Морфогенетичний аналіз раннього ембріогенезу свиней при одержанні зародків in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

УДК 636.4.082:575:591.31

МОРФОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ

СВИНЕЙ ПРИ ОДЕРЖАННІ ЗАРОДКІВ IN VITRO

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Куновський Юрій володимирович

с. Чубинське Київської області - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Ковтун Світлана Іванівна, завідувач лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин УААН

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Коновалов В'ячеслав Сергійович, головний науковий співробітник відділу генетики Інституту розведення і генетики тварин УААН

кандидат сільськогосподарських наук Метлицька Олена Іванівна, старший науковий співробітник лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН

Провідна установа: Сумський національний аграрний університет, кафедра розведення і селекції тварин, м. Суми

Захист відбудеться 15 березня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська обл., Бориспільський район, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Автореферат розісланий 9 лютого 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мільченко Ю.В.

Куновський Ю.В. Морфогенетичний аналіз раннього ембріогенезу свиней при одержанні зародків in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2007.

Викладено результати застосування комплексного морфогенетичного аналізу при вивченні закономірностей реалізації генетичної інформації в ембріогенезі отриманих in vitro ембріонів свиней. Обґрунтовано доцільність застосування цитогенетичного контролю для оцінки біологічної повноцінності розвитку in vitro ембріонів свиней на підставі вивчення цитоморфологічних особливостей проходження мейозу у незрілих та дозрілих in vitro ооцитах, стану хроматину ядер отриманих in vitro зародків свиней. Показано необхідність проведення початкового відбору морфологічно-нормальних ооцит-кумулюсних комплексів свиней із щільним кумулюсом, однорідною гомогенною ооплазмою. Проаналізовано вплив концентрації клітин гранульози на ядерне (майже 70%) та цитоплазматичне дозрівання ооцитів та визначена оптимальна їх концентрація (3 - 5х10⁶ кл/мл). Вирішено питання зниження чисельної пенетрації сперматозоїдами яйцеклітин завдяки визначенню концентрації сперматозоїдів у середовищі запліднення (0,250 млн/мл) та часу сумісної інкубації гамет (18 год.). Підібрано найбільш збалансоване по складу середовище (NSCU-23) для культивування ембріонів свиней поза організмом (27,8%) до доімплантаційних стадій. Встановлено залежність повноцінності ооцит-кумулюсних комплексів свиней та розвитку ембріонів in vitro від віку тварин-донорів яєчників. Показано, що при осіменінні in vitro яйцеклітин свиней кріоконсервованими епідидимальними спермато зоїдами, середній рівень отримання зигот становить 56,9%, дроблення ембріонів - 48,0% та розвиток зародків свиней in vitro до придатних для трансплантації стадій (морули-бластоцисти) становить 27,0%.

Ключові слова: свині, ембріогенез, ооцити, яйцеклітини, ембріони, запліднення in vitro, морфогенетичний і цитогенетичний аналіз.

Куновский Ю.В. Морфогенетический анализ раннего эмбриогенеза свиней при получении зародышей in vitro - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 2007. ембріон мейоз цитогенетичний

Изложены результаты применения комплексного морфогенетического анализа при изучении закономерностей реализации генетической информации в эмбриогенезе полученных in vitro эмбрионов свиней. Обосновано применение цитогенетического контроля для оценки биологической полноценности развития in vitro эмбрионов свиней на основании результатов изучения цитоморфологических особенностей прохождения мейоза в незрелых и созревших in vitro ооцитах, состояния хроматина ядер зародышей свиней, полученных in vitro. Показана необходимость проведения отбора морфологически-нормальных ооцит-кумулюсных комплексов свиней с плотным кумулюсом и однородной гомогенной ооплазмой. Проанализировано влияние различной концентрации клеток гранулезы на ядерное (почти 70%) и цитоплазматическое созревание ооцитов, определена оптимальная ее концентрация - 3 - 5 х10⁶ кл/мл. Достигнуто снижение множественной пенетрации сперматозоидами яйцеклеток благодаря определению концентрации сперматозоидов в среде оплодотворения (0,250 млн/мл) и времени совместной инкубации гамет (18 час). На основании экспериментальных данных установлено, что для культивирования эмбрионов свиней вне организма к доимплантационным стадиям (27,8%) наиболее сбалансированной по составу является среда NSCU-23. Установлена зависимость полноценности ооцит-кумулюсних комплексов свиней и развития эмбрионов in vitro от возраста животных-доноров яичников. Установлено, что для более эффективного получения эмбрионов свиней in vitro необходимо использовать гаметы из яичников нециклирующих свинок препубертатного возраста, ооциты которых после созревания теряют клетки кумулюса. После оплодотворения таких клеток вне организма получено дробление зигот, и развитие зародышей на уровне 58% и 36%, соответственно. Установлена взаимосвязь между прижизненной морфологической характеристикой полученных in vitro эмбрионов свиней и состоянием хроматина ядер. Показано, что полученные in vitro качественные зародыши свиней (61,3%) имели морфологически нормальные ядра с ядрышками. Зародыши (7,0%), которые на основании прижизненной оценки имели незначительные признаки дегенерации (лизис отдельных бластомеров или отставание одного из бластомеров в развитии), вместе с морфологически нормальными ядрами имели пикнотические. Разработаны элементы технологии получения in vitro эмбрионов свиней с использованием эпидидимальных сперматозоидов хряков, что дает возможность углубить знания закономерностей эмбрионального развития животных, способствует совершенствованию методов повышения эффективности использования генетического материала животных при сохранении их генофонда. Показано, что при оплодотворении in vitro яйцеклеток свиней криоконсервированными эпидидимальными сперматозоидами, средний уровень получения зигот составляет 56,9%, дробление эмбрионов - 48,0%. Развитие зародышей свиней in vitro до пригодных для трансплантации стадий (морулы - бластоцисты) составляет 27,0%.

