеріалу винограду.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи була складовою частиною науково-дослідної тематики Кримського державного агротехнологічного університету на період 2000-2005 роки "Наукове забезпечення галузей агропромислового комплексу Криму, розробка і вдосконалення технологій виробництва і переробки сільськогосподарської продукції в нових умовах господарювання" (номер державної реєстрації 0102U000128); плану ПФ "Кримський агротехнологічний університет" НАУ на період 2006-2010 роки "Наукове забезпечення галузей агропромислового комплексу Криму, розробка нових і адаптація існуючих технологій виробництва, збереження і переробки сільськогосподарської продукції в умовах становлення ринкової економіки" (номер державної реєстрації 0107U001317).

Мета й завдання досліджень. Мета досліджень - встановити особливості морфогенезу винограду в культурі ізольованих меристем in vitro та удосконалити методи клонального мікророзмноження і оздоровлення садивного матеріалу винограду для закладання безвірусних маточних насаджень в Криму.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні завдання:

- встановити оптимальні розміри експланту та склад живильного середовища для введення в культуру in vitro і індукції морфогенезу ізольованих меристем винограду з урахуванням особливостей генотипу;

- виявити особливості регенерації і визначити вплив ендогенних та екзогенних факторів на ріст і розвиток апікальних меристем винограду в культурі in vitro;

- розробити оптимальний склад живильного середовища для етапів власне мікророзмноження і укорінення мікропагонів винограду;

- визначити оптимальний субстрат для пересадження рослин в умови in vivo;

- розробити режими термотерапії в культурі in vitro, визначити ефективність оздоровлення рослин методом культури апікальних меристем і поєднанням його з термотерапією.

Об'єкт дослідження - культура in vitro ізольованих меристем винограду (Vitis vinifera L.).

Предмет дослідження - біотехнологічні методи розмноження і оздоровлення рослин у культурі ізольованих меристем in vitro винограду.

Методи досліджень: У роботі використано методи: культури ізольованих тканин і органів in vitro - визначення умов культивування і особливостей розвитку мікроклонів винограду in vitro (метод культури апікальних меристем, введення ініціальних експлантів в культуру in vitro, методи культивування мікроклонів); серологічні - виявлення та ідентифікація збудників вірусних хвороб винограду методом імуноферментного аналізу (ІФА); молекулярно-біологічні - виявлення та ідентифікація агробактерій і фітоплазм методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); термотерапія in vitro - елімінація вірусів; біометрія - визначення показників і динаміки росту та розвитку рослин і математична статистика - оцінка вірогідності одержаних результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено вплив строків добору здерев'янілих живців, кількості вічок і умов пророщування на ріст і розвиток ініціальних пагонів різних сортів винограду.

З метою оптимізації процесів морфогенезу і підвищення коефіцієнту розмноження встановлено особливості морфогенетичних потенцій апікальних меристем винограду, виділених з пасинкових бруньок і бруньок вічка. Розкрито вплив генотипу, розміру і строків добору експлантів, складу та консистенції живильного середовища на процеси морфогенезу апікальних меристем винограду сортів Молдова, Сурученський білий, Шевченко, Фрумоаса албе, Каберне Совіньон в культурі in vitro. Встановлено, що оптимальним середовищем для культивування апікальних меристем бруньок вічка є модифіковане нами живильне середовище МС_а, що забезпечує рівень регенерації досліджуваних сортів на рівні 37,5-75,0 % і підвищення основних біометричних параметрів. Виявлено можливість додаткового використання мікроживців після зрізання основного пагону для збільшення коефіцієнту розмноження. За рахунок проліферації заміщуючих бруньок протягом двох пасажів у досліджуваних сортів отримано 3,0-4,9 пагонів (8,5-14,4 вузлів).

Нами вперше розроблено і використано для адаптації мікророслин до ґрунтових умов in vivo двошаровий субстрат, що включає абсорбент, на якому частота приживання мікророслин склала 95-100 %.

Показано високу ефективність методу культури апікальних меристем розміром 0,5-0,7 мм для оздоровлення садивного матеріалу винограду від вірусу мармуровості винограду (GFkV).

Практичне значення отриманих результатів. В результаті проведених досліджень удосконалена технологія клонального мікророзмноження і оздоровлення садивного матеріалу винограду сортів Молдова, Сурученський білий, Фрумоаса албе, Шевченко, Каберне Совиньон. Технологія може бути застосована для масового одержання садивного матеріалу районованих і перспективних сортів з метою впровадження їх у виробництво, створення оздоровлених від патогенів маточників і прискореного розмноження винограду.

Отримано оздоровлені рослини винограду районованих сортів Молдова, Сурученський білий, Каберне Совіньон і перспективних - Фрумоаса албе, Шевченко та передано їх для закладання маточників у СЗАТ "КримАромат" Бахчисарайського району і ФГ "Днєстр" Первомайського району АР Крим.

Матеріали дисертаційної роботи включено в курс лекцій і лабораторно-практичних занять з дисципліни "Біотехнологія в рослинництві" для магістрантів за спеціальністю "Агрономія" та "Плодоовочівництво і виноградарство" Південного філіалу Національного університету біоресурсів і природокористування України "Кримський агротехнологічний університет", а також для магістрантів за спеціальністю "Агрономія" Миколаївського державного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною науковою працею автора. Інформаційний пошук, проведення експериментів, обробка і аналіз отриманих даних проведено автором самостійно. Разом з керівником обрано об'єкти досліджень, розроблено програму і методику проведення досліджень, підготовлено публікації.

Роботи з культури тканин виконувалися на базі Інституту ефіроолійних і лікарських рослин НААН України та Південного філіалу Національного університету біоресурсів і природокористування України "Кримський агротехнологічний університет".

