Патоморфологічні особливості та фрагментація ДНК у новоутвореннях молочних залоз собак

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Патоморфологічні особливості та фрагментація ДНК у новоутвореннях молочних залоз собак

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Зацікавленість у вивченні новоутворень у домашніх тварин значно зросла впродовж двох останніх десятиріч минулого століття. Це зумовлено суттєвими економічними збитками, пов'язаними із виникненням пухлин у сільськогосподарських тварин, що потребує відповідних науково обґрунтованих заходів профілактики, а також із підвищенням інтересу до проблеми співставлення пухлин дрібних тварин і людини, оскільки вивчення перших як «природних моделей» новоутворень людини має важливе значення у розширенні знань про сутність пухлинного росту (J. Martin de las Mulas, 2000). Крім того, в останні роки пухлини тварин стали використовуватися як прийнятні моделі для тестування генно-інженерних технологій, які розробляються для лікування онкозахворювань у людини (D. Argyle, 1999).

Цікавим об'єктом ветеринарної онкології є пухлини собак. За останні 25-30 років швидкість росту захворюваності на злоякісні пухлини та смертність від них зросли у людей (H. Напалков, 2004) та собак (S. Withrow, 1996). Це зумовлено погіршенням екологічного стану довкілля, а у собак, крім того, як вважають, із значним подовженням тривалості життя, що пов'язано із підвищенням якості умов утримання тварин (J. Martin de las Mulas, 2000). Собака знаходиться у найбільш близьких із людиною кліматичних та побутових умовах, а також підлягає дії одних і тих же негативних факторів довкілля, особливо за умов великих, техногенно насичених міст. За визначенням ВООЗ пухлини тварин, зокрема пухлини молочних залоз (МЗ) собак, відповідають багатьом із тих критеріїв, які сформульовані для «кандидатів на природні моделі» пухлин людини. Вони мають багато спільних із пухлинами людини чинників ризику, особливостей клінічного перебігу, деяких патогенетичних, біохімічних характеристик та прогностичних факторів (V. Nerurkar, 1989; J. Martin de las Mulas 2000; A. Dutra 2004). Однак, свідчення про частоту виникнення, патогенез, морфологію, діагностику, клінічний перебіг та лікування пухлин у собак розрізнені, часом недостатні або різнорідні, що утруднює вирішення ряду питань, зокрема, порівняльної онкології.

У значній мірі ці труднощі пов'язані із великою гістологічною та гістогенетичною своєрідністю як злоякісних, так і доброякісних новоутворень МЗ собак та, не в останню чергу, є наслідком групування пухлин МЗ за різними класифікаціями, які базуються на дещо різних критеріях (за першою (1974) та другою (1999) Міжнародними класифікаціями ВООЗ пухлин МЗ собак, за класифікацією ВООЗ пухлин МЗ людини, за неноменклатурними критеріями тощо). У світі існує лише декілька банків, що зберігають значну кількість зразків різних тканин, у т.ч. і пухлин МЗ, які отримані від собак, які різняться за породою, віком, регіоном та умовами проживання (Y. Richards, 2001). В Україні дослід-ження з вивчення різних аспектів новоутворень МЗ собак не проводились (винятком є лише одне - з цитологічної діагностики новоутворень МЗ собак (В. Чехун, А. Мазуркевич та ін., 2001)). В той же час визначення регіонарних особливостей розповсюдження та поведінки злоякісних пухлин у собак є цінним матеріалом для з'ясування не тільки певних питань канцерогенезу, але й для отримання даних щодо ролі у цих процесах багатьох чинників довкілля, що забруднено внаслідок техногенної діяльності людини. У цьому плані вони мають і загально-біологічний інтерес, так як показано, що процеси, які визначають географічне накопичення випадків неоплазм у людини та собак, до певної міри різні і не завжди залежать один від одного (D.O'Brien, 2000). В останні роки все більше дослідників приходять також до висновку про неоднорідність процесів розвитку карцином, зокрема карцином МЗ, у різних видів тварин (D. Waters, 1998).

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у рамках теми «Патоморфологічні особливості та характеристика структурного стану ДНК злоякісних пухлин молочних залоз дрібних тварин» кафедри патологічної анатомії Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продуктів АПК Національного аграрного університету (№ державної реєстрації 0103U005852).

Мета і задачі досліджень. На основі патоморфологічних досліджень вивчити частоту діагностування, морфологічні, патогенетичні, клінічні, анамнестичні та прогностичні особливості різних гістологічних типів новоутворень МЗ собак м. Києва.

Для досягнення мети вважали за доцільне вирішення наступних завдань:

1. Визначити гістологічні типи новоутворень МЗ собак за Міжнародною класифікацією ВООЗ пухлин МЗ собак та частоту випадків різних типів новоутворень у випадково сформованій вибірці.

2. Провести порівняльний аналіз між гістологічними діагнозами, що визначаються за класифікаціями ВООЗ пухлин МЗ собак та людини.

3. Провести цито - та каріоморфометричні дослідження і на їх основі встановити особливості плейоморфізму клітин та їх ядер у різних гістологічних типах доброякісних та злоякісних новоутворень МЗ собак.

4. Дати гістохімічну характеристику змінам вмісту ДНК у ядрах клітин новоутворень МЗ собак.

5. Оцінити значення анамнестичних факторів як чинників ризику виникнення новоутворень МЗ та порівняти їх щодо різних гістологічних типів неоплазм.

6. Дослідити інтенсивність заключної стадії апоптичної загибелі клітин МЗ та її новоутворень.

7. Визначити термін виживання собак у післяопераційний період та можливе прогностичне значення ряду параметрів, що характеризують новоутворення МЗ.

Об`єкт дослідження: новоутворення МЗ собак.

