Методы микроклонального размножения

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба эти способа имеют как свои преимущества, так и недостатки. размножение растение клональный

К недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода.

При вегетативном размножении генотип материнского растения сохраняется, а также сокращается длительность ювенильного периода. Однако большинство видов плохо размножается вегетативным способом, к ним относятся многие древесные породы. Например, эффективность размножения, даже на ювенильной стадии, дуба, сосны, ели, орехоплодных не очень высока. Кроме того, с помощью черенкования невозможно размножать многие виды древесных растений в возрасте старше 10-15 лет. Трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции. Операции по размножению с помощью прививок сложны и трудоемки.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения. Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток.

В России первые работы по клональному микроразмножению были проведены в 60-х годах XX в. в лабораториях Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева. В настоявшее время созданы и развиваются лаборатории клонального микроразмножения, связанные с нуждами селекции, размножением декоративных, лекарственных и других растений. Кроме того, технология используется для размножения лучших экземпляров взрослых лесных деревьев, особенно хвойных, для сохранения редких и исчезающих видов растений.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).

Актуальность темы. В связи с возрастающим интересом и спросом в на новые растения и развитием внутреннего и внешнего озеленения строений, а также необходимостью сокращения импорта посадочного материала низкого качества становится актуальной проблема массового размножения однолетних и многолетних культур. Наличие инфекционного фона у посадочного материала сказывается не только на качестве цветения, внешнем виде и продолжительности жизни растений, но и на заражение окружающей среды опасными патогенами, что оказывает отрицательное влияние на экологию данного участка.

Эта проблема может быть успешно решена методом клонального микроразмножения, который используется не только в коммерческих целях, но и для выявления общих закономерностей морфогенеза растений, их особенностей и проявления в условиях iv vitro.

Преимущество метода клонального микроразмножения.

Метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

· получение генетически однородного посадочного материала;

· освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

· высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);

· сокращение продолжительности селекционного процесса;

· ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

· размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

· возможность проведения работ в течение всего года;

· возможность автоматизации процесса выращивания.

Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения

На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха - ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные.

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2 - 3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения. Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых - только побеги, из средних по возрасту - и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей.

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала.

Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия.

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой - агаризованный, верхний - жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4 : NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14 - 16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В.А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата - образование побегов, у березы - укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды.

Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22 - 26оС днем и 18 - 22оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха - 65 - 70%

Этапы микроклонального размножения растений

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).

4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100--200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.

На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В тех случаях, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта, за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), снять его можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: либо омывкой экспланта слабым его раствором в течение 4--24 ч, либо непосредственным добавлением в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1 мг/л), глютатион (4--5 мг/л), дитиотриэтол (1--3 мг/л), диэтилдитиокарбомат (2--5 мг/л), поливинилпирролидон (5000--10000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент - древесный активированный уголь в концентрации 0,5--1%. Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

2 этап -- собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.

Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов--ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5--10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы -- укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5--1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют в-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.

Укоренение микропобегов проводят двумя способами:

1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2--24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20--50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);

2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3--4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1--5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений -- весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85--90° С в течение 1--2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20--22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65--90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20--30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.

Методы клонального микроразмножения

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

1. Активация пазушных меристем.

2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.

3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.

4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.

5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.

6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:

1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).

2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :

а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;

б) индукция соматического эмбриогенеза;

в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии апикального доминирования.

Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.

Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.

Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro (рис. 19), а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений

В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений. Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала.

Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК. Таким способом были размножены многие представители семейства лилейных, томаты, древесные растения (из зрелых и незрелых зародышей).

Достаточно хорошо разработана технология клонального размножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней растений, и выращивают на питательной среде МС, содержащей БАП в концентрации 0,1 - 0,5 мг/л. Через 3 - 4 недели культивирования меристема развивается в проросток, в основании которого формируются адвентивные почки, быстро растущие и дающие начало новым почкам. В течение 6-8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную среду. На среде без регуляторов роста за 4 - 5 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. От одного материнского растения таким образом можно получить несколько миллионов растений-регенерантов в год.

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток.