Вірусологічні дослідження проведено на базі лабораторії вірусології ННЦ "Інститут виноградарства і виноробства ім. В. Є. Таїрова" НААН України разом з д.с.-г.н. Н. А. Мулюкіною і к.б.н. Л. О. Конуп.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було представлено на I Міжнародній конференції студентів і аспірантів "Молодь і поступ біології" (Львів, 2005); Науковій конференції "Сучасна біотехнологія в сільському господарстві та медицині" (Київ, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених "Сучасні проблеми агрономічної науки" (Сімферополь, 2005); П'ятій міжвузівській науково-практичній конференції аспірантів "Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи" (Вінниця, 2005); Науковій конференції "Наукове забезпечення агропромислового комплексу Криму" (Сімферополь, 2007); ІІ науковій конференції факультету лісового, садово-паркового і мисливського господарства (Сімферополь, 2008); Науковій конференції "Сучасний стан та перспективи розвитку насінництва в Україні" (Київ, 2008), ІІІ науковій конференції факультету лісового, садово-паркового і мисливського господарства (Сімферополь, 2009), Другій міжнародній науково-практичній конференції "Теоретичні і практичні питання підвищення біологічних властивостей насіння та садивного матеріалу в умовах інтеграції національного насінництва у Світовий ринок" (Київ, 2010).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 9 робіт, у тому числі 7 - у виданнях, затверджених ВАК України як фахові з сільськогосподарських наук, 2 - тези за матеріалами конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, семи розділів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури (245 найменувань, з них 66 - іноземних). Робота викладена на 188 сторінках друкованого тексту, містить 28 таблиць, 17 рисунків, 6 додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У розділі коротко викладено народно-господарське значення, ботанічні і біологічні особливості винограду, проведено аналіз результатів досліджень вітчизняних (Голодрига П. Я., 1985; Зленко В. А., 1991; Дорошенко Н. П., 1999; Батукаєв А. А., 2001 та ін.) і закордонних (Bini G., 1976; Galzy R., 1977; Triolo E., 1986; Gribaudo I., 1999 та ін.) авторів з розмноження винограду в культурі in vitro, визначено найбільш шкодочинні хвороби винограду (Мулюкіна Н. А., 2004; Щербіна О. В., 2004) та прийоми одержання оздоровленого садивного матеріалу. На підставі аналізу літературних джерел визначено суперечливі положення, недостатньо вивчені і не вивчені раніше питання; обґрунтовано актуальність і основні напрямки дисертаційної роботи.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Матеріалом для досліджень служили рослини винограду Vitis vinifera L. сортів Молдова, Сурученський білий, Каберне Совіньон, що включені до Державного реєстру сортів рослин, придатних для поширення в Україні, і сортів Шевченко і Фрумоаса албе, що є перспективними для впровадження у виробництво для умов передгірної зони Криму.

Для ізоляції експлантів у ранньовесняний строк у лабораторних умовах пророщували зрізані в осінньо-зимовий період здерев'янілі живці. В інших варіантах зелені пагони зрізали безпосередньо перед введенням в культуру in vitro на колекційній ділянці кафедри виноградарства ПФ НУБ і П України "КАТУ".

Для одержання ініціальних пагонів у лабораторних умовах пророщували одно-, двох-, трьох- і чотирьохвічкові фрагменти здерев'янілої лози відповідно до методичних рекомендацій П. Я. Голодриги та ін. (1986, 1990). Для визначення впливу ауксинів на пробудження бруньок і інтенсивність формування ініціальних пагонів використовували розчин ІОК (2 мг/л) і воду.

В якості експлантів використовували апікальні меристеми розміром 0,2-1,0 мм, які виділяли з верхівкових і пазушних бруньок винограду. Для ізоляції в перші два строки використовували апікальні меристеми з пасинкових бруньок і вічка (основну та одну-дві запасні бруньки), в літній і осінній період - тільки з вічка.

При проведенні експериментальної роботи в культурі ізольованих тканин рослин використовували методичні рекомендації Р. Г. Бутенко (1964), К. К. Kartha (1975), Ф. Л. Калініна та ін. (1980). Для культивування меристем і мікроживців у якості базового живильного середовища використовували середовище Мурасиге і Скуга (МС) (Murachige, Skoog, 1962). Склад живильних середовищ модифікували відповідно до необхідного процесу морфогенезу, змінюючи співвідношення мінеральних солей, вітамінів і доповнюючи регуляторами росту.

Експланти культивували в термостатованому приміщенні при температурі 24-26 °С, освітленні 1 тис. лк (протягом першого тижня), потім температуру знижували до 22-24 °С, а освітлення збільшували до 2,0-3,0 тис. лк, 16-ти годинному фотоперіоді та відносній вологості повітря 60-70 %. У період адаптації рослини культивували при температурі 24-25 °С, вологості 70-75 % (протягом 7 діб, потім знижували до 60 %), освітленні 3-4 тис. лк і 16-ти годинному фотоперіоді.

Виділення збудника бактеріального раку проводили за допомогою ПЛР-аналізу за методом J. Lehoczky (1971) на напівселективному середовищі Рой і Сассера (Roy, Sasser, 1983). У роботі використовували праймери до послідовності ipt Ti-плазміди. Для діагностування фітоплазмової інфекції ПЛР проводили з використанням універсальної пари праймерів до різних ділянок генома, специфічного до фітоплазм fU5/rU3. Результати реєстрували за допомогою відеосистеми "Samsung" в ультрафіолетовому світлі (312 нм). Для оцінки молекулярної маси ампліфікованих фрагментів використовували маркер розміром 800-200 і 2100-150 основ ("Амплісенс", Росія).

