Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут цукрових буряків

Української академії аграрних наук

УДК: 635.21:631.531/.535:632.38

Спеціальність: 06. 01.14 - насінництво

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Удосконалені методи оздоровлення картоплі від вірусів та використання отриманого матеріалу в первинному насінництві

Мацкевич В'ячеслав Вікторович

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії клонального мікророзмноження Інституту картоплярства УААН протягом 1998-2003 рр.

Науковий керівник - кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Різник Віктор Семенович, закрите акціонерне товариство "Крафт Фудз Україна", консультант з агрономічних питань.

Офіційні опоненти:

- доктор сільськогосподарських наук, професор, член-кореспондент УААН Гізбуллін Наіль Гайфулович, Інститут цукрових буряків УААН, головний науковий співробітник лабораторії насінництва та насіннєзнавства;

- кандидат сільськогосподарських наук Купріянов Володимир Петрович, виробничо-наукова асоціація "Чернігівкартопля", директор.

Провідна установа - Сумський національний аграрний університет, м. Суми.

Захист відбудеться ''___'' ____________ 2004 року о ___ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.360.01 при Інституті цукрових буряків УААН за адресою: 03141, м. Київ, вул. Клінічна 25.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту цукрових буряків УААН (другий корпус),

Автореферат розісланий "____" _____________ 2004 року

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради кандидат сільськогосподарських наук Сторожик Л.І.

Вступ

Актуальність теми. Основними умовами подальшого розвитку галузі картоплярства є забезпечення виробників якісним насіннєвим матеріалом.

Одним із методів одержання його є застосування культури меристеми і термотерапії. Незважаючи на широке практичне застосування в первинному насінництві картоплі, процес звільнення від вірусів і методи клонального мікророзмноження вихідного безвірусного насіннєвого матеріалу потребують більш глибокого вивчення та подальшого удосконалення. Недостатньою мірою вивчені такі аспекти проблеми оздоровлення культури, як: динаміка і характер накопичення вірусів в насіннєвому матеріалі, ефективність звільнення рослин від вірусної інфекції, реінфекція, вплив онтогенетичної різноякісності зон вихідної рослини на ріст, розвиток і продуктивність регенерантів. В значній мірі обмежується застосування біотехнологічних методів у первинному насінництві картоплі їх енергоємністю та високою собівартістю оздоровленого вихідного матеріалу.

Тому вивчення теоретичних основ елементів системи "рослина живитель - вірус патоген" та удосконалення методів технології оздоровлення у напрямах підвищення їх надійності та зниження витрат на виробництво вихідного матеріалу для первинного насінництва картоплі, є актуальною, і досить складною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана як складова частина тематичного плану лабораторії клонального мікророзмноження Інституту картоплярства УААН у 1998-2003 рр. за темою: "Удосконалити методи застосування культури тканини в процесі одержання оздоровленого матеріалу картоплі та визначити способи діагностики вірусних хвороб при його сертифікації" (Номер державної реєстрації 0197U005458).

Наукові дослідження за темою дисертації проводилися при виконанні завдання 02.01. "Розробити та удосконалити існуючі способи одержання та розмноження оздоровленого матеріалу картоплі" (Номер державної реєстрації 0197U00545).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала в вирішенні проблеми удосконалення методів оздоровлення та клонального мікророзмноження картоплі для підвищення надійності звільнення сортозразків від вірусної інфекції, збільшення коефіцієнта розмноження і покращення якості вихідного матеріалу при одночасному зниженні його собівартості.

Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

провести комплексну оцінку елементів технологічного процесу отримання і прискореного розмноження вільного від вірусів матеріалу картоплі, визначити напрями його удосконалення та здешевлення;

проаналізувати вплив сортових особливостей та різноякісності вихідного для оздоровлення матеріалу на характер взаємовідносин в системі рослина-господар - вірус-паразит та ефективність звільнення від вірусів;

встановити оптимальні репрезентативні об'єми вибірок в дослідженнях із картоплею в культурі in vitro стосовно визначення морфологічних показників при 95%, 99% рівнях значимості;

вивчити вплив онтогенетичної різноякісності зон вихідних рослин in vitro на ефективність регенерації;

удосконалити елементи прискореного розмноження оздоровленого матеріалу в напрямі ресурсозбереження.

Об'єкт дослідження - процеси оздоровлення картоплі від вірусної інфекції та прискореного розмноження безвірусного матеріалу в умовах in vitro.

Предмет дослідження - біотехнологічні методи оздоровлення та прискореного розмноження оздоровленого вихідного насіннєвого матеріалу картоплі.