Ключевые слова: свиньи, эмбриогенез, ооциты, яйцеклетки, эмбрионы, оплодотворение in vitro, морфогенетический и цитогенетический анализ.

Kunovskiy J.V. Morphogenetic analysis of early pig embryogenesis of embryos produced in vitro. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree of agriculture sciences on a speciality 03.00.15 - genetics. - Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS, v. Chubinske, Kyiv Region, 2007.

Results of complex morphologic analysis utilization during research of genetic information realization pattern during embryogenesis of pig embryos obtained in vitro are shown. Explanation of cell genetics controls for evaluation of biological completeness of pig embryos development in vitro basing on the research of cells morphological properties during meiosis in mature and immature oocytes in vitro, conditions of nuclear chromatin pig embryos obtained in vitro are provided. Needs of initial point of selection of morphologically-normal pig cumulus oocyte complexes with dense cumulus and homogeneous cytoplasm are represented. Influence of different concentrations cells granulose on the nuclear (almost 70%) and cytoplasm maturation of cumulus oocyte complexes was analyzed and their optimal concentration is determined (3 - 5х10⁶ cells/ml). The problem of decreased polyspermic penetration of spermatozoa of ova by calculation of concentration of spermatozoa in fertilization medium (0,250 х10⁶/ml) is resolved and the time of combined gamete incubation is identified (18 hours). The most balanced media (NSCU-23) for embryos cultivation outside of the pig organisms before implantation (27.8%) is found. The dependence quality of pig cumulus oocyte complexes on age of animal-donors ovaries is identified. The mean level of zygote yield is 56.9%, embryo cleaved - 48.0% and in vitro embryo development of pig oocytes suitable for transplantation stages (morulae - blastocyst) is 27.0% during insemination in vitro of swine oocytes with cryopreservation epididymal spermatozoa is shown.

Key words: pig, embryogenesis, oocytes, ova, embryos, in vitro fertilization, morphogenetic and cytogenetic analysis.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток тваринництва ґрунтується на встановленні генетичних закономірностей розподілу і реалізації генетичної інформації. Дослідження з генетики розвитку і ембріології створюють наукову основу для розроблення сучасних методів відтворення тварин. Зокрема, поглиблене вивчення особливостей раннього доімплантаційного розвитку ссавців in vitro та in vivo потребує застосування методів генетики розвитку, клітинної біології, експериментальної ембріології (Дибан А.П., 1988; Кузнєцов В.Є., 1998, 2001). Перспективність цього напряму досліджень пов'язана з отриманням та додатковим використанням цінного генетичного матеріалу тварин, збереженням генофонду, а також як джерела генетичного матеріалу в програмах вивчення трансгенезу і клонування зародків. Ефективність розвитку отриманих поза організмом ембріонів свиней з використанням модифікованих умов дозрівання яйцеклітин in vitro, регуляції кількості сперматозоїдів при заплідненні, удосконалення умов культивування отриманих зародків поза організмом є невисокою (Coy P. et al., 1999; Brьssow K.-P., 2000; Nagai T., 2001; Ковтун С.І., 2004; Коваленко В.Ф., Мартиненко Н.А., 2005).

Вивчення мейотичних та мітотичних перетворень хроматину гамет та ембріонів свиней, дослідження впливу різних типів хромосомних аберацій на їх розвиток ґрунтується на цитогенетичних методах. Комплексний морфогенетичний аналіз забезпечує оцінку біологічної повноцінності розвитку in vitro ембріонів свиней і дозволяє встановити закономірності генетичних процесів у ранньому ембріогенезі свиней. На вирішення цих питання були спрямовані дослідження по дисертаційній роботі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась як складова частина науково-дослідних робіт Інституту розведення і генетики тварин УААН за темами: „Розробити та удосконалити новітні біотехнологічні методи тиражування та конструювання бажаних генотипів сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації 0101U003121); „Вивчити молекулярно-генетичні та ембріологічні механізми визначення статі сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації 010611005839); „Розробити комплексну систему оцінки якості доімплантаційних ембріонів та гамет сільськогосподарських тварин з використанням програми автоматизованого оптико-електронного програмування” (№ держреєстрації 01061005838); „Збереження генофонду сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації 01061005845).

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було дослідити особливості початкових стадій ембріогенезу і встановити закономірності мейотичних та мітотичних перетворень хромосом ооцитів та ембріонів свиней і на цій основі обґрунтувати і вдосконалити методи отримання in vitro доімплантаційних зародків свиней. Для її вирішення були поставлені наступні завдання:

дослідити цитогенетичні особливості перетворень хроматину в мейозі, визначити морфогенетичні відмінності незрілих ооцитів свиней;

вивчити особливості мейотичних перетворень хроматину при дозріванні in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиней під впливом мікрохірургічних маніпуляцій;

дослідити генетичні механізми запліднення in vitro яйцеклітин свиней та розвиток зародків при використанні епідидимальних сперматозоїдів кнурів;

встановити вплив віку свиней-донорів незрілих ооцитів на ефективність отримання ембріонів поза організмом;

проаналізувати на основі цитогенетичного аналізу стан хроматину ядер зародків свиней, які отримані in vitro.