Тестування на наявність вірусної інфекції донорних рослин та рослин після терапії проводили методом ІФА (Clark М., 1984; Гнутова Р. В., 1985) прямим (DAS) і непрямим (DASI) сендвіч-методом (ELISA). Для діагностування використовували діагностичні набори фірми "Агрітест" (Італія). Облік результатів проводили за допомогою аналізатора імуноферментних реакцій "Уніплан", визначаючи оптичну щільність при довжині хвилі 405 нм.

Для оздоровлення садивного матеріалу винограду використовували метод культури апікальних меристем і поєднання його з термотерапією in vitro. Для термотерапії in vitro в якості модельного об'єкту використовували мікропагони сорту Каберне Совіньон висотою 12-15 мм, що регенерували з апікальних меристем розміром 0,2-0,7 мм. Культивування пагонів здійснювали на живильному середовищі МС_а з додаванням БАП (0,1 мг/л) і ГК (1,0 мг/л). Режим термотерапії: температура 38±1 °С, відносна вологість повітря 60-70 %, фотоперіод 16-год., освітленість 2-3 тис. лк.

Математичну обробку результатів досліджень проводили на персональному комп'ютері з використанням методів математичної статистики (Лакін Г.Ф., 1980, Доспехов Б.О., 1985) за допомогою програм StatGraphics Plus v5.0.1 и Excel 7.0 пакету прикладних програм Microsoft Office для Microsoft Windows.

ОСОБЛИВОСТІ ПІДГОТОВКИ ДОНОРНИХ РОСЛИН ВИНОГРАДУ ДЛЯ ВВЕДЕННЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO

Скорочення періоду спокою зрілої лози дозволяє розпочати роботи із введення в ізольовану культуру у більш ранні строки. Крім того, рослинний матеріал, отриманий у лабораторних умовах, легше звільнити від присутньої сапрофітної мікрофлори, що дозволяє підвищити кількість експлантів, вільних від контамінацій.

Вплив кількості вічок здерев'янілих живців на розвиток ініціальних пагонів. Проведені дослідження показали, що на кількість пробуджених бруньок, яка складала у досліді 43-90 %, значний вплив (68,3 %) здійснює сорт (рис. 1), тоді як на формування ініціальних пагонів винограду у більшій мірі (73,4 %) впливає кількість вічок на живцях.

Характерним для всіх сортів виявилося те, що одновічкові живці практично не формували нормально розвинених пагонів, зупиняючи ріст після формування одного-двох вузлів (табл. 1).

При використанні одновічкових пагонів формувалося в середньому 12,6 % ініціальних пагонів, використання двох-чотирьохвічкових живців сприяло формуванню 52,7-59,8 % ініціальних пагонів. Оптимальним для пророщування сортів Молдова і Сурученський білий є використання живців з чотирма вічками, які забезпечують формування 70,0 % пагонів. Сорти Шевченко, Фрумоаса албе і Каберне Совіньон формують найбільшу кількість ініціальних пагонів при використанні трьохвічкових живців. При цьому оптимальним строком добору здерев'янілих живців є грудень.

Таблиця 1

Вплив кількості вічок здерев'янілих живців на формування ініціальних пагонів, % (середнє за 2003-2006 рр.)

Вплив ІОК на формування ініціальних пагонів. Аналіз впливу строку добору здерев'янілих живців і дії ІОК на початок поновлення вегетації та інтенсивність формування ініціальних пагонів показав, що оптимальним для зрізу лози і пророщування є грудень (2-3 декада). Пробудження бруньок у цьому варіанті відзначається в середньому через 22 доби, тоді як в інших варіантах - через 37-84 доби. Істотної різниці в часі, необхідному для виходу лози зі спокою (набрякання бруньок) і відростання зелених пагонів при використанні води і 0,2 % розчину ІОК, не виявлено.

Одержання асептичних культур. Методика стерилізації рослинного матеріалу була обрана з урахуванням літературних даних (Бугаєнко Л. О. та ін., 2002). Дослідження показали, що застосування поступової стерилізації з використанням 70 % етанолу (35-40 секунд) і 50 % брадофену (10-12 хвилин) забезпечувало вихід стерильних меристем на рівні 86,7-93,3 %, приживлюваність меристем становила 86,7-100 %, при цьому оптимальна експозиція варіювала залежно від сорту. Для експлантів сортів Сурученський білий і Фрумоаса албе оптимальною є обробка етанолом протягом 35 секунд і брадофеном протягом 12 хвилин. Для сортів Молдова і Шевченко оптимальною є експозиція 40 секунд і 12 хвилин відповідно, а для сорту Каберне Совіньон - 40 секунд і 10 хвилин.

Таким чином, у результаті проведених досліджень виявлено особливості підготування рослинного матеріалу винограду для введення в культуру in vitro залежно від генотипу і умов вирощування.

ОСНОВНІ ЕТАПИ КЛОНАЛЬНОГО МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ ВИНОГРАДУ МЕТОДОМ КУЛЬТУРИ МЕРИСТЕМ В УМОВАХ IN VITRO

Ініціація розвитку меристем винограду в культурі in vitro. В якості ініціалей для виділення апікальних меристем і введення в культуру in vitro використовували не тільки пасинкову, але також центральну (основну) і одну-дві запасні бруньки вічка. Аналіз морфогенетичних потенцій апікальних меристем пасинкових бруньок і бруньок вічка винограду дозволив визначити оптимальні строки введення в культуру in vitro: ранньовесняний строк (2 декада лютого - 2 декада квітня) і весняний (2-3 декада травня). При культивуванні апікальних меристем, виділених із бруньок вічка, виявлено, що на частоту регенерації значно впливають строк введення в асептичну культуру і генотип експланту.