Методи досліджень - лабораторні дослідження і аналізи, випробування у відкритому та закритому ґрунті. Ураженість вірусними хворобами визначали візуально а латентну вірусну інфекцію методом імуноферментного аналізу (ІФА). Концентрацію вірусних субодиниць визначали методом оптичної щільності вірусів в соку рослин. Урожайність картоплі визначали методом зважування. Отримані результати досліджень оброблялися статистичними методами.

Наукова новизна одержаних результатів. Обґрунтовано напрями удосконалення методів звільнення картоплі від вірусної інфекції та прискореного розмноження оздоровленого матеріалу.

Доведено ефективність застосування як альтернативного культурі меристем методу оздоровлення шляхом добору здорових рослин і культивуванні їх in vitro.

Вперше розроблено метод отримання темнових мікробульб для нових вітчизняних сортів: Косень-95, Тирас, Загадка, Повінь, Серпанок, Забава, Обрій, Слов'янка.

Встановлено відмінність в регенерації рослин in vitro картоплі залежно від різноякісності живців (апікальні, медіальні, базальні).

Встановлено ефективність застосування препарату ДГ-75 (похідна тетрагідротіофендіоксиду) при регенерації рослин in vitro картоплі.

Встановлено відсутність впливу різноякісності бульб картоплі за розміром на ефективність звільнення від вірусів методом культури меристем.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано застосування удосконалених методів оздоровлення та прискореного розмноження, що дає змогу підвищити надійність звільнення від вірусної інфекції, скоротити строки і зменшити затрати на виробництво оздоровленого вихідного матеріалу при відтворенні еліти картоплі.

Особистий внесок здобувача. Участь дисертанта полягає в розробці програми, проведенні польових та лабораторних дослідів, в отриманні експериментальних даних результатів досліджень, викладених у дисертації, їх аналізу та узагальнені. Наукові положення по темі дисертації отримані здобувачем особисто. Впровадження розробок у виробництво здійснено за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідалися на засіданнях методичної комісії, відділу насінництва та вченої Ради Інституту картоплярства УААН (щорічно протягом 1998-2003 рр.); на міжнародній конференції, присвяченій 90-річчю від заснування Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва УААН " Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва" (Харків, 1999), міжнародній конференції "Проблеми виробництва екологічно-чистої сільськогосподарської продукції" (Житомир, 2000).

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані в 8 наукових працях, в тому числі 5 у фахових виданнях згідно списку ВАК України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 178 сторінках машинописного тексту, містить 44 таблиці, 24 рисунки, 14 додатків. Текстова частина складається зі вступу, 6 розділів, висновків і пропозицій для первинного насінництва. Список використаних джерел містить 169 найменувань, в тому числі 41 іноземними мовами.

Зміст роботи

Звільнення рослин картоплі від вірусної інфекції та прискорене розмноження оздоровленого матеріалу (огляд літератури)

У розділі подано результати досліджень вітчизняних та зарубіжних вчених, стосовно особливості природи вірусної інфекції, її взаємовідносини в системі рослина живитель - патоген, методів звільнення від вірусів та прискореного розмноження оздоровленого матеріалу. На основі критичного аналізу окремих ланок технологічного процесу оздоровлення обґрунтована потреба і напрями його подальшого вивчення з метою удосконалення.

Умови, матеріал та методика виконання досліджень

Дослідження проводили в лабораторних та польових умовах, в закритому ґрунті, лабораторії клонального мікророзмноження Інституту картоплярства УААН протягом 1998-2003 рр.

Для визначення розподілу вірусів (М вірус картоплі, Y вірус картоплі та їх комплексу) відбирали та індексували рослини сортів Кобза, Світанок київський з урахуванням фракційного складу та зон бульби за схемою:

1. Варіант - верхівка бульби Ш 60 мм;

2. Варіант - середина бульби Ш 60 мм;

3. Варіант - пуповина бульби Ш 60 мм;

4. Варіант - верхівка бульби Ш 30-60 мм;

5. Варіант - пуповина бульби Ш 30-60 мм;

6. Варіант - верхівка бульби Ш < 30 мм.

Після проходження цими бульбами термотерапії протягом 25-30 днів із них, аналогічно схемі відбору індексів відділяли паростки. З чотирьох зон кожного паростка: апікальної, верхівкової, медіальної та базальної, ізолювали під бінокуляром меристеми розміром до 200 мікрон.

Порівняння методів оздоровлення проводились на сортах Світанок київський і Кобза за схемою:

1. Варіант - культура меристеми в поєднанні з термотерапією (контроль).

2. Варіант - добір здорових рослин діагностованих імуноферментним аналізом (ІФА) і введення їх у культуру in vitro пазуховими бруньками. 3. Варіант - добір здорових рослин із застосуванням діагностики методом ІФА і введення їх у культуру in vitro стебловими живцями.