Об'єкт дослідження - генетичні процеси і закономірності раннього ембріогенезу свиней.

Предмет дослідження - динаміка генетичних змін хроматину ооцитів свиней у мейозі, генетичні механізми запліднення in vitro яйцеклітин свиней та розвитку зародків.

Методи дослідження - цитогенетичний - аналіз стану хромосомних перетворень під час дозрівання гамет свинок та розвитку зародків свиней поза організмом; експериментальної ембріології - дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиней, співкультивування in vitro гамет свиней, культивування ембріонів свиней поза організмом; біометричний - визначення вірогідності одержаних результатів.

Наукова новизна роботи. Вперше розроблені методичні засади комплексного застосування морфоцитогенетичного контролю ембріонального розвитку свиней. На основі здійсненого цитогенетичного аналізу перетворень хроматину в мейозі ооцитів свиней, встановлених закономірностей змін хроматину ядер ембріонів розроблено технологічні елементи отримання in vitro доімплантаційних зародків свиней. Доведені переваги використання ооцитів із яєчників нестатевозрілих (препубертатних) свинок. Вперше використані кріоконсервовані епідидимальні сперматозоїди кнурів для отримання in vitro ембріонів свиней та показана результативність використання таких гамет при штучному осіменінні свиноматок.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи комплексного морфогенетичного аналізу раннього ембріогенезу свиней забезпечують підвищення ефективності запліднення in vitro яйцеклітин свиней та розвитку зародків. Встановлені фактори впливу на хромосомні перетворення в мейозі ооцитів свиней та ядер ембріонів дають можливість досягти отримання in vitro ембріонів свиней на високому рівні (50-60%). Використання епідидимальних сперматозоїдів кнурів для довготривалого збереження генетичного матеріалу порід свиней забезпечує збереження генофонду (ТОВ „Лугівське”, Дніпропетровська обл.) та є результативним при штучному осіменінні (ПСП „Шевченківське”, Київська обл.). Матеріали наукових досліджень використані у навчальному процесі Інституту природничо-географічної освіти та екології Національного педагогічного університету ім. М. Драгоманова. Результати науково-дослідної роботи використані при презентації сучасних біотехнологічних розробок в Україні на Міжнародній виставці „БІО 2006” (квітень, 2006 р., м. Чикаго, США) та представлені в проекті 3940 „Отримання зародків свиней in vitro з використанням нанобіокомпозитів”, поданого до Українського науково - технологічного центру.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначений напрям досліджень, розроблена схема проведення досліджень, методика їх виконання. Викладені у дисертаційній роботі результати отримані особисто автором або за його безпосередньої участі. Дисертантом особисто проаналізовані першоджерела літератури, сформульовано висновки та практичні пропозиції.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладені в доповідях на міжнародній науково-практичній конференції „Виробництво продукції тваринництва в Україні: селекція, технологія, ветеринарна безпека та економіка” (Суми, 2003), наукових конференціях молодих вчених та аспірантів Інституту розведення і генетики тварин УААН (Чубинське, 2003, 2004, 2005), IV міжнародній науково-виробничій конференції „Трансплантація ембріонів як інструмент селекції в новому тисячолітті” (Київ, 2004), міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, 2004), зарубіжних міжнародних науково-практичних конференціях: “Научное наследие П.Н. Кулешова и современное развитие зоотехнической науки и практики животноводства” (Москва, 2004), “Научные проблемы производства продукции животноводства и улучшения ее качества” (Брянск, 2004), „Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Боровськ, 2006), „Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных” (Московська обл., п. Дубровиці, 2006).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертації опубліковано в 4 статтях у наукових журналах, 3 збірниках наукових праць та 4 матеріалах і тезах конференцій. Всього опубліковано 11 друкованих праць (в т.ч. 6 у фахових виданнях).

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методики досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 126 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 13 таблицями і 21 рисунком. Список літератури містить 198 джерел, з яких 122 іноземних.

Дослідження виконані в лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин згідно схеми досліджень. Яєчники відбирали у забитих свинок препубертатного віку, або у свиноматок у загальній кількості 107 голів великої білої породи. Відбирали ооцити діаметром 120 - 130 мкм із щільним темним кумулюсом, неушкодженою прозорою оболонкою і гомогенною невакуолізованою ооплазмою правильної округлої форми без морфологічних ознак просунутої атрезії. При культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів використовували свіжоотримані клітини гранульози в концентрації 3-5х10⁶, 15-25х10⁶, >25х10⁶ клітин на мл, які отримували із антральних фолікулів (діаметр 3 - 4 мм) з морфологічно нормальними ооцитами. Концентрацію клітин гранульози визначали за допомогою камери Горяєва (Ожин Ф.В. и др., 1983).

Осіменіння дозрілих in vitro яйцеклітин свиней проводили з використанням кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів, одержаних з придатків сім'яників статевозрілих кнурів (Ковтун С.І., Мелешко Н.Я., 2002). Видалення розріджувача та відбір рухливих чоловічих гамет проводили методом спливання (swim-up) в модифікованому середовищі TALP без іонів Са²⁺ (Katska L., e.a., 1993). В дослідженнях використано епідидимальні сперматозоїди від 6 кнурів великої білої породи, отримані шляхом кастрації самців.