Для успішної регенерації рослин важливе значення має правильний вибір живильного середовища. На етапі введення в культуру in vitro апікальних меристем винограду вибір оптимальних концентрацій гормонів проводили на основі живильного середовища МС, що містить 0,7 % агару. Так, для сорту Молдова оптимальною гормональною добавкою в середовище для культивування апікальних меристем з пасинкових бруньок є БАП і кінетин (по 1,0 мг/л), що забезпечувало частоту регенерації на рівні 55,0 %, висоту пагонів - 14,1±1,7 мм. При виділенні апікальних меристем пасинкових бруньок сорту Сурученський білий частота регенерації варіювала в межах 22,5-32,5 %. Оптимальними для експлантів цього сорту встановлено два варіанти живильного середовища: БАП (0,5 мг/л) і сполучення БАП і ГК (1,0 і 0,5 мг/л відповідно), що забезпечують найбільший рівень регенерації (32,5 %) і висоту пагонів (12 мм). Для сорту Шевченко оптимальним було додавання до живильного середовища БАП (2,0 мг/л) і ГК (0,5 мг/л), що при культивуванні апікальних меристем пасинкових бруньок забезпечувало частоту регенерації 55,0 %, при культивуванні апікальних меристем основної та запасної бруньок вічка - 45,0 і 37,5 % відповідно. Висота пагонів у цих варіантах становила, відповідно, 16,3; 3,3 і 3,1 мм, а середня кількість пагонів - 1,0; 1,2 і 1,3 шт. Для сорту Фрумоаса албе оптимальним було введення в живильне середовище БАП (1,0 мг/л) і ГК (0,5 мг/л), що сприяло регенерації 65-75 % експлантів, а також забезпечувало висоту основного пагону 18,3 мм при культивуванні апікальних меристем пасинкових бруньок і 4,6-5,1 мм при культивуванні апікальних меристем бруньок вічка. Для культивування апікальних меристем сорту Каберне Совіньон підібрано середовище з додаванням БАП (0,5 мг/л), що сприяло регенерації 35,0-40,0 % експлантів і одержанню пагонів висотою 34,2±2,6 мм при виділенні меристеми з пасинкової бруньки та 3,5-3,8 мм при використанні апікальних меристем із бруньок вічка.

В результаті проведених досліджень з оптимізації складу живильного середовища для культивування апікальних меристем, виділених із бруньок вічка, визначено його склад (мг/л): KNO₃ - 1900; NH₄NO₃ - 1650; MgSO₄·7H₂O - 370; KH₂PO₄ - 170; FeSO₄·7H₂O - 27,8; Na₂ЭДТА - 37,3; MnSO₄·4H₂O - 7,43; ZnSO₄·7H₂O - 8,6; H₃BO₃ - 6,2; CuSO₄·5H₂O - 0,025; Na₂MoO₄·2H₂O - 0,25; мезоінозіт - 75; нікотинова кислота - 5,3; пірідоксин-НCl - 5,8; ПАБК - 5,0; сахароза - 20 г/л, агар - 7 г/л. Отримані експериментальні дані показали, що рівень регенерації і основні біометричні показники у більшості досліджуваних сортів на модифікованому середовищі достовірно вищі.

Після культивування апікальних меристем бруньок вічка на модифікованому живильному середовищі отримані мікропагони пересаджували на живильне середовище МС з підвищеною концентрацією ГК (1,0 мг/л), що сприяло подовженню пагонів на 9,97-18,68 мм.

Власне мікророзмноження. На етапі власне мікророзмноження основне завдання полягає в одержанні максимальної кількості мікроклонів, що вирішується шляхом мікроживцювання основного пагону та стимуляцією розвитку бічних пагонів. На другому етапі розмноження in vitro як експланти використовували мікроживці винограду довжиною 4-6 мм з одним вузлом. При культивуванні на етапі власне мікророзмноження різниця в інтенсивності росту експлантів з різних типів бруньок, відзначена на етапі введення в культуру in vitro, нівелюється. Найбільш інтенсивний розвиток мікропагонів відбувався при додаванні в живильне середовище БАП (0,1-0,5 мг/л) і ГК (1,0 мг/л). Підвищення концентрації БАП до 2,0 мг/л сприяло інтенсивному утворенню адвентивних пагонів в 15,0-32,8 % експлантів, але викликало потовщення стебла і зниження інтенсивності росту основного пагону.

Встановлено, що для культивування експлантів сортів Молдова, Сурученський білий, Шевченко і Каберне Совіньон оптимальним є живильне середовище з введенням БАП 0,1 мг/л + ГК 1,0 мг/л, на якій досягається одержання максимальної кількості вузлів з однієї ініціалі (мікроживця) (рис. 2).

Висота пагонів при цьому варіює залежно від сорту і становить у сорту Молдова 17,1-17,6 мм та 21,2-22,3 мм у пагонів сорту Сурученський білий. Кількість вузлів на цьому варіанті живильного середовища складає, відповідно 4,2 і 4,9 шт. При культивуванні експлантів сорту Каберне Совіньон висота пагонів досягала 22,8 мм, а кількість вузлів на одному пагоні - 4,6 шт.

Таким чином, використовуючи для введення в культуру in vitro пасинкову і основну або запасну бруньку вічка, можна одержати вдвічі більше мікроживців, що підвищить коефіцієнт розмноження та дозволить ефективніше використовувати донорний матеріал, особливо при його дефіциті.

Вивчення особливостей розвитку меристемних рослин винограду протягом семи пасажів показало, що найбільшою регенераційною здатністю досліджувані сорти володіють протягом першого-четвертого пасажів, при подальшому культивуванні висота пагонів і кількість сформованих вузлів, а, отже, і коефіцієнт розмноження, знижуються. При цьому сорти Молдова, Сурученський білий і Каберне Совіньон протягом третього-четвертого пасажів формують інтенсивно зростаючі пагони (до 30,0 мм) з максимальною кількістю вузлів (до 7,2 шт.). Дещо нижчі біометричні показники було виявлено у сорту Шевченко - висота пагонів досягала 20,7 мм, кількість сформованих вузлів -5,2 шт. У пагонів сорту Фрумоаса албе найбільш високі показники спостерігалися в п'ятому пасажі - висота основного пагона становила 23,8±2,1 мм, кількість вузлів - 5,8 шт. При подальшому субкультивуванні інтенсивність регенераційних процесів у всіх досліджуваних сортів значно знижується.