Контроль на наявність вірусів у рослинах проводили методом імуноферментного аналізу (твердофазний "сандвіч метод"). Реагенти для цього аналізу використовували фірми BOEHRINGER MANNHEIM. Кількісне визначення вірусних субодиниць проводили на рідері Octeia при довжині хвилі = 490 нм.

Визначення розподілу вірусної інфекції по зонах рослин носіїв вірусів в умовах in vitro здійснювали шляхом культивуванням живців методом накладання на штучному живильному агаризованому середовищі при 8-годинному фотоперіоді. З пробіркових рослин протягом 10 пасажів відбирали живці 4 типів: 1 тип - перший зверху (верхівка); 2 тип - другий зверху; 3 тип - другий знизу; 4 тип - перший знизу. Після 1, 5 та 10 пасажів аналізували сік рослин на ІФА. Дослід проводили з рослинами сортів Пекуровська й Луговська, які були носіями М-вірусу картоплі (МВК) та рослинами-носіями SВК сортів Цезар, Діамант. Оздоровлені рослини in vitro цих сортів виступали як негативні стандарти.

Вплив різноякісності вихідних рослин in vitro на процес регенерації визначали живцюванням пробіркових рослин сортів Косень-95 та Слов'янка методом накладання до 10 пасажу і отриманням із них регенерантів за наступною схемою: 1. Варіант - апікальний, 2. Варіант - медіальний, 3. Варіант - базальний. На 21 день росту стебла вимірювали висоту стебла і повторно живцювали. Облікових рослин 30, повторність трьохразова.

В полі матеріал розміщували в насінницькій сівозміні в умовах ізоточки. Захист рослин від перезараження проводили шляхом обробки їх афіцидами (Конфідор - 0,25-0,3 кг/га та Актара - 0,3-0,4 кг/га) через 10-14 днів. Схема посадки 70*35 см. Повторність трикратна. В період вегетації проводили 3 міжрядних обробітки з підгортанням.

Репрезентативні вибірки рослин в дослідженнях з картоплею в культурі in vitro

При дослідженні мікроклонального розмноження картоплі виникає потреба у встановленні такої кількості рослин, яка б була достатньою для достовірної оцінки впливу фактора, оскільки мала кількість не дає точних результатів, а велика потребує зайвих витрат часу і матеріальних затрат, особливо при значній кількості варіантів. В літературі не зустрічається конкретних рекомендацій з цього приводу. Тому при встановленні найменшої репрезентативної вибірки для кількісних показників ми провели окремі дослідження та розрахунки за формулою Г.Н. Зайцева (М.: Наука, 1984):

,

де N - необхідний об'єм вибірки; - допустима погрішність визначення середньої арифметичної (в нашому випадку 1 мм); t - критерій достовірності Стьюдента (при Р0,95 t = 1,96, при Р0,99 t = 2,58); - середнє квадратичне відхилення; N0 - чисельність генеральної сукупності.

Досліджувались фактори, які обумовлювали зміну показників: консистенція середовища (рідке і агаризоване) та сорт (Косень-95 і Віринея). Для встановлення оптимального об'єму вибірки проводили статистичний аналіз основних показників і порівняння їх у різних за розміром вибірках.

Значення всіх ознак у дослідженні мало тенденцію групування навколо центру. Коефіцієнт варіації залежав від ознаки та віку рослин у досліді і в більшості випадків не перевищував 20 відсотків. Установили, що помилка досліду суттєво зменшувалася із збільшенням вибірки рослин від 10 до 20. В подальшому при зростанні об'єму вибірки помилка зменшувалася більш поступово, а починаючи зі 100 рослин і до 500 зменшення її зовсім неістотне.

Тому для більшості досліджень картоплі в культурі in vitro репрезентативним об'ємом вибірки є 20 рослин. При врахуванні кількість відхилень (інфекція, калюс, "вітрифікація" та ін., що не входять в облік, і не перевищують 5-7%) оптимальною на наш погляд кількістю є 30 рослин (вирощуваних у пробірках) на варіант при триразовій повторності в часі.

Ефективність звільнення картоплі від вірусної інфекції та оцінка вихідного матеріалу

Особливості накопичення вірусів в вихідному для оздоровлення матеріалі. Концентрація вірусної інфекції у бульбах різного фракційного складу. В зоні досліджень найбільш поширеними та шкодочинними були М та Y віруси картоплі. Вплив шкодочинності вірусної інфекції протягом 1998-2000 рр. на зниження маси бульб у кущі рослини картоплі при ураженні залежав від виду вірусу та особливостей сорту. Найбільший недобір урожаю відмічено при комплексному ураженні М та Y вірусами (по сортах: Світанок київський 75,7%, Кобза 57,1%)

Для встановлення доцільності добору матеріалу за фракційним складом та зонами бульби при оздоровленні від вище вказаних вірусів, відібрані в полі покущево бульби від хворих (за даними ІФА) рослин проіндексували.