Предмет дослідження: частота ураження, анамнестичні чинники, клінічні, макро - та мікроскопічні характеристики, особливості загибелі пухлинних клітин доброякісних і злоякісних новоутворень МЗ різних гістологічних типів.

Методи досліджень: патоморфологічні, гістохімічні, морфометричні, клінічні, біохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведені патоморфологічні дослідження новоутворень МЗ у собак, що проживають в умовах великого промислового міста, на основі яких вперше в Україні визначені якісний та кількісний спектри гістологічних типів новоутворень МЗ залоз собак, дана морфологічна характеристика плейоморфізму епітеліальних клітин та їх ядер, одержані дані щодо особливості вмісту ДНК в ядрах та інтенсивності загибелі клітин різних новоутворень МЗ. Порівняльний аналіз між гістологічними діагнозами, що визначаються за класифікаціями ВООЗ пухлин МЗ собак та людини, показав, що адекватна класифікація новоутворень МЗ повинна поряд із типовими гістологічними характеристиками враховувати як джерела специфічних типів пухлинних клітин (епітеліальні, міоепітеліальні, клітини сполучної тканини тощо), що лежить в основі сучасного варіанту класифікації пухлин МЗ собак, так і локалізацію первинного ураження (протоки чи часточки), а також інфільтративні властивості пухлин, що є основними принципами класифікації пухлин МЗ людини. Встановлені відмінності у часі виникнення та швидкості розвитку доброякісних та злоякісних новоутворень МЗ, їх локалізації, розмірів та значення атипової гіперплазії у розвитку останніх, що дозволило виявити ряд прогностичних факторів. Висловлена думка, що ризик виникнення новоутворень МЗ збільшується із кожним випадком фізіологічної та, особливо, патологічної естрогенної стимуляції епітелію МЗ.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють та поглиблюють сучасні знання про етіологію та патогенез різних за гістоструктурою новоутворень МЗ собак. Вони можуть бути корисними при розробці нових методів профілактики та діагностики захворювання, для удосконалення сучасної класифікації пухлин МЗ собак, для формування спецкурсів для студентів ветеринарних спеціальностей, а також у разі створення в Україні реєстру випадків та банку даних з ветеринарної онкології.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є повністю самостій-ною працею авторки, яка реалізувала початкову ідею наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Одержані положення дисертаційної роботи доповідалися і обговорювалися на: Третій науковій конференції про-фесорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК (Київ, 3-4 березня 2004 р.); Міжнародній науковій конференції «Актуальні проблеми розвитку тваринництва, ветеринарної медицини, харчових технологій, економіки та освіти», присвяченій 220-річчю Львівської національної академії ветеринарної медици-ни ім. С.З. Гжицького (Львів, 25-26 листопада 2004 р.); Міжнародній науково-практичній конференції «Ветеринарна медицина-2005: сучасний стан та акту-альні проблеми забеспечення ветеринарного благополуччя тваринництва», присвяченій 90-й річниці з дня народження академіка І.М. Гладенка (Ялта, 30 травня -4 червня 2005 р.); спільному засіданні кафедр: патологічної анатомії; гістології, цитології та ембріології; анатомії с.-г. тварин ім. акад. В.Г. Касьяненка; патофізіології та імунології тварин; акушерства, гінекології та біотехніки відтворення тварин Національного аграрного університету (Київ, 30 червня 2005 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у 8 статтях, з них 7 - у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, зокрема, у науково-виробничому щомісячнику Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України «Ветеринарна медицина Ук-раїни» (4), Науковому віснику Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького (1), Міжвідомчому тематичному науковому збірнику «Сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва» (1), журналі «Доповіді Національної академії наук України» (1); у тезах доповідей наукової конференції (1).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу та методів дослід-жень, розділу результатів власних досліджень, розділу, де аналізуються одержані дані, висновків, рекомендацій виробництву та списку використаних першоджерел. Основний текст дисертації складає 133 (загальний - 187) сторінки, робота ілюстрована 51 рисунком, серед яких 36 мікрофотографій, та 35 таблицями. Перелік посилань включає 184 найменувань (з них кирилицею - 55).

Основний зміст роботи

новоутворення молочний собака залоза

Матеріал, клінічне обстеження та оперативне втручання. Матеріал для досліджень був отриманий під час планових операцій з приводу видалення новоутворень МЗ собак. Прооперовано 69 собак. Після проведення патомор-фологічних досліджень попередній діагноз «новоутворення МЗ» був підтверджений у 63 випадках (91%). Інші випадки були представлені пухлинами шкіри та непухлинними утвореннями МЗ. У групу порівняння (контроль) було включено тканину МЗ від 8 собак, які із різних причин були вибраковані у Київському притулку для тварин (с. Баришівка). При огляді патології МЗ у цих тварин виявлено не було. Під час збору анамнезу фіксували час появи перших ознак новоутворення, чинники, що передували його появі, локалізацію та зовнішній вигляд. Звертали особливу увагу на дані, які могли вказувати на порушення гормонального статусу (періодичність циклу, характер проходження тічки, наявність випадків псевдовагітності та її характер, кількість родів за життя, характер лактації). У заключний період досліджень збирали дані про подальшу долю прооперованих собак, фіксуючи стан здоров'я, наявність рецидивів, причини загибелі, дату смерті чи евтаназії.