Для одержання максимальної кількості мікроклонів при субкультивуванні поєднали мікроживцювання основних пагонів з культивуванням вихідного вузла. Додаткове перенесення мікроживців на свіже живильне середовище сприяло значному збільшенню коефіцієнта розмноження за рахунок пробудження заміщуючих бруньок у 35-47 % мікроживців. Видалення основного пагона приводило до зняття апікального домінування, що сприяло одночасному пробудженню двох-трьох заміщуючих бруньок. При цьому виявлено деякі відмінності в реакції генотипів на субкультивування. Так, у сорту Шевченко вже у третьому пасажі не відмічалося проліферації бруньок, хоча інші досліджувані сорти формували ще 1-2 невеликих пагони. Можливо, це обумовлено числом заміщуючих бруньок, специфічним для кожного сорту.

Сумарний вихід мікроживців з одного вузла донорного пагону винограду за рахунок проведення п'яти пасажів при мікроживцюванні основного пагону та додаткового субкультивування вихідного живця протягом двох пасажів значно відрізняється за генотипами і становить: у сорту Каберне Совіньон 654,3 тис. шт., Сурученський білий - 188,4 тис. шт., Молдова - 100,8 тис. шт., Фрумоаса албе - 69,5 тис. шт., Шевченко - 39,9 тис. шт.

Укорінення мікропагонів в умовах in vitro. Найбільш ефективним для індукції ризогенезу у мікроживців винограду визначено живильне середовище Ѕ МС, доповнене ІОК у концентрації 0,5-1,0 мг/л, на якій частота ризогенезу становила 80-95 % (рис. 3). Формування в базальній частині мікроживця одного-трьох коренів довжиною 3,8-6,8 мм відзначалося в цих варіантах вже на 15 добу. Виділено оптимальну для укорінення досліджуваних сортів концентрацію ІОК, що склала 0,5 мг/л для мікроживців сортів Фрумоаса албе, Сурученський білий, Каберне Совіньон та 1,0 мг/л - для сортів Молдова і Шевченко. Кількість коренів і їхня довжина різнилися за сортами: у сорту Молдова формувалося 5,25 шт. коренів довжиною 26,82 мм, у сорту Сурученський білий - 5,25 шт. коренів найбільшої довжини - 38,12 мм, у сорту Шевченко регенерувало найбільше коренів - 7,15 шт. довжиною 36,27 мм, у сорту Фрумоаса албе - 5,45 шт. коренів довжиною 32,72 мм, у сорту Каберне Совіньон формувалося 5,60 шт. коренів довжиною 36,16 мм.

Адаптація мікророслин до умов in vivo. Для адаптації відбирали мікророслини винограду з добре розвиненою кореневою системою, висаджували в посудини об'ємом 200 мл зі стерильним субстратом різного складу і розміщували у вегетаційному боксі. Найбільш висока приживлюваність (75,0-87,5 %) мікророслин винограду всіх досліджуваних сортів була відзначена на субстраті торф: пісок: ґрунт у співвідношенні 1:1:1. У наших дослідженнях також для адаптації використовувався абсорбент TERAWET. Встановлено високу ефективність TERAWET у концентрації 5 г/кг, при використанні якого рівень приживлюваності досягав 95-100 % (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив абсорбенту TERAWET на приживлюваність меристемних рослин винограду в умовах in vivo

Аналіз біометричних показників показав, що рослини, висаджені на субстрат з додаванням TERAWET, характеризувалися дещо більшими показниками росту, але різниця між варіантами була несуттєвою.

Таким чином, в результаті проведених досліджень виявлено особливості морфогенезу ізольованих апікальних меристем пасинкових бруньок і бруньок вічка винограду; оптимізовано умови культивування експлантів на етапі введення в культуру in vitro, власне мікророзмноження, укорінення та адаптації до умов in vivo з метою підвищення регенераційної здатності, біометричних показників і коефіцієнту розмноження рослин.

ПРИЙОМИ ОДЕРЖАННЯ ОЗДОРОВЛЕНОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ

Відбір і діагностика донорних рослин. Отримані нами результати ПЛР-аналізу показали, що виділені рослини вільні від збудника бактеріального раку і фітоплазмових інфекцій. Результати ІФА показали, що досліджувані зразки сорту Каберне Совіньон вільні від зараження такими вірусами, як скручування та коротковузілля - показник екстинції рослинних екстрактів із сироватками, специфічними до GFlV, GLRaV1, GLRaV3 перебував на рівні негативного контролю (Е₄₀₅ = 0,000-0,033 опт. од.), але містять антигени GFkV (Grapevine fleck virus - вірус мармуровості винограду). У зв'язку з латентним характером інфекції єдиним способом виявлення ураження рослин вірусом мармуровості винограду є лабораторний аналіз. пасинковий брунька виноград мікророзмноження

Оздоровлення в культурі in vitro. Проводилося порівняльне дослідження ефективності прийомів оздоровлення: культури апікальних меристем і поєднання його з термотерапією in vitro на модельній системі Каберне Совіньон-GFkV.

Значна роль у процесі оздоровлення рослин методом культури меристем надається розміру експланту, від якого залежить звільнення рослин від вірусу, здатність до регенерації та генетична стабільність потомства. Нами досліджувалися регенераційні процеси апікальних меристем вічка винограду розміром 0,2-0,3 мм із одним-двома листовими примордіями; 0,5-0,7 мм із двома-трьома парами примордіальних листочків і 0,8-1,0 мм з одним-двома криючими листочками. Встановлено, що розмір експланту виявляв значний вплив на реалізацію морфогенетичних потенцій. При оздоровленні рослин винограду від вірусу мармуровості винограду методом культури апікальних меристем доцільно використовувати меристеми розміром 0,5-0,7 мм, які характеризуються досить високою регенераційною здатністю (42,5-75,0 %), що істотно не відрізняється від експлантів більшого розміру.