Наиболее впечатляющим применением метода соматического эмбриогенеза стало размножение гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineensis), масло которой широко используется при производстве маргарина и пищевого масла. Масличная пальма в природе не образует побегов и боковых ростков, что затрудняет ее вегетативное размножение. Культивирование черенков in vitro также невозможно. Было решено получить скопления клеток недифференцированной ткани (каллусы) путем дедифференцировки специфических тканей, а затем культивировать их до регенерации целых проростков. В первой культуральной среде каллусы из фрагментов листьев развивались в течение 90 дней, при переносе во вторую и третью культуральные среды превращались в "эмбриоиды". Эмбриоиды размножались самопроизвольно, в течение месяца число эмбриоидов возрастало втрое, а за год из 10 эмбрионов можно было получить потомство численностью 500000 растений.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей осуществляется в несколько этапов. Сначала происходит дифференциация клеток под влиянием ауксинов, добавленных в питательную среду (2,4-Д) и превращение их в эмбриональные. Получить эмбриоиды из этих клеток можно уменьшая концентрацию ауксинов или исключая их из питательной среды. Соматические зародыши представляют собой полностью сформированные зародыши, из которых путем соответствующего капсулирования можно получить искусственные семена.

Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.

Практически он мало используется с целью получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при частом пассировании каллусной ткани может изменяться плоидность регенерируемых растений, наблюдаются структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями отмечаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев, образование укороченных междоузлий, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. В то же время, некоторые недостатки этого метода в селекционной работе оборачиваются преимуществами.

Кроме того, в некоторых случаях он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Через каллусную культуру успешно размножаются сахарная свекла, злаковые, представители рода Brassica, подсолнечник и другие культуры.

Оздоровление посадочного материала от вирусов методами химиотерапии и термотерапии.

Одно из преимуществ клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала растений. Это можно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции.

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые было высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с 50-х гг. предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия.

Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время. Строение точки роста растений имеет свою специфику: средний диаметр дистальной ее части, представленной апикальной меристемой, у разных растений составляет до 200 мкм, высота - от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения.

Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, не допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.

В принципе, возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, через их - на нуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности.

Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температуре действует на вирусы через метаболизм растений. Под действием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет и наоборот.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру - 37 °С, освещенность лампами дневного света - 5 тыс. лк, фотопериод - 14-16 ч/сут при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %.

Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10-12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако существуют растения, например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vitro. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.

Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект от воздействия высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличивать коэффициент размножения на 50-60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.

Использование термотерапии в сочетании с меристемной культурой дает возможность оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от вирусного хлороза, 90 % земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % картофеля. Растения на наличие вирусов, как правило, проверяют с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов.

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, - хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название - вирозол) концентрацией 20-50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия.

При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных ме-ристемных растений увеличивался до 80 % по сравнению с 40 % на контроле. Положительные результаты получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.

Клональное микроразмножение декоративных, плодово-ягодных и хвойных растений

Цветочные, плодово-ягодные культуры. Необходимость использования здорового посадочного материала в промышленном садоводстве, цветоводстве и лесном хозяйстве не вызывает сомнений. В настоящее время существует несколько методов получения оздоровленных растений: тестирование большого количества исходного растительного материала; размножение в условиях in vitro с последующим их тестированием; термотерапия или хемиотерапия, тестирование, размножение in vitro и снова тестирование.

Выбор метода зависит от вида вирусной инфекции, а также от генотипических особенностей исследуемых объектов. Трудоемкость проведения таких работ обусловила разработку индивидуальных методов размножения растений в условиях in vitro для каждого конкретного растения, относящегося к разным таксономическим группам. Основным методом, применяемым для сохранения и размножения ценных экземпляров, остается метод, основанный на снятии апикального доминирования. Из плодовых и ягодных культур подобным образом в промышленных масштабах размножают землянику, ежевику, малину, яблоню, сливу, вишню, подвои и скелетообразователи груши, а также некоторые декоративные культуры, такие, как сирень, жимолость, кизильник, роза, хризантема и др. Данный метод считается универсальным и имеет хорошую воспроизводимость результатов в пределах вида и рода растений; минимальную степень риска в отношении получения генетически неоднородного посадочного материала (Н.Е. Павловская и др., 1998).