Методи досліджень. Виготовлення гістологічних препаратів. Матеріал фіксували у розчині 10% нейтрального формаліну, заливали у парафін із наступним виготовленням гістозрізів товщиною 2 мкм, фарбували гематоксиліном Караці та еозином, а також проводили реакцію Фельгена за загальноприйнятими схемами (З. Лилли, 1969). Ступень злоякісності карцином визначали за існуючою гістологічною системою атестації епітеліальних пухлин МЗ (W. Mis-dorp, 2002). Морфометричні дослідження проводили при збільшенні 800 за допомогою обробки серійних напівтонких зрізів на системі аналізу зображень «IBAS-200» фірми «Kontron» (Німеччина), яка включала світлооптичний мікроскоп, кольорову відеокамеру та комп'ютер. Границі клітин та їх ядер виділяли вручну за допомогою «миші» при контролі процесу на моніторі. Морфометричні характеристики отримували використовуючи програмне забезпечення фірми (Kontron bildanalyse, 1986). У кожному препараті залежно від якості та об'-єму матеріалу аналізували від 20 до 50 клітин. Крім того, будували гістограми кількісного розподілу клітин та ядер за величиною їх площі. Інтенсивність насиченості кольору ядер при фарбуванні ДНК за Фельгеном визначали за допомогою комп'ютерної програми Adode Photoshop 5.0 на сканованих фотографіях гістологічних препаратів та виражали у відсотках від інтенсивності чистого кольору. На кожному препараті аналізували випадкову вибірку з 50 ядер. Значення анамнестичних чинників ризику виникнення новоутворень МЗ, а також їх макрохарактеристик, що носять якісний характер, аналізували за допомогою методу ранжирування. Визначення концентрації низько - та високомолекулярної ДНК проводили застосовуючи реакцію із дифеніламіном (К. Бартон, 1970) після лізису клітин (О. Капралов, 2001). Чисту ДНК виділяли при осадженні її етанолом із тканинних екстрактів, що очищені хлороформом (В. Пушкарьов 2005). Після електрофоретичного розділення низькомолекулярних фрагментів ДНК їх аналіз проводили на сканованих цифрових електрофореграмах, використовуючи комп'ютерну програму «Photo Capt Mw». Статистичну обробку результатів здійснювали із використанням критерію t Стьюдента та непараметричного критерію U Вілкоксона-Манна-Уітні. У тому разі, коли дані були виражені у відсотках, застосовано метод аналізу долі варіант (В. Урбах, 1972). Зв'язок між показниками оцінювали за коефіцієнтом кореляції рангів, при порівнянні останніх застосовували перетворення Фішера (Е. Гублер, 1973).

Патоморфологічні характеристики та частота випадків різних гістологічних типів злоякісних та доброякісних новоутворень МЗ залози собак. Серед 63 зразків новоутворень МЗ собак, що були досліджені у роботі, злоякісні визначено у 51-му, а доброякісні - у 12-ти випадках. Співвідношення між доброякісними та злоякісними новоутвореннями склало 1:4,25. Найбільшу частку серед усіх злоякісних пухлин МЗ собак у вибірці склали прості карциноми і їх підтип - солідні карциноми (62,5±25,6% від кількості простих карцином, Р<0,05) (табл. 1). На другому місці за кількістю діагностованих у наших дослідженнях виявилися карциносаркоми, на третьому - саркоми та неінфільтруючі (in situ) карциноми. Половину від усіх доброякісних новоутворень склали дисплазії, а серед доброякісних пухлин переважали фіброаденоми.

Порівняльний аналіз та співставлення гістологічних діагнозів, що були виставлені за класифікаціями пухлин МЗ людини та собак засвідчив той факт, що пухлини, які мають первинну локалізацію пухлинного процесу у часточках, за класифікацією пухлин МЗ собак є найбільш однорідною групою: пухлини часточкового раку in situ переважно відповідали неінфільтруючій (in situ) карциномі, а пухлини часточкового інфільтруючого раку - виключно складним та простим карциномам, які мають певну тенденцію до інфільтрації в оточуючі тканини та судини. Група зразків протокового та внутрішньопротокового раку виявилася за класифікацією пухлин МЗ собак більш різнорідною: поряд із карциномами in situ та простими карциномами, діагностували також такі пухлини як карциносаркоми, саркоми та карциноми / саркоми у доброякісній пухлині.

Таблиця 1. Кількісний розподіл (%) за гістологічними типами пухлин молочних залоз собак дослідженої вибірки (M±m)

Найбільш складною виявилася група раку із метаплазією: одночасно із простими та складними карциномами, веріфікували також саркоми, карциносаркоми, карциноми спеціальних типів та карциному у доброякісній пухлині. Отже, порівняння гістологічних діагнозів, які були виставлені за класифікаціями пухлин МЗ людини та собак, свідчить: адекватна класифікація новоутворень МЗ повинна поряд із типовими гістологічними характеристиками враховувати також не тільки джерела специфічних типів пухлинних клітин (епітеліальні, міоепітеліальні, клітини сполучної тканини тощо), що лежить в основі сучасного варіанту класифікації, але і локалізацію первинного ураження (протоки чи часточки), а також інфільтративні властивостій пухлин, що є принципами визначення пухлин МЗ у людини. Думка про необхідність враховувати ці фактори дискутується у літературі (S. Benjamin et al., 2001). Подальші дослідження з цього питання необхідні і можуть привести до оформлення більш повної та адекватної класифікації пухлин МЗ собак.

Проведені морфометричні дослідження свідчать про неоднакові за характером зміни розмірів та форми клітин і їх ядер у злоякісних пухлинах різних гістологічних типів (табл. 2). Для усіх карцином (за винятком веретеноклітинної) було характерним збільшення розмірів ядер. Одночасно збільшеною виявилася і площа клітин неінфільтративної (in situ), солідної та анапластичної карцином, але зменшеною - площа клітин карцином, що локалізувалися в аденомах. У складних та тубулопапілярних карциномах розміри клітин залишалися у межах норми. Площа ядер клітин сарком та карциносарком також була збільшеною, проте, у саркомах, які локалізувалися в аденомі, - меншою, ніж у нормі. Розмір клітин при цьому був збільшеним у фібросаркомах і карциносаркомах і зменшеним у хондросаркомах та саркомах в аденомі. Цікаво, що подібні за характером зміни спостерігали і у змішаній доброякісній пухлині та за дисплазії, тоді як в аденомі розміри клітин та ядер, а у фіброаденомі тільки клітин були меншими, ніж у нормі.