Епідидимальні сперматозоїди спільно інкубували із яйцеклітинами в середовищі TALP-IVF (Katska L., e.a., 1993) з додаванням суміші РНЕ (20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину) і розчину гепарину (10мкг/мл) протягом 4 та 18 годин при концентрації рухливих сперматозоїдів 250, 600 тис., 1,5 млн./мл. Концентрацію чоловічих гамет визначали за допомогою камери Горяєва. Зиготи культивували in vitro у середовищі NCSU-23, та NCSU-37 (Gajda B., 1998). Культивування ембріонів свиней in vitro до доімплантаційних стадій проводили протягом 5 - 6 днів.

Центрифугування незрілих ооцитів свиней для виявлення ядра здійснювали при 14000 g протягом 15, 20 та 25 хвилин.

Для виявлення хромосомних порушень при дозріванні ооцитів in vitro та аналізу стану хроматину ядер ембріонів готували сухоповітряні препарати за допомогою модифікованого методу Тарковського (Tarkowski A.K., 1966). Фарбування препаратів проводили з викорис танням 2%-ного розчину барвника Гімза. Одержані препарати аналізували під світловими мікроскопами Jenaval, Carl Zeiss з фотовиводом „Axiostar Plus”.

Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критерію ч² (Лакин Г.Ф., 1990).

Дослідження хроматину незрілих ооцитів свиней. В ооцитах ссавців після ініціації мейозу проходять ранні стадії профази І, а потім мейоз блокується (диплотена). З переходом ооцитів до дозрівання транскрипційна активність диплотенних хромосом знижується, а в ядрах відбуваються зміни, які пов'язані з переходом із профази І мейозу до метафази І, що є початком дозрівання гамет (Дибан А.П., 1988).

Нами показано, що популяція вилучених ооцитів із яєчників свиней є неоднорідною, тобто гетерогенною за структурою хроматину. За результатами цитогенетичного аналізу препаратів встановлено, що 94,5% (240/254) ооцитів всіх проаналізованих груп знаходиться на стадії диплотени, решта на більш пізній стадії мейозу - діакінез. При цьому на стадії диплотени ооцити містять хроматин у дифузному (зародковий міхурець) - 55,0%, фібрилярному (27,9%) стані і у вигляді видимих бівалентів (17,1%). Встановлено, що ооцити із щільним кумулюсом, неушкодженою прозорою оболонкою та гомогенною ооплазмою мали найнижчу частоту хромосомних порушень (3,4%) (дегенерація або деспіралізація хроматину), і саме такі гамети використовувались нами в наступних дослідженнях.

Новим підходом до отримання трансгенних особин є метод мікроін'єкції екзогенної ДНК у зародковий міхурець незрілих ооцитів (Jura J., 1995; Кузнєцов В.Є., 2001). Незрілі ооцити сільськогосподарських тварин можуть використовуватись як доступний та дешевий матеріал для відпрацювання методики візуалізації пронуклеусів з допомогою центрифугування. У незрілих ооцитів свиней після центрифугування при 14000 g протягом 25 хвилин зародковий міхурець виявлено у найбільшої кількості (39%) ооцитів свиней, в порівнянні з 15 та 20 хвилинами центрифугування (2% і 26%, відповідно). На нашу думку, решта ооцитів свиней перебувала на більш просунутих стадіях мейозу, а саме на стадії диплотени фібрилярної, видимих бівалентів, а також діакінезу. Ці припущення можна пояснити тим, що лише на диплотені дифузній ще є ядерна оболонка і хроматин перебуває в найбільш дифузному стані.

Вивчення часових параметрів дозрівання яйцеклітин свиней до стадії метафази II мейозу. Показана можливість отримання запліднення in vitro яйцеклітин свиней після їх дозрівання поза організмом протягом 42, 44 (Long C.R. et al., 1999), 46 (Kikuchi K. et al., 1998), а також 48 годин (Wang W. et al., 1995). Для встановлення оптимального часу дозрівання ооцитів свиней проведено цитогенетичний аналіз хроматину на різних стадіях мейозу після 40, 42, 44, 46 годин культивування in vitro. Встановлено із отриманих даних, що при дозріванні in vitro протягом зазначених часових параметрів на стадії диплотени найбільша кількість ооцитів спостерігалася при 40-годинному культивуванні (36,1%; 3,8%; 8,1%;13,8%, відповідно). Кількість отриманих цитогенетичних препаратів із добре вираженим хроматином на стадіях диплотени та метафази ІІ після 40 год. культивування незначно відрізнялась (8,3%), що підтверджує тенденцію до подовження часових параметрів in vitro культивування ооцит-кумулюсних комплек сів свиней. Після 42 год. дозрівання поза організмом спостерігалось різке підвищення кількості ооцитів, які відновили мейотичне дозрівання, але на стадії метафази ІІ (рис.2) порівнюючи з 40-годинним культивуванням кількість гамет суттєво не відрізнялася (27,8% та 44,9% відповідно). Найвищий рівень клітин із хромосомними порушеннями (надлишкова деспіралізація, дегенерація хромосом, часткове нерозходження бівалентів на уніваленти в метафазі I мейозу, блок анафази I) виявлено при 40-годинному культивуванні (33,3%, 30,8%, 29,1% і 27,5%, відповідно). При дозріванні протягом зазначених часових параметрів незначна кількість гамет (в середньому 7,4%) зупинилася на стадії діакінезу та метафази першого поділу мейозу.