В проіндексованому матеріалі встановлено, що накопичення інфекції залежить від сорту. Так, бульби сорту Світанок київський порівняно із сортом Кобза, не залежно від розміру, містять в соку паростків меншу концентрацію вірусів. Оптична щільність соку з паростків бульб рослин-носіїв YВК сорту Світанок Київський становила від 0,316 до 0,423 оптичних одиниць, при оптичній щільності рослин сорту Кобза від 0,576 до 0,624 оптичних одиниць. Ця закономірність зберігається і у випадку з МВК. Комплексне ураження призводить до зниження концентрації вірусів по окремо взятих вірусах.

Аналіз оптичної концентрації вірусів в соку ростків взятих з індексів не встановив закономірність у розподілі інфекції залежно від різноякісності бульб і не виявлено в межах окремо взятої бульби зони вільної від патогенів. У зв'язку з цим, при активному оздоровленні відбір ростків із врахуванням різноякісності бульб для виділення меристем не можна рекомендувати з метою підвищення ефективності оздоровлення.

Зміна концентрації вірусів по зонах бульби в процесі зберігання. При імуноферментному аналізі соку ростків отриманих із різних зон бульби, що проходили період природного спокою ізольовано і не ізольовано одна від одної, на рівні точності методу (ІФА) не виявлено перерозподілу вірусних частинок МВК та YВК між зонами бульби під час природного спокою. Так, концентрація вірусів в ростках взятих з верхівки і пуповини бульби істотно не відрізняється.

Такий характер накопичення та розподілу вірусів по бульбах різного фракційного складу і по зонах бульби, не дозволяють розглядати заражену бульбу як об'єкт для пошуку напрямів оптимізації процесу оздоровлення. Доцільним є пошук здорової вихідної для оздоровлення рослини, або удосконалення методів звільнення зараженої рослини.

Вплив сукупної дії факторів на ефективність звільнення рослин від вірусів. При вивченні впливу різних фракції та зон бульб на ефективність оздоровлення, установлено, що вплив такого фактору відсутній або мінімальний (0,1-0,4%). Також не виявлено впливу (табл. 1) цього фактору на ефективність регенерації експлантантів із меристем. Так, вихід регенерантів з меристем по сорту Світанок київський лежить в межах 50 відсотків, по сорту Кобза 44-48 відсотків, незалежно від фракції бульби з якої відбиралися паростки для виділення меристем.

Вихід оздоровлених регенерантів від Y та М вірусів залежить від сортових особливостей матеріалу і проявляється в більшій кількості регенерованих рослин вільних від вірусів по сорту Світанок київський порівняно із сортом Кобза.

Таблиця 1

Ефективність звільнення картоплі від вірусної інфекції залежно від різноякісності та сортових особливостей вихідного для оздоровлення матеріалу, 1998-2000 рр.

Походження паростків з різних фракцій та зон бульб	Отримано регенерантів	Оздоровлених регенерантів
	Світанок київський	Кобза	НІР0,05	Світанок київський	Кобза	НІР0,05
фракція	зона
Ш60мм	верхівкова	50,63	44,16	3,84	84,66	74,51	4,16
	медіальна	51,99	46,81	3,02	84,87	74,58	3,98
	базальна	50,97	48,28	3,15	83,73	75,83	4,21
Ш 30-60	верхівкова	51,52	46,90	3,97	86,68	74,93	4,46
	базальна	50,22	47,83	3,80	86,62	71,73	4,83
Ш < 30	верхівкова	50,66	46,40	3,23	84,68	74,58	5,07
НІР0,05	1,69	6,56		2,77	8,39
Sx%	1,17	2,23		1,14	3,99
Вплив фактору	0,00	0,03		0,01	0,04

Встановлено вплив виду меристем на ефективність методу культури меристем. Найбільш прижились і дали вихід регенерантів апікальні меристеми в порівнянні з іншими, по сорту Світанок київський 84,7%, по сорту Кобза і 73,0 8%. Низький відсоток виходу регенерантів (відповідно по сортах 33,8% і 35,8%) із меристеми верхівкової зони ростка та з меристем нижньої зони ростка (33,6% - 29,3%).

По виходу оздоровлених рослин кращі результати отримані при регенерації із апікальних меристем 90,0% по сорту Світанок київський і 87,7% по сорту Кобза.