Важливим для характеристики плейоморфізму клітин та їх ядер вважають параметри, що характеризують їх форму. Аналізуючи фактор форми (F=4рS/P²) встановлено, що епітеліальні клітини неінфільтративної (in situ), тубулопапілярної, веретеноклітинної карцином, хондросарком, карциноми або саркоми в аденомі, аденоми і фіброаденоми приймали форму, що була більш наближеною до правильної форми еліпсу, ніж епітеліальні клітини нормальної МЗ. В той же час, ядра епітеліальних клітин складної карциноми, фібросаркоми, карциносаркоми та карциноми або саркоми у доброякісній пухлині набували форми, що, навпроти, була більш віддаленою від правильної форми еліпсу. Цікаво, що це спостерігали і за дисплазії. На відміну від зазначеного, ядра анапластичної карциноми мали більш правильну форму. У всіх новоутвореннях МЗ собак спостерігали збільшену кількість внутрішньоядерних включень, що характеризує гіперхроматоз, який є характерним для злоякісної трансформації. Проте, серед новоутворень МЗ собак найбільша кількість таких включень відмічена нами у разі доброякісної фіброаденоми. Отже, результати проведених досліджень свідчать, що для новоутворень МЗ собак характерним є значний плейоморфізм епітеліальних пухлинних клітин. Залежно від гістологічного типу вони значно різ-няться між собою за формою та величиною клітинного тіла і ядра, вмістом хро-матину в останньому, співвідношенням між площею цитоплазми та ядра. В той же час, зустрічаються пухлини, де епітеліальні клітини, хоча і є атиповими, але за перерахованими параметрами більш чи менш однорідні.

Вивчення кількісного розподілу популяцій епітеліальних клітин залежно від їх розмірів та величини їх ядер дає можливість охарактеризувати ступінь їх плейоморфізму. З'ясовано, що для ядер пухлинних клітин плейоморфізм проявлявся більше, ніж для власне популяцій клітин. При цьому спостерігали значний перерозподіл між популяціями епітеліальних клітин із ядрами типових розмірів та клітин із ядрами, розміри яких або не спостерігаються у нормі зовсім, або у кількісному відношенні складали невелику частку. Так, в усіх карциномах (за винятком веретеноклітинної) мало місце зменшення популяції клітин із ядрами розміром 30-40 мкм², які найбільш поширені у нормальній тканині МЗ собак, та залежно від типу карциноми, збільшення кількості клітин із ядрами більшого розміру: 50-70 мкм² (тубулопапілярна), 50-80 мкм² (складна), 50-90 мкм² (неінфільтративна (in situ)), 50-100 мкм² (солідна). Крім того, в останній підвищена кількість клітин із маленькими ядрами (10-20 мкм²).

Таблиця 2. Цито - та каріометричні характеристики епітеліальних клітин злоякісних пухлин молочних залоз собак (M±m)

У плоскоклітинній карциномі при цьому була рівномірно збільшена частка клітин із ядрами різного розміру, а в анапластичній карциномі спектр зрушень був значно більшим: зменшена кількість клітин із ядрами 20-50 мкм² та рівномірно збільшена кількість клітин із ядрами великих та дуже великих розмірів, що ніколи не зустрічалися у нормі (60-180 мкм²). Подібно до більшості карцином у карциносаркомах та саркомах поряд зі зменшенням популяції клітин із ядрами найпоширеніших розмірів (30-40 мкм²), збільшена кількість клітин із ядрами площею 50-60 мкм² (хондросаркома), 60-70 мкм² (фібросаркома), 50-90 мкм² (карциносаркома). В той же час у карциномі, що локалізувалася в адено-мі, суттєвого перерозподілу популяцій клітин із ядрами різних розмірів не від-мічено, а у саркомі в аденомі зменшена кількість клітин із ядрами іншого поши-реного у нормі розміру - 40-50 мкм² та підвищена кількість клітин із більш дрібними ядрами (20-30 мкм²). Подібне має місце і у разі доброякісної фібро-аденоми (зменшення клітин із ядрами 30-40 мкм² та збільшення із ядрами 20-30 мкм²). В аденомі зрушення спектру клітин відбувалося в сторону клітин із дріб-ними ядрами, у змішаній доброякісній пухлині перерозподіл різних популяцій клітин був несуттєвим, а за дисплазії спостерігали значно широкий діапазон, ніж у нормі, різних популяцій клітин (10-110 мкм²). Отже, найбільш суттєвий плейоморфізм ядер та клітин мав місце за умов анапластичної та солідної карцином, тоді як для доброякісних пухлини та злоякісних, які локалізувалися у доброякісних, була характерна наявність більш однорідних за розміром популяцій клітин маленьких та середніх розмірів.

Вважають, що у діагностичному плані поряд із визначенням змін розмірів клітин та їх ядер найбільш інформативними є дані про вміст в останніх генетичного матеріалу - ДНК. Оцінка вмісту ДНК у ядрах (плоїдність ядер) застосовується у медиціні для верифікації стадій інтраепітеліальної неоплазії, коли з'являються клітини із новими біологічними властивостями (Г. Автандилов, 2001). Визначенню плоїдності ядер клітин новоутворень МЗ собак присвячена значно менша кількість робіт, результати яких у певній мірі різняться (Е. Hel-lmen, 1993; Е. Destexhe, 1995). Проведені дослідження показали, що кількість ДНК у ядрах клітин неінфільтративної (in situ), складної, простої карцином та карцином спеціальних типів була збільшеною (на 21%, 49%, 51% та 18% відповідно) порівняно із вмістом її у ядрах клітин нормальної тканини МЗ собак. Серед простих карцином найбільший вміст ДНК у ядрах клітин спостерігали у анапластичній, а найменший - у тубулопапілярній карциномі (підвищення склало 30%, 54% та 80% відповідно у тубулярній, солідній та анапластичній). Підвищений рівень ДНК у ядрах клітин відмічено у веретеноклітинній карциномі (на 29%), у плоскоклітинній карциномі вміст ДНК у ядрах клітин був співставимим із нормальним рівнем. Вміст ДНК у ядрах клітин сарком був також дещо більшим, ніж у ядрах клітин нормальної тканини МЗ (на 16%). Значно у більшій мірі підвищений рівень ДНК у ядрах мав місце у клітинах карциносарком (на 56%) та карцином або сарком у доброякісній пухлині (на 64%). У ядрах клітин доброякісних пухлин і та у разі дисплазії вміст ДНК був збільшеним в однаковій мірі (на 36% та 32%).