При проведенні термотерапії in vitro необхідно було визначити температурний режим, що забезпечує елімінацію вірусів при збереженні високого рівня життєздатності, росту і розвитку мікропагонів винограду. При розробленні прийому термотерапії in vitro виявлено, що оптимальною експозицією за температури 38±1 °С є 18-20 діб (рис. 4), протягом яких зберігається високий рівень життєздатності (86-100 %). Протягом цього періоду в мікропагонів відбувалося формування 1,5-2,1 вузлів, але надалі інтенсивність росту пагонів знижувалася.

Відразу після зняття температурного стресу ізолювали верхівки пагонів висотою 3-4 мм і мікроживці пагона з одною пазушною брунькою, які в подальшому культивували на живильному середовищі доповненому БАП (0,1 мг/л) і ГК (1,0 мг/л). Приживлюваність була високою в обох варіантах і становила 98-100 %, однак інтенсивність росту рослин, що піддавалися обробці підвищеними температурами, була нижче (на 8-10 мм), ніж у контролі. Отримані пагони укорінювали, а потім переводили у звичайні умови культивування.

Діагностування рослин-регенерантів на наявність вірусної інфекції. Детекцію антигенів GFkV після терапії проводили методом ІФА. У результаті дослідження встановлено, що обидва біотехнологічних прийоми (метод культури апікальних меристем і термотерапія in vitro) дали позитивні результати (табл. 3).

Таблиця 3

Ефективність біотехнологічних прийомів оздоровлення винограду сорту Каберне Совіньон

Як показують дані табл. 3, використання апікальних меристем розміром 0,2-0,7 мм забезпечує оздоровлення меристемних рослин винограду від вірусу GFkV. Показник екстинції після застосування методу апікальних меристем становив в експерименті до 0,004 опт. од. при значенні в донорних рослинах 0,250 опт. од. Поєднання методу культури апікальних меристем з термотерапією in vitro також сприяє зниженню показника екстинції до 0,003 опт. од. У той же час, проведення термотерапії вимагає додаткових витрат енергоносіїв, зростає тривалість процесу одержання оздоровлених рослин.

З огляду на те, що термотерапія меристемних рослин in vitro і культура апікальних меристем забезпечують однаково високу ефективність звільнення рослин від вірусу мармуровості винограду, доцільніше використовувати метод культури меристем.

ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ ВИРОБНИЦТВА ОЗДОРОВЛЕНОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ

Розрахунок економічної ефективності вирощування оздоровленого садивного матеріалу винограду показує, що за рахунок оптимізації окремих прийомів на етапах розмноження в культурі in vitro і при адаптації до умов in vivo собівартість одного мікроклону та одного саджанця може бути знижена у порівнянні з базовим варіантом (Скороход В. О., 2000) на 20 і 25 % відповідно (табл. 4).

Таблиця 4

Економічна ефективність вирощування оздоровленого садивного матеріалу винограду

Підвищення коефіцієнту розмноження можливе за рахунок поєднання мікроживцювання основного пагону з культивуванням вихідного мікроживця, що дозволить знизити собівартість одного мікроклону на цьому етапі до 1,61 грн (у базовому варіанті - 1,64 грн). При цьому прибуток від реалізації одного стандартного саджанця винограду в оптимізованому варіанті складає 8,52 грн, тобто в 1,8 рази вище, ніж у базовому.

Істотну роль у підвищенні економічної ефективності грає збільшення приживлюваності рослин винограду. Встановлено, що застосування на етапі адаптації розробленого нами двошарового субстрату з додаванням TERAWET (5 г/кг), забезпечує приживлюваність рослин до 100 % зі зниженням витрат на одну рослину на 0,15 грн.

Таким чином, використання удосконалених методів культури апікальних меристем винограду й культивування мікроживців на етапах мікророзмноження in vitro, а також оптимізація умов адаптації рослин in vivo дозволяють знизити собівартість одного мікроклону на 20%, що є економічно вигідним, про що свідчить підвищений рівень рентабельності - 118 %, тоді як у базовому варіанті - 55 %.

АНАЛІЗ І ОБГОВОРЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

На основі систематизації літературних даних і аналізу результатів експериментальних досліджень розроблено умови одержання ініціальних пагонів винограду та удосконалено технологію клонального мікророзмноження перспективних сортів винограду in vitro (Молдова, Сурученський білий, Шевченко, Фрумоаса албе, Каберне Совіньон), що дозволить значно збільшити вихід високоякісного оздоровленого садивного матеріалу й скоротити площі донорних рослин. На основі отриманих теоретичних та практичних результатів запропоновано удосконалену біотехнологічну схему клонального мікророзмноження рослин винограду, що включає особливості культивування на кожному етапі клонального мікророзмноження (рис. 5).

ВИСНОВКИ

Методи клонального мікророзмноження винограду розроблено досить детально, але деякі елементи технології щодо конкретних сортів вимагають удосконалення та оптимізації. В дисертаційній роботі обґрунтовано вирішення наукової проблеми стосовно нових методів і прийомів клонального мікророзмноження та оздоровлення перспективних сортів винограду для закладання безвірусних маточних насаджень в Криму.

1. Для збільшення кількості і підвищення інтенсивності розвитку ініціальних пагонів при пророщенні здерев'янілих живців в лабораторних умовах оптимальним є використання трьох- і чотирьохвічкових живців.