Статистичний аналіз результатів практичної роботи по ізоляції та культивуванні меристем при оздоровленні в Інституті картоплярства протягом 1993-2000 років встановив, що серед 1234 меристем 46 сортів та гібридів культивували апікальних - 246 (19,4%), бічних - 988 (80,1%). При регенерації з меристем рослин in vitro а, в подальшому ліній, та оцінка їх в польових умовах, відбір кращих і введення в колекцію із апікальних меристем становив 5,28%, з бічних - 2,83%.

Отже, практика первинного насінництва підтверджує перевагу апікальних меристем над бічними.

Порівняльна оцінка методів оздоровлення. На даний час при появі нового сорту його оздоровлюють методом культури меристеми, а вихідний для розмноження матеріал підтримують в умовах in vitro. Але не всі сорти позитивно реегують на оперативне оздоровлення при введені їх в культуру шляхом регенерації рослин із меристем, що й не завжди буває вдалим. У зв'язку з цим, нами було запропоновано методи добору здорових рослин і культивування їх in vitro без застосування культури меристем (табл. 2).

При порівнянні методів оздоровлення картоплі через добір здорових рослин і введенні їх в культуру in vitro бруньками та живцями з методом культури меристем, як контролем, встановлено наступне: Методи суттєво відрізняються між собою по періоду регенерації та кількості пересадок необхідних для повного відтворення рослини in vitro з вихідного експлантата. Найшвидше регенерували до пробіркових рослин живці in vivo введені в культуру: 31 доба по сорту Світанок київський і 27 діб по сорту Кобза при відсутності потреби у пересадках. Також метод добору здорових рослин із використанням стеблових живців переважає по приживанню експлантатів.

Відсоток уражених рослин у перший рік вирощування в полі (середнє за 1998-2000 рр.) по всіх варіантах був на рівні звичайного для цих сортів фонового перезараження в польових умовах: Світанок київський візуально 3,5 і 12,0% при ІФА, сорт Кобза відповідно - 1,5 і 16,0%. В 1999-2000 роках цим методом отримані безвірусні лінії сортів: Фантазія, Дніпрянка, Поляна, Тетерів. А спроба оздоровити таким чином сорт Луговська була невдалою, оскільки при імуноферментному аналізі серед візуально здорових рослин не вдалося знайти абсолютно вільні від основних видів вірусів рослини (M, Y, S, X, L). Відбір здорових рослин і введення їх в культуру in vitro з використанням живців, бруньок дозволяє уникнути термотерапію і культивування меристем, і цим самим прискорити процес оздоровлення.

Таблиця 2

Порівняльна оцінка біотехнологічних методів оздоровлення картоплі від вірусної інфекції, 1997-1999 рр.

Метод	Вид експлантанта	Розміщення експлантанта на стеблі	Кількість пересадок, шт.	Період регенерації, діб	Отримано ліній, %
Світанок київський
контроль	меристема	апікальне	2,9	83,5	65,35
		бічне	3,0	114,7	59,5
Добір здорових рослин	брунька	апікальне	0,6	57,8	78,7
		бічне	1,2	87,6	80,0
	живець	апікальне	0	30,7	93,2
		бічне	0	36,1	91,2
	НІР0,05	0,5	1,8	3,8
	Sx%	4,3	3,0	4,2
Кобза
контроль	меристема	апікальне	2,4	87,6	71,5
		бічне	2,9	96,6	61,3
Добір здорових рослин	брунька	апікальне	0,4	59,8	84,1
		бічне	0,9	73,8	78,2
	живець	апікальне	0	27,2	98,8
		бічне	0	34,2	95,0
	НІР0,05	0,6	2,7	3,8
	Sx%	3,5	4,8	4,2

Регенерація та прискорене розмноження оздоровлених рослин

Оптимізація середовища для отримання регенерантів з меристем. Порівнюванням середовищ які застосовуються, встановлено, що для культивування меристем сортів Світанок київський та Кобза оптимальним є середовище за прописом Мурасіге - Скуга із наступним набором гормонів: аденін 0,25 мг/л, кінетин - 0,25 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, оскільки відмічено порівняно високу приживаємість меристем при задовільному виході регенерантів. Але залишається невирішеною проблема низького відсотку отримання регенерантів. Тому оздоровлюючи нові сорти Серпанок і Фантазія у 2000-2001 рр., було випробувано препарат ДГ-75, похідна тетрагідротіофендіоксиду. Вихід регенерантів при заміні вказаних гормонів ДГ-75 в дозі 1мг/л, становить для сорту Серпанок 100%, Фантазія 97%. Вищі концентрації ДГ - 75 подовжували період регенерації меристем та знижували вихід меристем до 68-78%. Отримані в 2000 році дані підтверджено в 2001 на сортах Повінь та Веста.