Підвищений вміст ДНК в ядрах клітин доброякісних та злоякісних новоут-ворень МЗ собак підтверджує факт накопичення ДНК в ядрах у разі трансформації клітин. Нестабільність профілю ДНК у ядрах клітин карцином та доброякісних змішаних пухлин МЗ собак була показана за застосування проточної цитометрії та при дослідженні хромосом: від третини до половини злоякісних новоутворень МЗ собак були анеуплоїдними. Ця особливість у вмісті ДНК в ядрах відмічена лише у п'ятій частині доброякісних пухлин, що розцінюється як показник їх потенціальної малігнізації (Е. Destexhe, 1995; М. Perez Alenza 1995). У наших дослідженнях серед карцином найменший рівень підвищення ДНК в ядрах клітин був у неінфільтративній (in situ) карциномі, яка є найменш злоякісною, а найвища - у низькодиференційованій анапластичній карциномі, яка характеризується значним метастатичним потенціалом. Одержані дані вкладаються в уявлення, що підвищення темпів накопичення ДНК у ядрах характерно для більш біологічно активних пухлин (В. Лобода 1980). Звертає на себе увагу, що серед простих карцином найменш значне підвищення вмісту ДНК в ядрах мало місце у клітинах тубулопапілярної карциноми. Це, до певної міри, відповідає даним літератури про те, що у тубулярних типах карцином МЗ собак індекс проліферації менший, ніж у солідних, а також, що вміст ДНК у ядрах їх клітин відповідає диплоїдному рівню (Е. Destexhe, 1995; Y. Funakoshi, 2000).

Співставлення розміру ядер пухлинних клітин та вмісту у них ДНК показало, що спостерігався певний паралелізм у збільшенні розмірів ядер неінфільтративної (in situ), складної та простої карцином, а також карциносарком та інтенсивністю накопичення в них ДНК. Наявність високої плодії у сполученні із вираженою гетерогенністю клітинних популяцій вважають прогностично несприятливим фактором (В. Лобода, 1980). В той же час, у саркомах, карциномах спеціальних типів та у разі карцином або сарком у доброякісних пухлинах такого чіткого зв'язку не виявлено. Відмічають, що у деяких пухлинах має місце внутрішньопухлинна плодія, яка не залежить від гістологічної гетерогенності ядер (М. Perez Alenza, 1995).

У наших дослідженнях в ядрах клітин доброякісних пухлин та при дисплазії рівень ДНК був вищим, ніж у нормі. Це вказує на певний потенціал цих новоутворень до малігнізації; був підвищеним також і розмір їх ядер. Слід зазначити, що рівень ДНК у ядрах за умов дисплазії та у клітинах неінфільтративної (in situ) карциноми близькі, що може свідчити про нечітку онкологічну межу між цими гістологічними станами епітелію.

Клінічні та анамнестичні характеристики новоутворень МЗ собак. Серед тварин загальної групи більшу частку склали породисті собаки. Зважаючи на дані літератури та результати цього дослідження, можна припустити, що собаки таких порід як спанієлі, пуделі, німецькі вівчарки, пінчери, фокс - та ердель-тер'єри, певно, мають підвищену схильність до розвитку злоякісних новоутворень МЗ. У той же час для остаточного висновку про схильність тієї чи іншої породи собак до виникнення новоутворень МЗ необхідно мати дані не тільки про захворюваність, але і про кількість собак цих порід у даному регіоні.

Середній вік хворих собак як зі злоякісними, так і доброякісними новоутвореннями коливався біля 10 років, він суттєво не різнився для тварин із різними гістологічними типами злоякісних пухлин МЗ. Проте, собаки у яких діагностували дисплазію, були у середньому на 3 роки молодшими (8,5±0,76 роки) за тварин із доброякісними (11,3±0,66 роки) і на півтора роки молодшими, ніж собаки зі злоякісними пухлинами (10,1±0,28 роки). Така ж закономірність була виявлена і для віку собак, у якому реєстрували появу перших ознак захворювання. Найбільший час, який пройшов між останнім та зверненням у клініку, відмічено для собак зі складною карциномою (3,40±0,91 років) порівняно із іншими типами карцином (0,60-1,13 років), а також саркомами (1,21±0,27 років), карциносаркомами (0,68±0,16 років) та карциномами або саркомами у доброякісній пухлині (0,92±0,31 років). Найбільш швидко (0,29±0,04 років) хвороба розвивалася за умов анапластичної карциноми.

Найчастіше карциноми та карциносаркоми локалізувалися у 4-5-й парах ((65,5±10,1)%), рідше - у 3-й ((25,3±9,2)%) та значно рідше - у 1-2-й парах ((9,2±6,1)%) МЗ, в той час як у тварин, що були обстежені у роботі, не спостерігали ураження перших двох пар МЗ саркомами, а також карциномами або сар-комами, що локалізувалися у доброякісній пухлині. Доброякісні новоутворення із рівномірною частотою уражали усі пакети МЗ собак. Лише 9% пухлин не мали капсули, причому повна чи часткова капсула значно рідше виявлялась у разі карцином (1,30±0,12 балів), ніж сарком (1,86±0,14 балів, P_t<0,05). Найменший показник інкапсуляції пухлин був виявлений для карцином спеціальних типів та неінфільтруючої (in situ) карциноми.