2. Тип ініціальної бруньки не впливає на рівень регенерації апікальних меристем, але істотно впливає на інтенсивність росту пагонів: при культивуванні апікальних меристем з пасинкових бруньок протягом 60 діб висота пагонів становить 7,8-33,7 мм, із бруньок вічка - 1,4-2,5 мм.

3. Для підвищення регенераційної здатності, показників росту і розвитку апікальних меристем вічка доцільно використовувати модифіковане живильне середовище МС_а, що містить (мг/л): KNO₃ - 1900; NH₄NO₃ - 1650; MgSO₄·7H₂O - 370; KH₂PO₄ - 170; FeSO₄·7H₂O - 27,8; Na₂ЭДТА - 37,3; MnSO₄·4H₂O - 7,43; ZnSO₄·7H₂O - 8,6; H₃BO₃ - 6,2; CuSO₄·5H₂O - 0,025; Na₂MoO₄·2H₂O - 0,25; мезоінозіт - 75; нікотинова кислота - 5,3; пірідоксин-НCl - 5,8; ПАБК - 5,0; сахарозу - 20 г/л, агар - 7 г/л.

4. На етапі власне мікророзмноження оптимальним середовищем для сортів Молдова, Сурученський білий, Шевченко і Каберне Совіньон є живильне середовище МС, доповнене БАП (0,1 мг/л) і ГК (1,0 мг/л), для сорту Фрумоаса албе оптимальним співвідношенням фітогормонів у середовищі є БАП (0,5 мг/л) і ГК (1,0 мг/л). При цьому розходження в регенераційній здатності і біометричних показниках між мікропагонами, отриманими з апікальних меристем різних типів бруньок, нівелюються. Частота регенерації мікропагонів, отриманих з апікальної меристеми пасинкової бруньки, варіює залежно від генотипу в межах 83,3-91,7 %; при культивуванні мікропагонів, отриманих із бруньок вічка - 85,5-92,7 %. При цьому висота основного пагону становить 15,3-20,7 мм і 15,6-20,4 мм відповідно.

5. З метою підвищення коефіцієнту розмноження доцільним є поєднання мікроживцювання основних пагонів з культивуванням вихідного мікроживця. Додаткове культивування мікроживців сприяє пробудженню заміщуючих бруньок, і дає можливість протягом двох пасажів одержати додатково 3,0-4,9 мікропагонів, або 8,5-14,4 сформованих вузлів.

6. На етапі укорінення оптимальною концентрацією ІОК для всіх досліджуваних сортів є 0,5-1,0 мг/л, при якій частота ризогенезу становить 80,0-95,0 %, формується 4,80-7,15 шт. коренів довжиною 18,19-38,43 мм.

7. На етапі адаптації рослин винограду до умов in vivo оптимальним субстратом є суміш торфу, піску і ґрунту у співвідношенні 1:1:1. При цьому використання двошарового субстрату зазначеного складу з додаванням у нижній шар абсорбенту TERAWET (5 г/кг) сприяє підвищенню приживлюваності мікророслин до 100 %.

8. Метод культури апікальних меристем є ефективним для звільнення рослин винограду від вірусу GFkV. При цьому оптимальний розмір меристем становить 0,5-0,7 мм, що забезпечує високий рівень регенерації (42,5-75,0 %) і знижує показник екстинції до 0,001-0,004 опт. од. при значенні цього показника у донорних рослин 0,224-0,250 опт. од.

9. Розрахунок економічної ефективності одержання оздоровлених саджанців винограду показав, що прибуток від реалізації одного оздоровленого саджанця становить 8,52 грн в оптимізованому варіанті і 4,59 грн у базовому. При цьому рівень рентабельності, отриманий в оптимізованому варіанті, становить 118,1 %, що на 63,7 % вище, ніж у базовому.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для одержання ініціальних пагонів винограду в лабораторних умовах пророщувати здерев'янілі трьох- і чотирьохвічкові живці винограду у воді без додавання ауксинів.

2. Для підвищення коефіцієнта розмноження винограду при культивуванні в умовах in vitro використовувати розроблену нами біотехнологічну схему клонального мікророзмноження винограду на основі методу культури апікальних меристем.

3. Для підвищення приживлюваності на етапі адаптації мікророслин до умов in vivo використовувати субстрат, що включає абсорбент TERAWET (5 г/кг).

4. Для звільнення садивного матеріалу винограду від вірусу мармуровості винограду використовувати метод культури апікальних меристем розміром 0,5-0,7 мм.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бугаенко Л. А. Перспективы использования метода клонального микроразмножения in vitro у винограда / Л. А. Бугаенко, Л. В. Иванова-Ханина // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - 2004. - Вып. 83. - С. 153-157. Здобувачем проведено інформаційний пошук і аналіз літературних джерел; співавтором надана консультаційна допомога при написанні тексту статті.

2. Иванова-Ханина Л. В. Влияние гормонального состава среды и срока изоляции меристем на рост и развитие винограда в культуре in vitro / Л. В. Иванова-Ханина // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - 2005. - Вып. 89. - С. 253-262.

3. Иванова-Ханина Л. В. Влияние генотипа на морфогенез меристемных растений винограда / Л. В. Иванова-Ханина, Л. А. Бугаенко // Научные труды ученых Крымского государственного агротехнологического университета. - 2005. - Вып. 91. - С. 207-211. Здобувачем самостійно отримано експериментальні дані та проведено їх інтерпретацію, написання тексту статті виконано у співавторстві.

4. Иванова-Ханина Л. В. Влияние гормонального состава питательной среды на интенсивность роста меристемных растений Vitis vinifera L. / Л. В. Иванова-Ханина // Сучасний стан та перспективи розвитку насінництва в Україні : Наукові праці ПФ "КАТУ" НАУ. Сільськогосподарські науки. - 2008. - Вип. 107. - С. 144-147.