Додавання ДГ-75 у дозі 1 мг/л в середовище при регенерації рослин із живців не лише підвищує регенерацію рослин з меристем, а й посилює ріст рослин. Так після трьох тижнів рослини сорту Серпанок досягли висоти 134 мм, що на 29% перевищувало контрольні об'єкти, Фантазія - 103 мм (на 94% вище за контроль).

Однак коефіцієнт розмноження зменшувався: із 6,5-6,7 живця на контролі залежно від сорту, у кращому варіанті з ДГ-75 відповідно 4,1-6,1 живця.

Вплив періоду повторного живцювання на інтенсивність регенерації рослин in vitro. На сортах Повінь, Серпанок, Слов'янка встановлена така закономірність росту і розвитку рослин in vitro: при живцюванні вихідних рослин in vitro віком 75-80 днів спостерігаються вищі темпи приросту висоти стебла і кількості міжвузль, ніж у регенерантів із вихідних рослин віком 50-55, 30-32 та 13-15 днів. Розвиток листкової пластинки відбувається у зворотній залежності: чим молодші вихідні рослини, тим краще відбувається розвиток листової пластинки в регенерантів. Найбільші листові пластинки відміченні при регенерації живців із вихідних рослин віком 13-15 рослин.

Отже, оптимальний вік рослин in vitro для живцювання - 30 днів (листки добре розвинуті, високий коефіцієнт розмноження).

Вплив різноякісності живців вихідної рослини на процес регенерації. Встановили, що у результаті різного фізіологічного стану організму вихідної рослини для живцювання відбувається різний вегетативний розвиток потомства. Так, регенеранти із живців взятих з базальної частини стебла вихідної рослини, мають найменшу висоту стебла. При першому живцюванні на 21 день розвитку висота рослин із цих живців по сорту Косень-95 становить 65 мм, по сорту Слов'янка - 41 мм, тоді як із середини стебла відповідно 98 і 87 мм.

В подальшому живцюванні методом накладання відмічається постійне зниження їх темпів розвитку і після 10 пасажу їх висота становить по сорту Косень-95 26 мм, по сорту Слов'янка 18 мм.

В регенерантів апікального походження при перших пасажах спостерігаються високі темпи розвитку. Але вже після 4-5 пасажу вони значно вповільнюються і спадають нижче рівня регенерантів із середини стебла (медіальних) вихідної рослини.

У рослин медіальних живців висота істотно не змінюється, порівняно з першими живцюваннями.

Отже, у випадку із апікальними живцями спочатку спостерігається спалах вегетативної сили, але вже на 4-5 живцювання відбувається її затухання. Регенеранти медіального походження мають стабільні темпи росту та розвитку. Живці базального походження із кожним наступним пасажем втрачають регенераційну здатність. Відповідно впливає також онтогенетичний вік і на кількість міжвузль та розвиток кореневої системи.

Розподіл ендогенної вірусної інфекції по зонах рослини in vitro. У дослідах з рослинами in vitro - носіями вірусної інфекції (МВК, SВК) при 10 кратному пасажуванні накладанням встановлено, що онтогенетична різноякісність зон стебла рослин носіїв вірусної інфекції не впливає на розподіл вірусної інфекції. Це спостерігається і в динаміці між першим та 10 пасажами. Встановлена закономірність підтверджує необхідність проведення періодичного оздоровлення сортозразків колекції рослин in vitro.

Застосування "культури одного вузла" як елементу ресурсозберігаючої технології одержання мікробульб. При виробництві мікробульб традиційними методами культивування на електроенергію припадає більш як 50% від усіх прямих витрат. Принципова відмінність нового методу "культура одного вузла" проявляється в тому, що при комплексному впливу ряду факторів (температура, фотоперіод, концентрація гормонів та сахарози) із бруньки живця рослини картоплі відразу утворюється столон. В подальшому із столона при дотриманні умов вирощування утворюються бульби, які при відсутності росту стебла стають найбільш активними в рослині атрагуючими центрами.

При культивуванні живців за умов звичайної технології спочатку утворюється стебло і лише через 20-30 днів починається столоноутворення .

За нового методу період культивування подовжується на 20-30% порівняно із контролем (рис. 1), однак освітлювальний період зменшується більш як на 80%. Початок столоноутворення та бульбоутворення в досліджуваному варіанті наступає значно швидше, хоча і триває довше. При застосуванні "культури одного вузла" збільшується відсоток виходу мікробульб із живців: по сорту Косень-95 - на 10%, а по сорту Слов'янка - на 26%.

Рис. 1. Співвідношення складових періоду культивування (освітлення і темнота) залежно від методу отримання мікробульб.

1 - Косень-95, контрольний метод; 2 - Косень-95, новий метод; 3 - Слов'янка, контрольний метод; 4 - Слов'янка, новий метод.