При 46 годинах дозрівання найбільша кількість клітин (78,7%) перебували на стадії метафази II мейозу в порівнянні з іншими часовими параметрами (27,8%; 44,9%; 51,6%, відповідно). Необхідно відмітити суттєве зменшення після 46 год. культивування in vitro кількості проаналізованих яйцеклітин свиней на стадії телофази І, успішне завершення якої дозволяє досягти повноцінного ядерного дозрівання жіночих гамет. Тому в наступних дослідженнях ми використовували 46-годинне культивування in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиней.

Стан хроматину ооцитів свиней при дозріванні in vitro під впливом клітин гранульози та мікрохірургічних маніпуляцій. Зарубіжними вченими показано, що при додаванні клітин гранульози та фолікулярної рідини при культивуванні in vitro ооцит-кумулюсних комплексів свиней покращується ядерне (Niwa K., 1993) та цитоплазматичне дозрівання (Naito K., e.a. 1988). Вивчено вплив на дозрівання in vitro ооцитів свиней додавання різної концентрації клітин гранульози (група І - 3-5х10⁶, група ІІ - 15-25х10⁶, група ІІІ - < 25х10⁶ клітин на мл). За результатами цитогенетичного аналізу не спостерігалось вірогідної різниці за частотою перебування хромосомного матеріалу на стадіях диплотени метафази І, блоку анафази І і телофази І ранньої в усіх групах.

На стадії телофази І пізньої - метафази ІІ ооцити, що дозрівали в присутності найменшої концентрації клітин гранульози, перебували на суттєво вищому рівні порівняно із групою ІІІ. Вірогідної різниці між І, ІІ і ІІІ групами у кількості ооцитів із дегенерацією хромосом на цих стадіях мейозу не спостерігалось, хоча кількість таких гамет в групі І була найбільш низькою. Загальна кількість хромосомних порушень, які виникли під час культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиней in vitro, суттєво не відрізнялась в усіх групах, але найменша їх кількість в першій групі дозволяє зробити висновок, що при дозріванні ооцитів свиней необхідно додавати клітини гранульози в концентрації 3-5х10⁶ на мл. Позитивний вплив клітин гранульози на дозрівання ооцитів свиней пов'язаний з їх здатністю продукувати естрадіол-17 і прогестерон.

Досліджено вплив мікрохірургічних маніпуляцій (центрифугування та мікроін'єкції у зародковий міхурець) на дозрівання ооцитів свиней in vitro. Детальний цитогенетичний аналіз груп яйцеклітин свиней (ін'єковані, центрифуговані, інтактні) виявив, що майже 70% ін'єкованих гамет не відновили мейоз. Вибрані параметри центрифугування (14000 g, 25 хв.) не мали негативного впливу на початок ядерного дозрівання ооцитів порівняно із інтактними гаметами (стадія диплотени - 14,3% і 10,0%, відповідно). На основі цитогенетичного аналізу виявлено хромосомні порушення у вигляді блоку анафази І (центрифуговані гамети - 9,5%; інтактні - 10,0%). При цьому порушенні відмічено, що всі хромосоми диплоїдного набору хромосом свині (n = 38) із-за порушень дозрівання ооцитів під впливом певних факторів не розходяться до полюсів для формування телофази І мейозу. Такі гамети не здатні до завершення мейозу і відповідно до запліднення. Показана відсутність негативного впливу центрифугування на рівень дозрівання ооцитів свиней до стадії телофази I середньої - метафази ІІ (76,2%). Застосовані параметри центрифугування не призводили до збільшення кількості ооцитів з хромосомними порушеннями (23,8%), порівняно із інтактними клітинами (30,0%). Ооцити після мікроін'єкції дозрівали in vitro на низькому рівні (32,0%), в результаті чого значно зростала кількість ооцитів з хромосомними порушеннями (68,0%).

Морфоцитогенетичний аналіз гаметогенезу і ембріогенезу свиней в умовах in vitro. Завдяки отриманню великої кількості ооцитів свиней із яєчників забитих тварин, стало можливим застосувати цитогенетичний аналіз стану хроматину гамет та ембріонів, отриманих in vitro (Brьssow K.-P. et al., 2000, Ковтун С.І., 2004). Проведення цитогенетичного аналізу дає змогу аналізувати, накопичувати матеріал та давати достовірну інформацію щодо хромосомних порушень, які виникають під час гаметогенезу, в період дозрівання, запліднення яйцеклітин та ембріонального розвитку зигот, отриманих поза організмом. Показано, що ефективність використаного нами цитогенетичного аналізу хроматину гамет та зародків є високою. Приготовані нами сухоповітряні препарати можна ефективно аналізувати під світловим мікроскопом із збільшенням 100 і 900 (або 1000) раз. При цьому чітко ідентифіковані стадії мейозу ооцитів, стан хроматину в мейозі, а також стан ядер ембріонів. Встановлено, що ефективність цитогенетичного контролю становить в середньому 85%.

При отриманні зародків свиней in vitro і виконанні цитогенетичного аналізу одержаних препаратів ембріонів на різних стадіях розвитку (від двох бластомерів до пізньої морули) встановлено, що ембріони які за візуальною оцінкою були визначені як відмінної якості (n=219), мали морфологічно нормальні ядра із ядерцями, кількість яких відповідала кількості бластомерів ембріонів, хроматин цих ядер теж відповідав стадії розвитку зародка (ранні чи пізні).

У ембріонів (n=113), які під час візуальної оцінки були визначені як дегенеровані (нерівномірне дроблення бластомерів, лізис та руйнування бластомерів, порушення зв'язків між бластомерами) більшість ядер були пікнотичними. Пікноз ядер проявлявся вираженим ущільнення хроматину, який зливався в темну гомогенну масу з різким зменшенням розміру ядра.