Об'єм злоякісних новоутворень МЗ собак у 5 разів перевищував такий доброякісних. Серед перших найбільш великі пухлини належали саркомам (1743,4± 905,7см³), а найменші - карциномам або саркомам у доброякісній пухлині (72,3±55,5 см³). Об'єм карцином спеціальних типів був найбільшим серед усіх карцином (1146,7±429,1 см³), а серед різних підтипів простої карциноми найменшими виявилися пухлини тубулопапілярної (130,8±119,8 см³), а найбільшими - пухлини солідної будови (362,4±134,2 см³, P_U<0,05). Корелятивний аналіз не виявив зв'язку між розмірами новоутворень та тривалістю хвороби.

Для людини та щурів добре відомо значення вагітності та післяродової лактації як превентивних факторів щодо ризику виникнення новоутворень МЗ (S. Nandi, 1995). Для собак роблять досить категоричий висновок, що невелика кількість або відсутність родів за життя тварини підвищує ризик виникнення новоутворень МЗ (В. Пономарьков, 1972; И. Домосканова, 2000; Н. Горман, 2003). Аналіз результатів наших досліджень виявив, на перший погляд, парадоксальний факт, а саме: тварини із доброякісними новоутвореннями мали у 2 рази меншу кількість родів, ніж ті, у яких верифікували злоякісні пухлини МЗ. Для собак із доброякісними новоутвореннями час, який пройшов з останніх родів до появи перших ознак захворювання, виявився більшим, ніж для тварин зі злоякісними пухлинами. Середня кількість випадків порушення еструсу та лактації у собак із доброякісними новоутвореннями була значно меншою, ніж у собак зі злоякісними пухлинами (табл. 3). Особливо чітко це спостерігали у групі собак із доброякісними пухлинами, в анамнезі таких собак зовсім не було випадків псевдовагітності. Одержані дані підтверджують висновок, що постдієстральний синдром має значення як чинник ризику виникнення саме злоякісних пухлин.

Підсумування усіх випадків вагітності та родів за життя, а також псевдовагітності із урахуванням її характеру (із лактацією чи ні) та порівняння цього показника у тварин зі злоякісними і доброякісними новоутвореннями показало, що «навантаження» на МЗ при житті собак із доброякісними пухлинами було у 2 рази меншим, ніж у собак зі злоякісними (табл. 3). Це не спостерігалося у собак із дисплазією МЗ. Зважаючи на те, що ризик виникнення новоутворень МЗ після двох еструсних циклів підвищується у сотні разів (W. Misdorp, 2002; H. Горман, 2003), на те, що новоутворення МЗ реєструються навіть на 1-му році життя тварин (М. Kessler, 1997), а також на дані, які були отримані у цьому дослідженні, можна зробити висновок, що ризик виникнення новоутворень МЗ, особливо злоякісних, збільшується із кожним випадком естрогенної стимуляції епітелію МЗ (еструс, вагітність, лактація, лактація за псевдовагітності).

Аналіз ролі чинників репродуктивного анамнезу у виникненні злоякісних пухлин різного гістологічного типу виявив певні особливості. Кількість родів у собак із складною карциномою була найменшою (0,33±0,33 балів), а у разі простої тубулопапілярної карциноми - найбільшою (2,00±0,40 балів). Найбільший час, що пройшов після останніх родів і до появи перших ознак захворювання, спостерігали за умов анапластичної карциноми (5,70±0,7 5 років), а найменший - за карциносарком (2,73±1,10 років). Порівняння кількості випадків порушення еструсу та лактації у собак із різними гістологічними типами злоякісних пухлин засвідчило, що у собак із складною карциномою МЗ, таких випадків не зафіксовано зовсім, а найбільша кількість випадків порушення еструсу та лактації мала місце у собак із анапластичною карциномою. Сумарна величина «навантаження» на МЗ собак із різними гістологічними типами злоякісних пухлин була однаковою, за винятком складної карциноми, при якій цей параметр виявився значно нижчим (табл. 3).

Таким чином, для собак із складною карциномою МЗ, було характерним більш раннє діагностування перших ознак патології. В той же час, захворювання у них порівняно із собаками з іншими типами злоякісних пухлин, мало більш повільний розвиток, а в анамнезі зареєстрована значно менша кількість родів та відсутність ярко виражених симптомів порушення еструсу та лактації. Останнє найбільш часто спостерігали у собак із анапластичною карциномою. Ці тварини рідше народжували, хвороба у них розвивалася дуже швидко, а зважаючи, що перші її симптоми виявлялися через більш тривалий час після родів, ніж в інших тварин, ведучим тут можна вважати саме порушення гормональних

Таблиця 3. Кількість випадків порушення еструсу та лактації, а також випадків «навантаження» на молочні залози у собак із їх новоутвореннями (M±m)

механізмів. Собаки із тубулопапілярною карциномою мали найбільшу кількість родів порівняно із тваринами з іншими типами злоякісних пухлин, проте, кількість випадків порушення гормонального статусу була невеликою. До певної міри ці дані підтверджують припущення про роль кількості вагітностей і родів, а також кількості випадків та характеру порушень еструсу і лактації як чинників, що підвищують ризик виникнення злоякісних новоутворень МЗ у собак. Одночасно, ці факти свідчать й про більш складний механізм впливу цих чинників на частоту виникнення злоякісних пухлин МЗ собак. Варто зазначить, що у кішок, які зазвичай мають за життя значну кількість родів, пухлини МЗ є практично на 100% злоякісними (W. Misdorp, 2002).

