Культивирование овариальных ооцитов вне организма

Размещено на http://www.allbest.ru/

Культивирование овариальных ооцитов вне организма

Известно, что после разрыва фолликула в яйцепровод поступает незрелое яйцо, а ооцит II порядка. Заключительная фаза овогенеза имеет место уже в процессе движения ооцита по яйцеводу и в процессе оплодотворения. В значительной мере этот процесс инициирует проникающий в цитоплазму клетки спермий. Заключительная фаза овогенеза состоит в том, что ооцит II порядка претерпевает второе мейотическое деление, с образованием временного яйца и полярного тела. Незрелые ооциты выделяют из яичников коров, преждевременно выбывших из эксплуатации, но очень ценных в племенном отношении. Яичники доставляют в лабораторию в термосе с физраствором (температура 30-35°С) не позже 1,5 ч после убоя коровы или телки. Ооциты извлекают из полостных фолликулов, имеющих диаметр 2-5 мм, путем вымывания средой Дюльбекко с добавлением гепарина и антибиотиков). Вылавливают пастеровской пипеткой под микроскопом МСБ - 9 и проводят морфологическую оценку визуальным путем. Извлеченные из фолликулов ооциты инкубируют в висячей капле, под слоем вазелинового масла при температуре 38,5°С, срок инкубации - 24 ч.

Используют культуральную среду ТС-199 с добавлением 10% -ной фетальной сыворотки теленка и гентамицина. Для ускоренного созревания ооцита в среду добавляют гормоны: фоллитропин + лютропин и эстрадиол.

Культивирование овариальных ооцитов вне организма в перспективе может стать важным дополнительным источников эмбрионов.

Оплодотворение вне организма.

Удивительное явление природы - соединение мужской и женской половых клеток и образование новой клетки - зиготы (в переводе с греческого - «упряжка из двух быков»), способной расти и развиваться происходит в организме матери. Английским ученым Патрику Стептоу и Роберту Эвардсу после тринадцати лет работы удалось из яйца и спермы произвести плод в колбе и пересадить его в готовом виде в матку. В 1978 г. родилась Луиза Браун - первый на земле ребенок, зачатый вне организма («ребенок из пробирки»).

С 1987 г. коммерческая компания «Биотехнология животных» (Великобритания) практикует пересадку эмбрионов от мясных телок коровам - рецепиентам в молочных стадах. Источником эмбрионов служат яйцеклетки, извлеченные на бойне и оплодотворенные в лаборатории.

Для оплодотворения вне организма яйцеклетки необходимо провести капацитацию (созревание) спермиев. Капацитацию спермиев проводят методом «swin up». С использованием среды p-TALP. Оплодотворение ооцита капацитированными спермиями происходит в среде Fert-TALP при экспозиции 16-18 ч. Зиготу отмывают от прилипших спермиев и переносят для дальнейшего культивирования в среду СДМ с культурой эпителиальных клеток яйцепровода. Срок культивирования - 144-168 ч.

Эмбрионы оценивают по морфологическим признакам, заправляют в пайеты и пересаживают коровам или телкам-реципиентам. Приживляемость составляет 20-26%. (Полянцев Н.И., Подберезный В.В., 2001).

Трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.

Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 часов без заметного снижения их последующей приживляемости.

Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 часа, сопровождается нормальной приживляемостью.

Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного. Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития после охлаждения их ниже 10-15°С (С. Полдж, 1982). Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0°С.

Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже -50°С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до -25 и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).

Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 минут нее посредственно перед пересадкой без применения специального оборудования с заданной скоростью повышения температуры.

Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного с описанием технологии.

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных.

Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой работы.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию сперматозоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яичниках млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник огромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенерируют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотворение вне организма животного. В настоящее время не разработаны методы использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значительное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота включает в себя несколько этапов (рис. 1).

Исходным материалом служат яичники коров после их убоя, которые транспортируются в лабораторию в течение 1-9 часов в физиологическом растворе с антибиотиками. В стерильных условиях яичники подвергаются диссекции с целью вскрытия антральных фолликулов и выделения ооцит кумулюсных комплексов. Полученные таким образом женские половые клетки, многократно промываются и помещаются в 4-х луночные чашки Петри со средой созревания, покрытой равным слоем легкого минерального масла (рис.2). Через 24 часа культивирования ооциты перенесятся в среду оплодотворения.

Рис. 1

Рис. 2 Ооциты-кумулюсные комплексы коров перед постановкой на созревание (ЮОхув).