Второй распространенный метод клонального микроразмножения для практических целей цветочно-декоративных культур и некоторых плодовых -- развитие адвентивных почек/побегов. Как правило, в качестве первичного экспланта используют чешуи или сегменты базальной части донца луковиц, сегменты листовой пластинки и междоузлий побегов. Таким методом размножают, главным образом, луковичные цветочные культуры (гиацинты, лилии, гладиолусы, тюльпаны, нарцисы и др.).

В настоящее время в коммерческих целях метод клонального микроразмножения применяется для растений семейства Орхидных, для которых размножаемые растения являются сложными гибридами. Некоторые из них сочетают геномы трех-четырех разных родов. В обычных условиях осуществить вегетативное размножение этих растений сложно, а в случае завязываемости семян и их прорастания, растение достигает фазы цветения лишь через 3--5 лет.

В последние годы резко возрос спрос на многие цветочные и декоративные культуры. Вместе с тем некоторые ценные виды находятся на грани исчезновения и занесены в Красную книгу. Сокращение и размножение редких, исчезающих и декоративных видов растений возможно при помощи методов клеточной инженерии, и в частности клонального микроразмножения. На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ--МСХА им. К.А. Тимирязева разработаны технологии быстрого размножения цветочных и декоративных растений в условиях in vitro. Создан банк редких, декоративных, цветочных и исчезающих видов растений, разработаны лабораторные технологии размножения декоративно-лиственных и красиво-цветущих бегоний (16 сортов), хризантем (10 сортов), гиацинтов (8 сортов), фиалок (12 сортов), эписций (6 сортов), лилий (20 сортов), гладиолусов, фритил-лярий и других растений.

Как правило, первичным эксплантом служат сегменты чешуи (луковичные культуры), листья (розеточные культуры) и пазушные почки (для растений с вертикальным ростом). Разработанные технологии позволяют в течение 1,5 -- 2 месяцев получать на одном экспланте от 8 шт. (гиацинты) до 70 шт. (бегонии) адвентивных почек, способных впоследствии развиваться в нормальные растения. По предварительным расчетам можно получить в течение 6 месяцев 1250 микролуковиц фритиллярии (рябчик императорский) из 15 сегментов луковицы. В течение года из одной луковицы можно вырастить до 8 тысяч лилий. Эти технологии основываются на микрочеренковании или на индукции образования дополнительных почек или луковиц непосредственно на первичном экспланте.

Коммерческое микроразмножение растений становится быстрорастущим промышленным производством. Однако созданию коммерческих фирм-лабораторий должно предшествовать прогнозирование рентабельности и социальной необходимости производства данного вида продукции. Перед принятием решения по организации коммерческих лабораторий должны быть учтены такие факторы, как стоимость продукции, рыночная цена, емкость рынка, сезонность поставки, выбор сортов.

Промышленные культуры (млн шт.), выращенные in vitro в США, странах Азии и Европы в 2000 году

Практический интерес представляют исследования, объектами которых являются зародыши плодовых растений раннего срока созревания. Объясняется это тем, что селекционно-генетическая работа с такими сортами затрудняется из-за формирования у них неполноценных семян с недоразвитыми зародышами, которые в обычных условиях не образуют всходы. Поэтому среди значительного числа сортов разных плодовых культур очень мало раннеспелых (Н.Е. Павловская, Л.В. Голышкин, Л.В. Голышкина, 1998). Во многих научно-исследовательских институтах по плодовым культурам разрабатываются методические приемы культивирования зародышей in vitro (например, для преодоления покоя семян черешни и персика), в результате чего из изолированных зародышей получают стерильные проростки (груша, миндаль, хурма, персик, черешня и др.), а также их межвидовые гибриды (например, миндаль и хурма), которые в дальнейшем размножают in vitro. Размноженные формы и ультраранние и ранние по срокам созревания сорта урожайные, с плодами хорошего качества, включаются в государственное сортоиспытание и районируются (например, персик сорт Пламенный).

Хвойные породы. Интерес к работе с хвойными породами вызван главным образом необходимостью сохранения генофонда некоторых пород, их декоративными свойствами и трудностью размножения черенками. Для можжевельника, например, применение клепального микроразмножения является наиболее перспективным способом, так как семена данной породы обладают низкой всхожестью, наблюдается дегенерация зародышей, а при черенковании процент укорененных черенков не превышает 5--8 %. Введение в культуру криптомерии и ее последующее размножение необходимо с целью получения достаточного количества посадочного материала, который используется главным образом для посадки в садах и парках, где она ценится из-за декоративных свойств. Хвоя криптомерии очень густая, обладает способностью изменять окраску в зимний период, что делает эту породу еще более привлекательной. Что же касается остальных пород, за исключением некоторых видов семейства сосновых, то размноженный посадочный материал в основном используется при озеленении городов.