5. Иванова-Ханина Л. В. Влияние условий проращивания черенков винограда на формирование инициальных побегов для введения эксплантов в культуру in vitro / Л. В. Иванова-Ханина // Виноградарство і виноробство: міжвідом. темат. науковий збірник. Спец. вип. за матеріалами міжнар. наук.-практ. конф., присвяч. 150-річчю з дня народження В. Є. Таїрова, 29-30 верес. 2009 р. - Одеса: ННЦ ІВіВ ім. В. Є. Таїрова, 2009. - С. 61-64.

6. Иванова-Ханина Л. В. Адаптация микрорастений винограда, полученных методом культуры апикальных меристем, к условиям in vivo / Л. В. Иванова-Ханина // Научные труды ЮФ НУБ и П Украины "КАТУ". - 2009. - Вып. 125. - С. 181-185.

7. Бугаенко Л.А. Использование биотехнологических методов для получения оздоровленного посадочного материала винограда / Л. А. Бугаенко, Н. А. Мулюкина, Л. В. Иванова-Ханина // Насінництво: теорія і практика прогнозування продуктивності сортів і гібридів за якістю насіння та садивного матеріалу: Наукові праці ПФ НУБ і П України "КАТУ". Сільськогосподарські науки. - 2009. - Вип. 127. - С. 174-176. Здобувачем самостійно отримано експериментальні дані з оздоровлення рослин. Вірусологічні дослідження і інтерпретацію отриманих даних проведено сумісно з доктором с.-г. наук Н.А. Мулюкіною. Співавторами надана консультаційна допомога при підготуванні тексту статті.

8. Іванова-Ханіна Л. В. Інтенсивність росту апікальних меристем винограду в залежності від гормонального складу середовища / Л. В. Іванова-Ханіна, Л. О. Бугаєнко // Молодь і поступ біології : Перша міжнар. конф. студентів та аспірантів, 11-14 квіт. 2005 р. : тези доп. - Львів: СПОЛОМ, 2005. - С. 129-130. Здобувачем самостійно отримано експериментальні дані та проведено їх інтерпретацію, написання тексту тез виконано у співавторстві.

9. Иванова-Ханина Л. В. Влияние гормонального состава питательной среды на интенсивность роста меристемных растений винограда / Сучасна аграрна наука: напрями досліджень, стан і перспективи : зб. матеріалів п'ятої міжвузівської наук.-практ. конф. аспірантів 17-19 трав. 2005 р. - Вінниця: ВДАУ, 2005. - С. 41-43.

АНОТАЦІЇ

Іванова-Ханіна Л.В. Клональне мікророзмноження і отримання оздоровленого садивного матеріалу винограду в культурі in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 06.01.14 - насінництво. - Південний філіал Національного університету біоресурсів і природокористування України "Кримський агротехнологічний університет", Сімферополь, 2010.

Дисертаційна робота присвячена удосконаленню технології клонального мікророзмноження і оздоровлення садивного матеріалу винограду перспективних для Криму сортів Молдова, Сурученський білий, Фрумоаса албе, Шевченко, Каберне Совіньон. Визначено морфогенетичні потенції ізольованих апікальних меристем пасинкових бруньок і бруньок вічка винограду в культурі in vitro. Встановлено вплив строку введення в культуру in vitro, генотипу, типу ініціальної бруньки, складу і консистенції живильного середовища на регенераційні процеси апікальних меристем винограду. Оптимізовані умови культивування на етапах власне мікророзмноження, укорінення мікропагонів in vitro і адаптації мікророслин до умов in vivo. Проведено порівняльне вивчення ефективності методу культури апікальних меристем і поєднання його з термотерапією in vitro для оздоровлення винограду від вірусу мармуровості винограду (GFkV).

Ключові слова: виноград, ініціальні пагони, клональне мікророзмноження, експланти, культура апікальних меристем, живильне середовище, мікроживці, віруси, термотерапія in vitro.

Иванова-Ханина Л.В. Клональное микроразмножение и получение оздоровленного посадочного материала винограда в культуре in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.01.14 - семеноводство. - Южный филиал Национального университета биоресурсов и природопользования Украины "Крымский агротехнологический университет", Симферополь, 2010.

Диссертационная работа посвящена усовершенствованию технологии клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда перспективных для Крыма сортов Молдова, Сурученский белый, Фрумоаса албэ, Шевченко, Каберне Совиньон. Исследованы морфогенетические потенции изолированных апикальных меристем пасынковых почек и почек глазка винограда в культуре in vitro. Установлено влияние срока введения в культуру in vitro, генотипа, типа инициальной почки, состава и консистенции питательной среды на регенерационные процессы апикальных меристем винограда. Определены особенности развития меристемных культур в течение семи пассажей. Показано, что коэффициент размножения у исследуемых сортов сохранялся на стабильном уровне до пятого пассажа. Установлена возможность увеличения коэффициента размножения за счет сочетания микрочеренкования основного побега с дополнительным культивированием исходного черенка. Указанный прием позволяет в течение двух пассажей получить дополнительно 8,5-14,4 шт. сформированных узлов. Суммарный выход микрочеренков из одного узла донорного побега винограда за счет проведения пяти пассажей при микрочеренковании основного побега и дополнительного субкультивирования исходного черенка в течение второго-четвертого пассажей составляет: у сорта Каберне Совиньон 654,3 тыс. шт., Сурученский белый - 188,4 тыс. шт., Молдова - 100,8 тыс. шт., Фрумоаса албэ - 69,5 тыс. шт., Шевченко - 39,9 тыс. шт. Оптимизированы условия культивирования на этапах укоренения микропобегов in vitro и адаптации микрорастений к условиям in vivo. Разработан двухслойный субстрат, включающий торф, песок и почву в соотношении 1:1:1 с добавлением абсорбента TERAWET, который обеспечивает приживаемость растений на этапе адаптации 95-100 %.