Оплодотворение проводится заморожено-оттаянным семенем. С целью подготовки спермы к оплодотворению одна-две соломинки с замороженной спермой быка размораживается в водяной бане при 37° С в течение 12 секунд. После чего содержимое соломинок переносится в пробирки со средой для капацитации и помещается в инкубатор на 50 минут. По истечению данного периода из пробирок отбирается верхних 750 мкл супернатанта с последующим его разбавлением свежей средой и центрифугированием при 500 г в течение 7 минут. Полученный после центрифугирования осадок добавляется к ооцитам, так чтобы конечная концентрация была 1,5*106 сперматозоидов на мл (рис. 3)

Рис. 3. Ооцит-кумулюсные комплексы коров во время оплодотворения шт мшекщ (200 хув.).

Через 18-20 часов соинкубации осторожным пипетированием ооциты отмываются от сперматозоидом и клеток кумулюса в среде Talp-HEPES и переносятся в модификационную среду CR1. В данной среде предполагаемые зиготы культивируются до стадии бластоцисты в течение 7-8 дней.

Получение и выделение ооцитов проводится в среде ТСМ 199 содержащей 25 мМ HEPES, 0,1% PVA. Для созревания ооцитов используется мод. среда ТСМ 199 (Gibco), с добавлением, 10% FCS и гонадоторопных гормонов (FSH,LH) Капацитация спермы происходит в среде Talp (модифицированный раствор) Tyrode^,s, содержащего 6 мг/мл BSA, 10 мМ натрий лактата и 1,25 мМ Na-пирувата). Среда оплодотворения также является модифицированным раствором Tyrode\ с добавлением 10 мкг/ мл гепарина, 20¦JM пенициллинамина, 10¦JM гипотаурина и 1¦JM эпинефрина.

Созревание, оплодотворение и культивирование происходит в условиях инкубатора при 39°С и 5% СО₂ в воздухе (рис. 4)

Рис. 4. Созревание и оплодотворение ооцитов коров и культивирования гибридных клеток в инкубаторе при 5% СО₂ в воздухе.

яйцеклетка эмбрион сперматозоид капацитация

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора, или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1-2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5-6 ооцитов на животное. Менее 50% ооцитов пригодны для созревания in vitro. Положительное значение: несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом их извлечении сохраняется возможность многократного использования животного.

Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проникновения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после паривания, Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермине должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использована среда с высокой ионной силой. Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985).

Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в течение 30-40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов кальция.

После инкубации в течение одного часа верхний слой среды объемом 0,5-0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и промывают дважды центрифугированием при 500 г в течение 7-10 мин. После 15 мин. инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществляется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению условий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструментом для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет.

Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тиройда. После созревания in vitro ооциты частично очищают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2-5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 1-1,5 млн/мл. Через 44-48 ч. после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

Оценку эффективности технологии и качества полученных эмбрионов проводили по следующим показателям:

1) Проценту ооцитов коров пенетрированных сперматозоидами.

Данный показатель определяется методом визуальной оценки зоны пеллюцида, перевителированного пространства и цитоплазматической мембраны ооцита на присутствие в них целых или только головок сперматозоидов. В данном случае анализ проводится на нативных ооцитах на инвертированном микроскопе при увеличении 400-600 раз (рис.5).

Рис. 5. Ооциты с различными формами проникновениям сперматозоидов через 24 часа с момента начала процедуры оплодотворения (400хув.).

2) Проценту оплодотворения.

Норму оплодотворения определяли в нативных ооцитах по образованию второго направления тельца (рис. 5) и в суховоздушных препаратах по анализу оборудования пронуклеусов. (рис. 6).

Норму оплодотворения определяли в нативных ооцитах по образованию второго направительного тельца (рис. 5) и в суховоздушных препаратах по анализу образования пронуклеусов (рис. 6).

Рис. 5 Ооциты с НТ (400хув.)

Рис. 6 Пронуклеусы (600хув.)

3) Проценту дробления.

Процент дробления определяли по количеству эмбрионов на стадии двух бластомеров (Рис. 7а)

1. Динамике развития (Рис. 7b-d)

а) 2-х клеточный эмбрион b) 4-х клеточный эмбрион

с) 8-ми клеточный эмбрион d) ранняя морула

Рис. 7 Развитие эмбрионов крупного рогатого скота (4 ООХ увеличение).

2. Проценту образования бластоцист (Рис. 8).

Рис. 8. Бластоцисты крупного рогатого скота, полученные in vitro.

3. Проценту вылупления бластоцист, который является одним из важных показателей полноценности полученных эмбрионов (Рис. 9 a, b).

а) вылупляющаяся бластоциста b) вылупившаяся бластоциста

Рис. 9 Процесс вылупления бластоцист крупного рогатого скота, полученные in vitro (200 х. ув.).

4. Проценту приживляемости эмбрионов и рождению живого потомства.

Приживляемость эмбрионов определяли по фактической стельности, через 2 месяца после осеменения животных методом ректальной ультразвуковой диагностики.

Показатели эффективности технологии.