При співставлені параметрів пухлин, які супроводжувала гіперплазія, та пухлин, для яких ознаки її не були виявлені, з'ясовано, що перші мали менший розмір (186,6±59,1 см³) та розвивалися повільніше (1,51±0,23 років), ніж ті, що не мали ознак супровіду гіперплазії (відповідно 704,2±240,2 см³ та 0,98±0,12 років). Можна припустити, що частина злоякісних пухлин дійсно розвивається на фоні дисгормональної дисплазії. За іншими параметрами ці групи пухлин не відрізнялися.

Фрагментація ДНК у клітинах МЗ та їх новоутворень. Одним із шляхів збільшення клонів пухлинних клітин та важливою їх властивістю є послаблення в них механізмів апоптозу, що різко підвищує життєздатність неопластичної клітини та робить її менш чутливою до факторів протипухлинного імунітету. При дослідженні інтенсивності кінцевого етапу апоптичної загибелі клітин, а саме фрагментації ДНК, було з'ясовано, що відсоток низькомолекулярної ДНК був зменшеним у клітинах пухлин усіх групп, за винятком неінфільтруючої (in situ) карциноми. Співвідношення між вмістом високо - та низькомолекулярної ДНК у клітинах виявилося підвищеним, що свідчить про перевагу процесів проліферації над процесами деградації ДНК. Якщо групування пухлин проводили за їх властивістю до інфільтрації, то зміни вмісту низькомолекулярної ДНК відбувалися переважно у клітинах пухлин, які відносять до інфільтруючих раків (протоковий, часточковий, рак із метаплазією). Співвідношення між високо - та низькомолекулярною ДНК також більш суттєво було змінено у клітинах пухлин інфільтруючих раків, особливо протокового, тоді як зрушення між рівнем різних фракцій ДНК у клітинах часточкового раку in situ виявилися найменшими.

Зменшення долі фрагментованої ДНК у клітинах злоякісних пухлин МЗ собак може свідчити про зниження інтенсивності загибелі трансформованих клітин. У проведених дослідженнях найбільш виразно це спостерігалося для пухлин інфільтруючих раків порівняно із неінфільтруючими, а також для сарком та карцином спеціальних типів. Результати розділення ДНК методом електрофорезу засвідчили, що у клітинах нормальної тканини МЗ, як і у клі-тинах карцином частина клітин дійсно гине шляхом апоптозу, кількість їх в останніх зменшується.

Термін виживання собак із новоутвореннями молочних залоз різних гістологічних типів. Важливим для характеристики біологічної поведінки но-воутворень є визначення прогностичних факторів, що має важливе значення і у клінічній практиці. Найбільш прогностично несприятливими виявилися такі карциноми: спеціальних типів (час виживання - 2,04±1,28 міс), солідна (5,38±1,15 міс) та анапластична (8,10±3,10 міс). Крім того, серед анамнестичних та клінічних чинників несприятливими щодо виживання тварин у разі злоякісних пухлин є більший вік собак на момент операції (с=-0,25, P_t<0,05) чи на момент реєстрації перших ознак захворювання (с=-0,49, P_t<0,05) та розміри пухлин (с=-0,25, P_t<0,05), а у разі доброякісних - тривалість захворювання (с=-0,79, P_t<0,05).

Отже, проведені вперше в Україні дослідження щодо вивчення різних за гістологічним типом новоутворень МЗ собак, що живуть у несприятливих умовах великого, техногенно насиченого міста, дозволили отримати результати, які характеризують ряд анамнестичних чинників, що сприяють виникненню хвороби, складність та різноманітність гістологічної структури, морфологічної будови, біологічної активності новоутворень, їх макро - та клінічні характеристики, деякі механізми канцерогенезу, особливості прогнозу. Вважаємо доцільним створення реєстру випадків та банку даних неоплазм не тільки МЗ, але й новоутворень іншої локалізації, що дасть можливість із застосуванням новітніх методів проводити сучасні дослідження з ветеринарної онкології. Так як верифікація пухлин є складним, але вкрай важливим процесом у діагностиці захворювання, наш досвід підказує про необхідність створення в Україні Центру з діагностики пухлин тварин.

Висновки

1. Проведення патоморфологічних, гістохімічних, біохімічних та клінічних досліджень новоутворень МЗ собак, що живуть у несприятливих умовах великого, техногенно насиченого міста, дозволило вперше в Україні визначити кількісний та якісний спектр, морфологічні, клінічні, анамнестичні та прогностичні особливості різних гістологічних типів новоутворень МЗ собак.

2. У собак кількість злоякісних пухлин МЗ переважає доброякісні (4,25:1); найбільшу частку серед перших складають прості карциноми (31%), а серед них їх підтип - солідні (62%). Найчастіше злоякісні пухлини локалізуються у 4-5-х, значно рідше - 1-2-х парах МЗ, тоді як доброякісні новоутворення із рівномірною частотою уражають усі пакети МЗ собак.

3. Для злоякісних новоутворень МЗ собак характерний плейоморфізм клі-тин та їх ядер. Залежно від гістологічного типу вони значно різняться між собою за формою та величиною, вмістом хроматину у ядрах, ядерно-клітинним та ядерно-цитоплазматичним співвідношеннями. Найбільш виражений плейоморфізм клітин та ядер спостерігається в анапластичній та солідній карциномах, у доброякісних пухлинах та злоякісних пухлинах, які локалізуться у доброякісних, реєструються популяції невеликих однорідних за розміром клітин із дрібними ядрами.

4. У ядрах клітин усіх злоякісних (за винятком плоскоклітинної карцино-ми) та доброякісних новоутворень МЗ собак рівень ДНК у ядрах підвищено: у найменшій мірі у неінфільтративній (in situ), у найбільшій - в анапластичній карциномі. Відмічений певний паралелізм у збільшенні розмірів ядер клітин неінфільтративної (in situ), складної, простої карцином і карциносарком та вмістом у них ДНК; у саркомах, карциномах спеціальних типів та у разі карцином/ сарком у доброякісних пухлинах такого зв'язку не виявлено.