Зародки (n=25), що за морфологічною характеристикою мали незначні прояви дегенерації (лізис окремих бластомерів або відставання одного із бластомерів у розвитку) поряд з більшістю морфологічно нормальними ядрами мали поодинокі пікнотичні ядра. Таким чином, між зажиттєвою цитоморфологічною характеристикою зародків, отриманих in vitro, та станом хроматину ядер існує чітко виражений взаємозв'язок. Цей метод дозволяє на основі детальної морфологічної оцінки прогнозувати стан ядер ембріону і відповідно здатність його до повноцінного розвитку поза організмом.

Використання кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів для збереження генофонду свиней. Сучасні біотехнологічні дослідження у тваринництві дають можливість ефективно використовувати сперматозоїди, отримані із хвостових частин придатків сім'яників (епідидимальні), для отримання зародків поза організмом, одержання трансгенних тварин, для додаткового збереження генофонду тварин (Кузнєцова І.Б., Ковтун С.І., 1998; Багиров В.А. и др., 2006). Вивчається можливість використання кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів при штучному осіменінні свиней. Для запліднення in vitro яйцеклітин свиней нами використовувались кріоконсервовані епідидимальні сперматозоїди кнурів. Показано, що із 735 яйцеклітин, які були отримані в результаті дозрівання ооцитів поза організмом, в результаті осіменіння кріоконсервованими епідидимальними спермато зоїдами нами отримано 56,9% (418/735) зигот. Від загальної кількості використаних яйцеклітин роздробилось 48,0% ембріонів, або 84,4 % від кількості зигот (353/418). 27,0% ембріонів (113/418) розвинулись до стадій, придатних для трансплантації реципієнтам (морули - бластоцисти).

Основною перевагою епідидимальних сперматозоїдів свиней, є те, що в порівнянні з еякульованими сперматозоїдами, епідидимальні мають вищу стійкість до холодового шоку, що дає можливість довгострокового збереження генетичного матеріалу (Харченко М.І., Черненко М.В., 1996; Ковтун С.І. та ін., 2002). Нами доведена результативність осіменіння свиноматок епідидимальними кріоконсервованими сперматозоїдами кнурів. Осіменіння виконано згідно „Інструкції із штучного осіменіння свиней” (2003), яке полягало у використанні нефракційного способу осіменіння і спермодози об'ємом 85 - 100 мл із концентрацією сперматозоїдів 2 - 5 млрд. На основі розробленого нами методу отримання ембріонів свиней in vitro, встановлена можливість оцінювати запліднювальну здатність сперматозоїдів кнурів-плідників. При цьому сперматозоїдами одного кнура в одному досліді запліднюють до 100 яйцеклітин і через 3 - 6 днів встановлюється їх запліднювальна здатність за результатами отримання та розвитку ембріонів in vitro. Цим прискорюється оцінка відтворювальних якостей плідників, оскільки згідно „Інструкції із штучного осіменіння свиней” запліднювальну здатність сперми кнура слід перевіряти не менше ніж за п'ятьма еякулятами і осіменінням двадцяти свиноматок.

Ефективність ембріогенезу свиней у залежності від концентрації сперматозоїдів. Показано, що високий рівень поліспермного запліднення in vitro яйцеклітин свиней знижує рівень отримання біологічно повноцінних ембріонів (Hunter R.H.F., 1990). З метою підвищення ефективності методу отримання моноспермно запліднених зародків свиней поза організмом ми змінювали концентрацію сперматозоїдів кнура без зміни часу сумісної інкубації гамет in vitro (18 год.). У дослідженнях використовували концентрацію сперматозоїдів 0,25; 0,60; 1,50 млн. у 1 мл середовища запліднення. Встановлено, що при використанні різних концентрацій кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнура можна отримати однаково високий відсоток запліднених гамет (60,0 - 75,0%).

Але при застосуванні концентрації сперматозоїдів 1,5 млн. в 1 мл рівень моноспермії у запліднених яйцеклітинах виявлений суттєво нижчий, порівняно з меншими концентраціями. При цьому поліспермно запліднених зигот виявлено на рівні 40%. Найвища кількість нормально моноспермно запліднених клітин була при застосуванні 0,25 млн./мл сперматозоїдів (65,0%) від загальної кількості використаних у дослідженнях гамет свинок.

Аналізуючи моноспермне і поліспермне запліднення від загальної кількості одержаних зигот показано, що рівень моноспермного запліднених in vitro зигот був найвищий (86,7%) при концентрації сперматозоїдів 0,25 млн./мл.

Вплив фактора середовища на розвиток in vitro зародків свиней. Встановлено, що найбільш ефективним середовищем для культивування ембріонів свиней поза організмом є NCSU і його модифікації (Reed M.L. et al., 1992). Проведена порівняльна характеристика середовищ для культивування ембріонів NCSU-23 і NCSU-37. Дослідженнями доведено, що середовище NCSU-23 забезпечує кращий розвиток отриманих in vitro ембріонів свиней. Кількість роздроблених ембріонів суттєво не відрізнялась при використанні різних середовищ. У середовищі NCSU-23 отримано суттєво більшу кількість ембріонів на доімплантаційних стадіях.