картопля вірусний інфекція регенерація

Інтенсивність повторної реінфекції залежно від умов вирощування. Оцінка реінфекції оздоровленого матеріалу сортів Луговська, Поляна, як найбільш сприйнятливих до повторного перезараження, показала, що при вирощуванні розсади оздоровлених рослин в польових умовах, вже на період початку бутонізації рівень реінфекції становив 40-50%, а на другий облік - понад 60%. Однак, при вирощуванні матеріалу в тепличних умовах (ізольовано від джерел та векторів вірусної інфекції) не виявлено хворих рослин, як візуально так і методом імуноферментного аналізу.

При висаджуванні матеріалу в наступний рік мінібульбами в поле загальна реінфекція рослин отриманих в польових умовах становить майже 100%, а матеріал отриманий в теплиці інфікується в польових умовах на 20-30%. Встановлено різні темпи проходження фенофаз рослинами з мінібульб залежно від умов їх отримання. Рослини із тепличних мінібульб на 4-5 днів швидше вступали в фази бутонізації та цвітіння і мали на 5-7 см вищу висоту порівняно із рослинами, що виросли із польових мінібульб. Урожайність посіву із польових мінібульб порівняно із посівом із тепличних мінібульб по сорту Луговська знижувалася на 21,6%, по сорту Поляна - на 27,75%.

При великій чисельності переносників відбувається транспорт інфекції із джерела до оздоровлених рослин екс in vitro, котрі є особливо привабливими для шкідників, із-за свого молодого віку порівняно з іншими рослинами. А в тепличних умовах при відсутності в приміщенні джерел інфекції якщо, і є переносник, то він переходить із здорової до здорової рослини, тобто в транспортному ланцюгу вірусної інфекції відсутня відправна точка. Таким чином, вихідний матеріал (мінібульби), отримані в закритому ґрунті, мають менший рівень реінфекції.

Ефективність удосконалення методів оздоровлення картоплі від вірусної інфекції та прискорення розмноження матеріалу

Напрямки удосконалення. Технологічний процес звільнення від вірусної інфекції та прискореного розмноження здорового матеріалу удосконалено на слідуючи напрямах:

На етапі добір вихідного для оздоровлення матеріалу при відсутності вірусів, застосування методу відбору здорових рослин на основі методів серодіагностики і введення їх in vitro пазуховими бруньками або стебловими живцями.

Підвищення ефективності методу культури меристем використанням апікальних меристем та додаванням в живильне середовище препарату ДГ-75.

При підтриманні колекції in vitro оздоровлених сортів виключення базальних та верхівкових живців з процесу живцювання.

Зниження собівартості мікробульб при прискореному розмноженні застосуванням методу "культури одного вузла"

Економічна оцінка ефективності методів оздоровлення. В Інституті картоплярства УААН проведено виробниче випробування методу оздоровлення картоплі шляхом добору здорових рослин в полі і ізоляції взятих з них живців від перезараження в умовах in vitro, порівняно з меристемнотканевим і отримано позитивні результати. При доборі здорових рослин у полі і безпосередній їх ізоляції в умовах in vitro відсутні затрати на термотерапію наявні при традиційному методі оздоровлення. Застосування добору здорових рослин в полі і ввдення їх в культуру in vitro знижуює собівартість отримання здорової лінії в порівнянні з традиційною культурою меристем по сорту Світанок київський із 897 грн., до 448 і 460 грн., залежно від способу введення в культуру in vitro, по сорту Кобза із 872грн. до 463 і 404 грн. відповідно.

Енергозбереження при вирощуванні мікробульб із застосуванням "культури одного вузла" При "культурі одного вузла" пробірки із живцями розташовується 1728 штук на світловому блоці, а за звичайної - 960 пробірок що, дозволяє зменшити площу освітлення. За новим методом (табл. 3) збільшується вихід мікробульб з рослини (по сорту Косень-95 із 104,9% до 116%, по сорту Слов'янка із 121,7 до 154%), що при меншій площі освітлення значно збільшує вихід в цілому мікробульб з освітлювальних блоків (потужністю 1 кВт/год.).

Таблиця 3

Собівартість мікробульб залежно від методу одержання

Показник/сорт	Сорт Косень - 95	Сорт Слов'янка
	контроль	культура одного вузла	контроль	культура одного вузла
Собівартість вирощування рослини, для одержання мікробульб, грн.	0,642	0,533	0,675	0,536
Вихід мікробульб із рослин, %	104,9	116,9	121,7	154,0
Вихід мікробульб із блоку, тис. шт.	1,007	2,023	1,168	2,661
Затрати електроенергії для отримання 1000 мікробульб	КВт	400,38	27,89	454,11	30,08
	МДж	1441,4	100,4	1634,8	108,3
	%	100	6,97	100	6,62
Собівартість 1 мікробульби, грн.	0,612	0,477	0,555	0,348