5. Середній вік хворих собак не різниться для тварин із різними гістологіч-ними типами злоякісних пухлин МЗ. Собаки, у яких діагностували дисплазію, були на 3 роки молодшими за тварин із доброякісними і на 1,5 роки молодшими, ніж собаки зі злоякісними пухлинами. Тривалість хвороби виявилася найбільшою у собак зі складною карциномою, найшвидше хвороба розвивалася за умов анапластичної та солідної карцином.

6. Об'єм злоякісних новоутворень МЗ собак у 5 разів перевищує такий доброякісних. Серед перших найбільш великі пухлини належать саркомам, а найменші - карциномам / саркомам у доброякісній пухлині. Злоякісні пухлини, які супроводжує дисплазія, мають значно менший розмір; захворювання у собак із такими пухлинами розвивається повільніше.

7. Порівняно із собаками зі злоякісними пухлинами, тварини із добро-якісними новоутвореннями мали за життя у 2 рази меншу кількість родів, значно меншу кількість випадків порушення еструсу та лактації; час, який пройшов з останніх родів до появи перших ознак захворювання, у них більший. Сумарна величина «навантаження» на МЗ собак із різними гістологічними типами злоякісних пухлин однакова, за винятком складної карциноми: для собак із такими пухлинами в анамнезі зареєстровано меншу кількість родів та відсутність випадків порушення еструсу та лактації.

8. Частка низькомолекулярної ДНК нижча в клітинах усіх злоякісних пухлин, за винятком неінфільтруючої (in situ) карциноми. При групуванні неоплазм за класифікацією пухлин МЗ людини співвідношення між високо - та низькомолекулярною ДНК більш суттєво змінено у пухлинах інфільтруючого протокового раку; зрушення найменші у клітинах часточкового раку in situ. У карциномах МЗ кількість клітин, які гинуть шляхом апоптозу, зменшена.

9. Несприятливими прогностичними чинниками для злоякісних пухлин МЗ є вік собак, а також розміри пухлин, а для доброякісних - тривалість захворю-вання. Гістологічний тип злоякісної пухлини є важливим для подальшого прогнозу: найбільш несприятливі у цьому плані веретеноклітинна, плоскоклітинна, солідна та анапластична карциноми.

Рекомендації виробництву

1. Рекомендуємо широке впровадження у практику клінік ветеринарної медицини проведення оваріектомії у ранньому віці собак (за винятком випадків, коли перед власником тварини стоїть питання розведення цінної породи), зважаючи на те, що ризик виникнення новоутворень МЗ збільшується із кожним випадком фізіологічної та, особливо, патологічної естрогенної стимуляції МЗ.

2. При подальшому удосконаленні класифікації новоутворень МЗ собак, а також при їх верифікації вважаємо за необхідне рекомендувати фахівцям вра-ховувати поряд із гістологічними характеристиками пухлини як наявність спе-цифічних (епітеліальні, міоепітеліальні, клітини сполучної тканини) типів тран-сформованих клітин, так і локалізацію первинного ураження (протоки чи часточки) та інфільтративні властивості пухлин.

3. Рекомендуємо Українській Академії аграрних наук та Держдепартаменту ветеринарної медицини Мінагрополітики України вирішити питання про створення Центру з діагностики пухлин тварин, реєстру випадків та банку даних неоплазм тварин різної локалізації, що є вкрай важливим для проведення сучасних досліджень у галузі ветеринарної онкології.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Потоцький М.К., Шувалова Н.І., Шестяєв А.Н. Патоморфологічна харак-теристика злоякісних пухлин собак // Ветеринарна медицина України. - 2003. - №2. - С. 27-28. (авторка провела гістологічні дослідження, підготувала статтю до друку.)

2. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. фіброзно-кістозна хвороба молочної залози собак // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. - 2004. - Т. 6, №3. - Ч. 2. - С. 79-85. (авторка провела гістологічні дослідження, підготувала статтю до друку.)

3. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. Новоутворення молочних залоз собак: фактори анамнезу, гістологічні типи і макроскопічні характеристики // Ветеринарна медицина України. - 2004. - №12. - С. 38-40. (авторка провела гістологічні дослідження, зібрала та проаналізувала дані анамнезу, провела статистичну обробку, підготувала статтю до друку).

4. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. Епітеліальні злоякісні пухлини молочної залози собак // Ветеринарна медицина України. - 2005. - №4. - С. 27-28. (авторка провела гістологічні дослідження, підготувала статтю до друку).

5. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. Порівняльний аналіз деяких характеристик злоякісних пухлин та дисплазії молочних залоз собак // Ветеринарна медицина: Міжнародний тематичний науковий збірник. - 2005. - №5. - С. 1132-1136. (авторка провела гістологічні дослідження, проаналізувала дані анамнезу, провела статистичну обробку, підготувала статтю до друку.)

6. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. фрагментація ДНК у тканинах новоутворень молочної залози собак // Доповіді НАН України. - 2005. - №6. - С. 172-175. (авторка визначила вміст ДНК, провела статистичну обробку даних, підготувала статтю до друку.)

7. Шестяєва Н.І. Потоцький М.К. Класифікація пухлин молочних залоз собак: складність та протиріччя // Ветеринарна медицина України. - 2005. - №8. - С. 26-28. (авторка проаналізувала дані літератури, а також результати власних досліджень, підготувала статтю до друку).

8. Потоцький М.К., Шестяєва Н.І. Морфологічна характеристика та вміст фрагментованої ДНК у тканинах новоутворень молочної залози собак // Тези доповіді lll конференції професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини, якості і безпеки продукції АПК. - Київ, 2004. - С. 79 - 80.

Размещено на Allbest.ru