Враховуючи отримання на однаковому рівні ранніх 2-4-клітинних ембріонів свиней після культивування зигот поза організмом у вищезгаданих середовищах, наявність вірогідної різниці у розвитку зародків поза організмом до стадії ранньої морули переконливо свідчить про кращу збалансованість середовища NCSU-23 при культивуванні ембріонів свиней, отриманих in vitro.

Вивчення впливу віку свиней - донорів ооцитів на отримання ембріонів in vitro. Показано, що для отримання in vitro ембріонів свиней у більшості випадків використовують яєчники нециклюючих свинок препубертатного віку (Kikuchi K. et al., 1993). Проте встановлено, що ооцити, отримані від дорослих свиноматок, дозрі вають до стадії метафази ІІ мейозу швидше, що забезпечує зменшення кількості хромосомних порушень і підвищення рівня розвитку ембріонів in vitro (Nagai T., 2001).

Вивчено ефективність отримання ембріонів свиней поза організмом коли ооцит-кумулюсних комплекси відбирали від статевозрілих циклюючих свиней (група І, n = 235) та від нециклюючих (препубертатних) свинок (група ІІ, n = 228). Результати цитогенетичного аналізу показують, що ооцити І та ІІ груп на однаково високому рівні відновлюють мейоз в умовах in vitro і виявили високу та подібну компетентність до ядерного дозрівання (83,9% і 81,2%, відповідно). Лише 4,8% всіх гамет залишились на стадії зародкового міхурця (диплотена профази І мейозу). Хромосомні порушення під час дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиней поза організмом у вигляді блоку анафази І мейозу було виявлено на рівні 4% від загальної кількості досліджуваних гамет. В цілому хромо сом ні порушення під час in vitro дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиней суттєво не відрізнялись (16,1% у І групі та 18,8% у ІІ групі). Використання ооцитів І та ІІ груп при отриманні зародків свиней in vitro забезпечили отримання подіб ного рівня запліднення, дроблення та розвитку зародків свиней поза організ мом. Отримання гамет із яєчників ІІ групи є більш ефективним з точки зору наявності більшої кількості незрілих гамет, тому що одержання ооцитів з яєчни ків циклюючих свиней ускладнено наявністю великого числа жовтих тіл яєчників.

При проведенні вищезгаданих досліджень було виявлено, що частина гамет отриманих від нециклюючих свинок після in vitro дозрівання поза організмом протягом 46 год. зберігає клітини кумулюсу майже повністю (група 1, n = 103), а інша частина втрачає всі оточуючі клітини (група 2, n = 125).

Проведений цитогенетичний контроль ефективності дозрівання таких груп гамет, отриманих із яєчників нециклюючих (препуберантних) свинок встановив, що оцінені гамети 2-ї групи проявляють суттєво вищий рівень ядерного дозрівання до стадії телофази І пізньої - метафази ІІ мейозу (88,1% порівняно із 71,4% в 1-й групі, P<0,01). Рівень ооцитів із хромосомними порушеннями виявився суттєво нижчим у 2-й групі гамет (11,9% проти 28,6%, Р<0,01).

Подальші дослідження по отриманню ембріонів свиней поза організмом підтвердили встановлену закономірність більш ефективного використання яйцеклітин 2-ї групи. Експерименти з аналізу цитогенетичних препаратів показали, що рівень запліднення гамет 2-ї групи є достовірно вищим, порівняно з використанням яйцеклітин, які майже повністю зберегли клітини кумулюсу після дозрівання. Також розвиток отриманих зародків свиней поза організмом до доімплантаційних стадій суттєво переважає в групі 2.

Таким чином, ооцити із яєчників нециклюючих статевозрілих свинок, які майже повністю втратили клітини кумулюсу в процесі in vitro культивування забезпечують вірогідно вищий рівень запліднення і розвиток ембріонів до доімплантаційних стадій.

ВИСНОВКИ

Ефективну розробку та застосування біотехнологічних методів у свинарстві забезпечують дослідження генетичних закономірностей ембріонального розвитку. Комплексний морфогенетичний аналіз закономірностей реалізації генетичної інформації в процесі ембріогенезу, дослідження процесу in vitro дозрівання ооцитів свиней, встановлення механізмів їх запліднення поза організмом створює наукову основу для розширення сучасних методів біотехнології в свинарстві.

Аналіз цитогенетичних особливостей перетворень хроматину та хромосомних аберацій в мейозі дозволяє визначити оптимальні умови культивування поза організмом ооцитів свиней, які дозволяють досягти майже 80%-го рівня ядерного та цитоплазматичного їх дозрівання.

Експериментально доведено, що для більш ефективного отримання ембріонів свиней in vitro необхідно використовувати ооцити із яєчників нестатевозрілих свинок, ооцити яких після дозрівання втрачають клітини кумулюсу, що забезпечувало отримання близько 58% дроблення зигот та отримання in vitro 36% ембріонів на доімплантаційних стадіях.

Встановлені генетичні механізми та особливості процесу запліднення in vitro яйцеклітин свиней з використанням кріоконсервованих епідидимальних сперматозоїдів кнурів, на основі яких визначені умови дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів, що забезпечують 75 - 80% яйцеклітин на метафазі ІІ мейозу, досягнута ефективність запліднення яйцеклітин, рівень якої становить майже 60%, а розвиток зародків що подолали блок дроблення - в межах 27%.

На основі вдосконаленого методу отримання ембріонів свиней in vitro встановлена можливість проведення оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів кнурів протягом 3 - 6 днів, що прискорює оцінку відтворювальних якостей плідників у порівнянні з вимогами "Інструкції із штучного осіменіння свиней" (2003), згідно якої запліднювальну здатність сперми кнура слід перевіряти не менш ніж за п'ятьма еякулятами і осіменінням двадцяти свиноматок.