Анализ эффективности показал, что при оплодотворении ооцитов коров in vitro норма пенетрации их сперматозоидами и норма оплодотворения составляет в среднем 95% и 78% соответственно. 64,87% поставленных на созревание ооцит-кумулюсных комплексов после оплодотворения проходят первое деление дробления, из которых в среднем 38% (до 52%) достигает стадии бластоцисты. Анализ полноценности полученных бластоцист методом дополнительного культивирования в течение 9-10 дней показал, что полученные бластоцисты вылупляются в среднем в 67% случаев.

11 из полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота были пересажены животным - реципиентам (3 в 2009 году и 8 в 2010). По результатам ректальной ультразвуковой диагностики приживляемость эмбрионов составила 63,64%. Из трех животных с пересадкой в 2009 году одна корова отелила телочку (рис. 10). Процент рождения живого потомства составил 33,3%. В России это первый теленок полученный методом экстракорпорального оплодотворения in vitro ооцитов выделенных яичников коров (Рис. 11).

Рис. 10 Телята, рожденные после пересадки полученного in vitro эмбриона корове-реципиенту (ВИТРА) и методом искусственного осеменения (ВИВА).

a) диссекция b) отбор и селекция ооцитов

Рис. 11 Процедура диссекции яичников и отбора ооцитов.

Репродуктивная технология in vitro в промышленном животноводстве: опыт Белоруссии.

В мире первый теленок путем трансплантации был получен еще в 1951 году. К началу 70х годов прошлого века основные методики трансплантации эмбрионов уже были разработаны, началось их внедрение в производство. В Белоруссии, в БелНИИЖ в 1985 году только приступили к исследованиям, но уже в 1986 году родились первые телята - два бычка, Почин и Повтор.

А первый в Белоруссии теленок in vitro появился в марте 1999 года. В июне 2008г. в учебно-опытном хозяйстве Гродненского аграрного университета СПК «Путришки» был получен первый теленок in vitro в Гродненской области.

На сегодняшний день методика уже отработана. Но проблема в том, что в основном работы проводятся с материалом, полученным на мясокомбинате после убоя, а это, как правило, животные с низким или средним уровнем продуктивности. Такая работа эффективна с точки зрения совершенствования метода и рецептуры питательных сред, но совершенно неприемлема для массового производства эмбрионов с целью разведения и селекции. Нужны коровы с продуктивностью по крайней мере не ниже 10 тыс. кг молока, а поскольку их немного, на мясокомбинат они сдаются крайне редко. Поэтому гораздо эффективнее использовать метод извлечения яйцеклеток у живых коров. Процедура позволяет получать клетки до двух раз в неделю и, по многочисленным наблюдениям, не наносит ущерба здоровью животных.

Всего несколько хозяйств в республике - племзаводы «Россь», «Кореличи» и СПК «Олекшицы» в Гродненской области, ОАО «Почапово» и племхозяйство «Литвиново» в Брестской области, племзавод «Красная Звезда» и СПК «Снов» в Минской области - сотрудничают с учеными с целью максимально эффективного использования репродуктивных возможностей коров с высоким генетическим потенциалом. Практически всех быков для племпредприятий получают в результате искусственного осеменения и только незначительную часть - путем трансплантации эмбрионов.

В то же время на Западе до 85-90% таких быков получают только через трансплантацию эмбрионов и по технологии in vitro. Там давно поняли, что работать таким образом не только эффективно, но и выгодно.

В Польше и Литве биотехнологиями воспроизводства КРС серьезно и широко никто не занимается. Наибольшее развитие технологии получили в Германии, Франции, Нидерландах, Англии, Канаде и США. Активная работа в этом направлении ведется в Японии и Бразилии.

Республика Белорусь приобретает племенной молодняк в виде эмбрионов преимущественно в Канаде и США. В этом году для ОАО «Почапово» (это структурное подразделение агрохолдинга «Мачулищи») планируется закупить 150 эмбрионов.

Вообще, в разведении и селекции КРС важно постоянное обновление генетического материала. Поэтому закупаются и быки, и сперма, и нетели зарубежной селекции. Кстати, одна нетель стоит около 3,5 тыс. долларов, при этом их адаптация к новым условиям проходит достаточно тяжело, в связи с чем часть животных выбраковывается. С эмбрионами этого не происходит. И за цену одной нетели можно купить 5-7 эмбрионов. При условии, что приживляемость составит 45-50%, можно получить 2-3 теленка. Кроме того, надо понимать, что животное с высокой генетической ценностью западный фермер никогда не продаст. Он лучше будет использовать его в качестве донора для производства тех же самых эмбрионов. В этой связи биотехнологии также могут стать основой для импортозамещения. Выращивай своих доноров, получай от них эмбрионы, а следовательно, и племенной молодняк как для собственных нужд, так и для продажи.Размещено на Allbest.ru