Сибирская язва

Размещено на http://allbest.ru

Острое инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных многих видов, а также человека; характеризуется признаками септицемии или образованием карбункулов, у свиней часто протекает с поражением заглоточных лимфатических узлов.

Возбудитель сибирской язвы -- бактерия Bacillus anthracis, род Bacillus.

Лабораторная диагностика сибирской язвы основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (методом световой и люминесцентной микроскопии, а также биопробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим признакам. При нечетких результатах применяют и другие методы.

Материал для исследования. В лабораторию направляют ухо от трупа животного, перевязанное у основания (ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп), или кровь из надреза уха в виде толстого мазка на двух предметных стеклах (чтобы исключить попадание возбудителя во внешнюю среду, место разреза прижигают шпателем); от трупов свиней - заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани. Если подозрение на сибирскую язву возникло в ходе вскрытия, его прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Нативный материал помещают в чистую посуду (пробирки, банки). Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые оборачивают плотной бумагой. На упаковке делают надпись «Мазок не фиксирован!» Посуду с материалом помещают во влагонепроницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «Верх. Осторожно!» и с сопроводительными документами нарочным направляют в лабораторию.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель представляет собой грамположительные прямые палочковидные бактерии размером (l...l,5) х (6...10) мкм, без жгутиков, образует спору и капсулу.

Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, окрашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т. д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках обнаруживают крупные грамположительных палочковидных бактерий, располагающихся одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы закруглены, клетки окружены капсулой. В отдельных случаях, особенно в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зернистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.

Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил материал, дают немедленно по результатам микроскопического исследования.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факультативный анаэроб, температурный оптимум 35...37 °С, рН 7,2...7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и инкубируют в аэробных условиях 18...24 ч, а при отсутствии роста -- до 48 ч.

На МПА М. anthracis формирует плоские, матово-серые, шероховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные колонии без отростков. Края колоний R-формы под малым увеличением микроскопа имеют вид локонов, получивших название «львиная грива» (рис. 83). В МПБ рост возбудителя характеризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок разбивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыворотку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, а в МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.

В выросших культурах исследуют морфлогические и тинкто-риальные свойства клеток. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают длинные цепочки из грамположительных типичных палочек; в мазках из культур на средах с диффузным ростом находят отдельные или парные палочки (рис. 84...86). На бессывороточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае чаще располагаются одиночно или парами.

При значительной контаминации материала посторонней микрофлорой (сырье животного происхождения, объекты внешней среды) посев делают на селективный агар следующего состава: расплавленный МПА -- 100 мл, сульфат полимиксина М --0,5 мл, невиграмон --0,5 мл, гризеофульвин -- 1 мл, моющее средство «Прогресс» --10 мл, фенолфталеинфосфат натрия -- 0,1 мл; перемешивают, разливают по чашкам Петри. Через 18...24ч культивирования на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 1...2мл 25%-го водного раствора аммиака, чашку переворачивают. Колонии В. anthracis остаются бесцветными, колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют.

Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным материалом -- обязательный этап, проводимый сразу после поступления материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2...0,5 мл или морских свинок по 0,5...2 мл. Наблюдение ведут в течение 10 сут. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1...3 cyт. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя.

Если в ходе указанных исследований выделена бактерия, типичная для В. anthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных животных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз считают установленным.

В случае получения нечетких результатов при вышеизложенных исследованиях проводят дополнительные с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от В. cereus. При этом определяют способность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных животных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвенному бактериофагу, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков (табл.).

сибирский язва сельскохозяйственный вакцинация

Тест «жемчужного ожерелья» разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. В две колбочки (пробирки) с расплавленным МП А (температура 45...50°С) добавляют пенициллин из расчета 0,05...0,5 ЕД/мл и переносят в две чашки Петри, в третью чашку наливают обычный МПА. После застывания агара из него вырезают пластинки размером 1,5 см², которые переносят на предметные стекла и помещают в чашки Петри. На каждую пластинку бактериологической петлей наносят исследуемую 3-часовую бульонную культуру. Чашки выдерживают 1...3 ч в термостате. Затем посевы просматривают под микроскопом с объективом х 40 и иммерсионной системой. Перед просмотром зону роста накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную форму, а цепочки -- вид «жемчужного ожерелья». Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогичных условиях растут в обычной форме. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки из типичных палочек.

Для определения чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, затем на поверхность среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре и посевы выдерживают при температуре 37...38°С 24 ч. В случае принадлежности культуры к В. anthracis на поверхности МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды.

Для идентификации В. anthracis методом люминесцирующих антител используют флуоресцирующую адсорбированную сыворотку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами.

Гемолитическую активность исследуемой культуры определяют посевом на 5%-й МПА или в МПБ.

Наличие жгутиков исследуют посевом в 0,3%-й МПА или методом «раздавленной капли».

Если для исследования поступил загнивший материал, который нельзя подвергать бактериологическому исследованию, то диагноз ставят на оснований обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преципитации.

Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотношение 1:10) путем кипячения в течение 30...40 мин (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизиро-ванного физиологического раствора (соотношение 1 : 10) можно проводить в течение 16... 18 ч при комнатной температуре (холодный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют в РП.

Реакцию ставят методом «наслаивания» или «подслаивания». При «наслаивании» в преципитационную пробирку вносят 0,2...0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы компоненты не перемешивались. При «подслаивании» в пробирку вначале вносят 0,2...0,3 мл экстракта, затем под него пастеровской пипеткой -- равное количество сибиреязвенной преципитирующей сыворотки. Одновременно ставят контроли (см. далее). Реакцию считают положительной, если через 1...2 мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации.

В ветеринарных лабораториях часто исследуют на сибирскую язву в РП кожевенно-меховое сырье. В лабораторию доставляют пробы кожевенного сырья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез которых не снижает товарной ценности. Эти пробы нанизывают на тонкую проволоку в том порядке, в котором шкуры расположены на складе. Поступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм 30 мин. Затем пробы измельчают и берут навески: 1 г -- от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сырья и 2 г -- от мокросоленого. Пробы заливают экстрагирующей жидкостью (физиологический раствор, содержащий 0,3 % кристаллического фенола).

Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом при комнатной температуре в течение 16...20 ч; пробы от свиных шкур кипятят 30 мин. Экстракты фильтруют через асбестовую вату до прозрачности (предварительно взболтав содержимое баночек с пробами). Компоненты соединяют методом «наслаивания» или «подслаивания».

Контроли РП. 1. Контроль преципитирующей сыворотки: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат положительный в течение 1...2 мин); б) с экстрактом из заведомо благополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 ч); в) с экстрагирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1ч). 2. Контроль асбестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты).

Учет результатов РП проводят через 10... 15 мин для пресно-сухого (одиночные пробы), через 30 мин -- для пресно-сухого (сдвоенные пробы) и сухосоленого (одиночные пробы), через 60 мин -- для сухосоленого (сдвоенные пробы) и мокросоленого сырья.

При исследовании на сибирскую язву свежего тканевого материала, а также при идентификации выделенных культур можно использовать реакцию диск-преципитации, которая основана на взаимодействии продуктов метаболизма возбудителя (антиген), растущего в жидкой питательной среде, с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

В стерильную бактериологическую пробирку вносят 0,5...1 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, на ее поверхность осторожно (по стенке пробирки) наслаивают расплавленный (45...50°С) 1%-й агаровый гель столбиком высотой 5...7 мм. Далее на поверхность застывшего агара наливают 1... 1,5 мл жидкой питательной среды (МПБ, среда ГКИ и т. д.) и в нее делают посев исследуемого тканевого материала или идентифицируемой культуры микроорганизма.

Посевы выдерживают при 37...38 °С 16...20 ч. Результаты учитывают, просматривая пробирку в проходящем свете на черном фоне. В положительном случае в средней части столбика агарового геля обнаруживают тонкую белую четкую линию (диск) преципитации. Сапрофитные бациллы при росте в этой системе преципитации не дают. Некоторые штаммы В. cereus могут вызывать в нижней части агарового столбика образование рыхлой толстой зоны преципитации, которая за 30...40 ч разрыхляется и сливается с преципитирующей сывороткой.

Биопрепараты. Вакцина СТИ -- живая вакцина из эталонного штамма, полученного Н. Н. Гинсбургом (1944), представляет собой споровую (95... 100 %) агаровую культуру в виде суспензии в 30%-м стерильном растворе глицерина; содержит (2,5...3,5)*10⁷ жизнеспособных спор в 1 мл. Вакцину контролируют на чистоту роста, концентрацию спор, безвредность на кроликах, иммуногенность на морских свинках.

Вакцина ГНКИ -- сухая живая вакцина из эталонного штамма ГНКИ. Содержит 5 * 10⁷ спор в 1 мл. Готовят и контролируют так же, как вакцину СТИ. Срок годности сухой вакцины 3 года.

Вакцина против сибирской язвы из штамма № 55.

Ассоциированная живая жидкая вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Лечебно-профилактическую сибиреязвенную сыворотку получают гипериммунизацией лошадей инактивированной сибиреязвенной культурой. Сыворотку проверяют на стерильность, безвредность на белых мышах и морских свинках, активность на кроликах. Также выпускают противосибиреязвенный глобулин.

Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка предназначена для исследования материала на сибирскую язву в реакции преципитации. Сыворотку получают гипериммунизацией лошадей.

Сибиреязвенный стандартный антиген для РП выпускают для контроля активности преципитирующей сыворотки. Представляет собой экстракт из инактивированной бактериальной массы В. anthracis.

Сибиреязвенные люминесцирующие сыворотки готовят из сибиреязвенной преципитирующей сыворотки; предназначены для ускоренного обнаружения некапсулированных клеток возбудителя в первичных посевах.

Сибиреязвенные диагностические бактериофаги представляют собой освобожденную от бактерий путем фильтрования жидкость бульонной культуры возбудителя, зараженную бактериофагом. Титр бактериофага 10.

Размещено на Allbest.ru