В табл. 1 и 2 представлены некоторые древесные хвойные породы, для которых разработана техника культивирования изолированных тканей в условиях in vitro.

Таблица 1. Применение культуры тканей для размножения хвойных пород

Таблица 2. Применение культуры in vitro для клонирования растений представителей рода сосна и ель

"Примечания к таблицам 1 и 2:1 -- образование адвентивных почек; 2 -- клонирование древесных пород с применением методов микрочеренкования; 3 -- дифференциация почек в каллусе; 4 -- соматический эмбриогенез в каллусе.

Для основных лесообразующих пород России, и прежде всего сосны обыкновенной и ели европейской, в перспективе возможно включение способа культуры изолированных зародышей в систему селекции. В данном случае сокращается примерно в 3,5--4 раза срок получения посадочного материала. Так, в Канаде (Онтарио) ежегодно высаживают на лесокультурную площадь более 60 млн саженцев ели черной, выращенных из изолированных зародышей в стерильных условиях.

Практическое применение способа клонального микроразмножения в селекции хвойных пород.

Заключение

Метод клонального микроразмножения имеет большие преимущества, но вместе с тем он является трудоемкой и дорогостоящей процедурой, поэтому в настоящее время его применение в промышленных масштабах ограничено. Технология клонального размножения in vitro на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений, однако метод чаще всего используется для растений, с трудом размножаемых обычными методами, а также для решения задач, связанных с селекцией или с фундаментальными исследованиями, а именно:

1. Быстрое эффективное размножение отдельных генотипов или новых перспективных сортов.

2. Получение и эффективное размножение линий для производства гетерозисных гибридных семян.

3. Размножение ценных элитных растений с целью получения генетически идентичного потомства, например единичных гаплоидных растений или сконструированных методами клеточной и генной инженерии.

4. Быстрое получение и дальнейшее размножение свободного от вирусов и патогенных микроорганизмов посадочного материала плодоовощных полевых и декоративных культур.

5. Сохранение редких и исчезающих видов растений. Это способствует сохранению и воспроизводству фонда редких и исчезающих видов и позволяет быстро размножить уникальные сорта декоративных растений.

6. Размножение ценных культурных и дикорастущих пород с низким коэффициентом размножения, семенное потомство которых расщепляется, а вегетативное размножение обычными способами происходит очень медленно.

7. Метод клонального размножения может быть также применен для массового получения «искусственных семян». Эмбриоиды, получаемые в суспензионной культуре, могут оказаться более удобными при автоматизации процессов микроразмножения, чем культивируемые побеги или регенеранты.

Клональное микроразмножение применяется для разведения декоративных (орхидеи, гвоздики, нарциссы, розы, фрезии, гиацинты, сирень), овощных (картофель, лук, чеснок, томаты овощных), плодово-ягодных (земляника, малина, смородина, виноград, яблоня, вишня) культур. Среди злаковых этим методом размножают в промышленных масштабах только сахарный тростник и бамбук. Злаковые травы и зерновые культуры размножаются in vitro с трудом, и этот метод используется в селекционных работах в небольших масштабах.

Преимущества клонального микроразмножения так очевидны и возможности его применения в растениеводстве и селекции растений настолько велики, что нет сомнений в том, что в ближайшем будущем широкое развитие получит биотехнология производства посадочного материала.

К недостаткам метода клонального микроразмножения следует отнести сложность и высокую цену применяемого оборудования, возможность повышения частоты мутаций в культуре in vitro, удорожание посадочного материала. В связи с этим клональное микроразмножение целесообразно применять для получения высоких репродукций в семеноводстве с последующим применением традиционных методов вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала.

Список использованной литературы

1. Сайт: http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell6_1.htm

2. Учебник. - В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др.; Под ред. В.С. Шевелухи. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк.

3. Сайт: http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/ozdorovlenie-posadochnogo-materiala-rasteniy/

4. Сайт: http://pk-legion.ru/selskokhozyaistvennaya-biotekhnologiya-str92.html.

Размещено на Allbest.ru