На основі досліджень закономірностей поліспермного in vitro запліднення яйцеклітин свиней встановлено, що для попередження появи аномальних зигот необхідно забезпечувати концентрацію епідидимальних сперматозоїдів кнурів на рівні 250 тис. в 1 мл середовища запліднення, завдяки чому досягається рівень моноспермного запліднення яйцеклітин в межах 65%.

На основі цитогенетичного аналізу встановлений взаємозв'язок між зажиттєвою морфологічною характеристикою отриманих in vitro ембріонів свиней і станом хроматину їх ядер. Показано, що отримані in vitro якісні зародки свиней (61,3%) містили морфологічно нормальні ядра з ядерцями. Частина зародків (7,0%), які на основі зажиттєвої оцінки мали незначні ознаки дегенерації (лізис окремих бластомерів або відставання одного із бластомерів у розвитку), поряд із морфологічно нормальним ядрами мали пікнотичні.

Розроблені елементи технології отримання in vitro ембріонів свиней з використанням епідидимальних сперматозоїдів кнурів поглиблюють знання закономірностей ембріонального розвитку тварин, сприяють вдосконаленню методів підвищення ефективності використання генетичного матеріалу тварин при збереженні їх генофонду.

Пропозиції виробництву

1. Отримувати в умовах in vitro ембріони свиней з використовуванням епідидимальних кріоконсервованих сперматозоїдів кнурів-плідників. Здійснювати штучне осіменіння свиноматок кріоконсервованими сперматозоїдами кнурів і додатково отримувати потомство від генетично-цінних особин.

2. На основі методики по in vitro заплідненню яйцеклітин свиней впровадити у виробництво швидку та ефективну оцінку запліднювальної здатності сперматозоїдів плідників.

3. Враховуючи закономірності та генетичні механізми раннього ембріонального розвитку сільськогосподарських тварин, отримані результати по дозріванню ооцит-кумулюсних комплексів, заплідненню і культивуванню ембріонів свиней в умовах in vitro дають змогу застосувати трансплантацію таких зародків реципієнтам.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Ковтун С.І., Мелешко Н.Я., Куновський Ю.В. Стан та перспективи використання епідидимальних сперматозоїдів сільськогосподарських тварин для одержання зародків in vitro //Наук. праці Полтавської держав. аграр. академії. - 2002. - Том 1 (20). - С.122 - 124. (Дисертантом зібраний і проаналізований експериментальний матеріал).

Ковтун С.І., Косенюк Ю.М., Куновський Ю.В. Вплив мікрохірургічних маніпуляцій на дозрівання in vitro ооцитів свиней //Вісник Сумського НАУ. - 2003. - Вип. 7. - С.98 - 101. (Дисертантом зібраний і узагальнений експериментальний матеріал по дозріванню ооцит-кумулюсних комплексів свиней in vitro).

Ковтун С.І., Куновський Ю.В., Мелешко Н.Я. Одержання зародків свиней методом запліднення in vitro //Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. - 2004. - Том 6 (№ 2). Частина 4. - С. 54 - 58. (Дисертантом проведено виконання експериментальної роботи, сформульовано висновки).

Куновський Ю.В. Застосування трансплантації ембріонів у свинарстві //Розведення і генетика тварин. - 2006. - Вип. 40. - С. 69 - 74.

Куновський Ю.В., Щербак О.В. Отримання зародків свиней in vitro з використання гамет самиць різного віку //Вiсник аграрної науки. - 2006. - №6. - С. 78 - 79. (Дисертантом виконані дослідження і сформульовано висновки).

Ковтун С.И., Куновский Ю.В. Влияние клеток гранулезы на получение зародышей свиней in vitro //”Научные проблемы производства продукции животно водства и улучшения ее качества”. Сборник научных трудов - Брянск, 2004. - С. 126 - 129. (Дисертантом виконана експериментальна робота).

Куновський Ю.В. Цитогенетичний аналіз різних груп незрілих ооцитів свиней //Конференція молодих вчених та аспірантів. Інститут розведення і генетики тварин УААН - с. Чубинське, 2003. - С.31 - 32.

Куновський Ю.В. Проблема поліспермного запліднення при отриманні зародків свиней in vitro //Конф. молодих вчених та аспірантів. Інститут розведення і генетики тварин УААН -Чубинське, 2004. - С. 24 - 25.

Ковтун С.І., Басовський Д.М., Куновський Ю.В. Методика одержання доімплантаційних зародків великої рогатої худоби та свиней поза організмом //Методики наукових досліджень із селекції, генетики та біотехнології у тваринництві - К., - 2005. - С. 192 - 200. (Дисертантом висвітлено методичні підходи отримання ембріонів свиней поза організмом).

Куновський Ю.В. Використання незрілих ооцитів із яєчників свиней різних вікових груп //Конф. молодих вчених та аспірантів. Інститут розведення і генетики тварин УААН -Чубинське, 2005. - С. 34-36.

Ковтун С.И., Куновский Ю.В. Контроль спонтанного партеногенетического развития яйцеклеток коров и свиней в условиях in vitro //ІV Междунар. конференция “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” - Боровск, 2006. - С. 244 - 245. (Дисертантом проведено аналіз експериментальних даних, сформульовано висновки).

Размещено на Allbest.ru