Поєднання вище вказаних чинників із зменшенням освітлювального періоду (рис.1) обумовлює загальне зменшення затрат електроенергії. Так затрати електроенергії на освітлення в експериментальному варіанті становлять близько 7% від контрольного, також зменшення періоду освітлення призводить до скорочення затрат на амортизацію електрообладнання. Зменшення затрат на електроенергію та обладнання дозволяє зменшити собівартість у цілому. Також мікробульби можна наробляти (накопичувати) певний період і при потребі висаджувати одночасно, що дозволяє покращити організацію виробництва вихідного насіннєвого матеріалу. Економічний ефект від зміни технологічного процесу. Економію затрат від зміни технологічного процесу звільнення від вірусів та прискореного розмноження, в зв'язку з використанням удосконалених методів розраховано (табл. 4) порівнянням даних про затрати на отримання безвірусного вихідного насіннєвого матеріалу картоплі згідно методичних вимог раніше застосовуваних і нових методів технологічного процесу оздоровлення та клонального мікророзмноження:

Ез = Зб - Зн,

де Ез - економія затрат від зміни технологічного процесу на 1 тис. вихідного in vitro матеріалу

Зб, Зн - матеріально-грошові затрати на 1тис. вихідного in vitro матеріалу новооздоровленого сортозразку матеріалу за базовим та новим технологічними процесами, грн.

Таблиця 4. Економічний ефект застосування удосконалених методів звільнення картоплі від вірусної інфекції та прискореного розмноження оздоровленого матеріалу

Метод вирощування	Матеріально-грошові затрати на одержання 1 тис. вихідного in vitro матеріалу новооздоровленого сорту залежно від методу оздоровлення	Економія затрат (Зб-Зн)
	базовий (Зб)	новий (Зн)
	гривень	%	гривень	%	гривень	%
при вирощуванні пробіркової розсади
базовий	1351,5	100	899,0	66,52	452,5	33,48
при вирощуванні мікробульб
базовий	1468,0	100	101,5	69,18	454,5	30,82
новий	1297,0	88,35	844,5	57,53	623,5	42,47

Економічний ефект від зміни технологічного процесу при вирощуванні 1 тис. пробіркової розсади новоздоровлених сортів становить:

Ез = Зб - Зн = 1351,5 - 899,0 = 452,5 грн.

Економічний ефект від зміни технологічного процесу при отриманні міробульб передбачає здешевлення процесу оздоровлення та зменшення затрат при культивуванні пробіркових рослин для отримання мікробульб.

При сукупній дії цих факторів економічний ефект при отриманні 1 тис. мікробульб новооздоровленого сортозразка становить:

Ез = 1468 - 844,5 = 623,5 грн.

Висновки

1. Використання удосконалених методів оздоровлення картоплі дозволяє отримувати вільний від Y, М вірусів вихідний матеріал для первинного насінництва та прискорити його одержання із одночасним зниженням енергетичних затрат.

2. Встановлений вплив сортових особливостей та рівноцінність різноякісного за розміром бульб вихідного матеріалу при оздоровленні методом культури меристем від М та Y вірусів картоплі рослин сортів Світанок київський, Кобза, що проявляється у більшому виході оздоровлених рослин сорту Світанок київський.

3. Встановлено, що при оздоровленні методом культури меристем, апікальні меристеми порівняно із іншими видами забезпечують отримання більшої кількості регенерантів (по сортах Світанок київський, Кобза відповідно 84,7 і 73,0%) та вищий вихід рослин вільних від вірусів (90,0% і 87,7%). Верхівкові та базальні види меристем регенерують найменше рослин (по сорту Світанок київський 33,8% і 33,6%, по сорту Кобза 35,8% і 29,3%) із них вільними від вірусів були по сорту Світанок київський відповідно 84,0% і 82,5%, по сорту Кобза 81,0% і 67,9%).

4. На сортах Серпанок, Фантазія, Повінь, Веста встановлено, що додавання препарату ДГ-75 в живильне середовище в дозі 1 мг/л збільшує вихід регенерантів із меристем до 91-100% при 74-95% контролі.

5. Встановлена можливість застосування поряд із культурою меристем методу добору здорових рослин в полі і їх культивуванні in vitro, що дозволяє здешевити та прискорити процес оздоровлення. Собівартість одержання оздоровленої лінії по сорту Світанок київський знижується із 897 до 460 грн., по сорту Кобза із 872 до 404 грн. Період регенерації зменшується із 83 до 58 днів по сорту Світанок київський, і з 88 до 60 днів по сорту Кобза.

6. При вивченні різних об'ємів вибірок для біометричних показників (висота рослини, довжина кореневої системи, кількість міжвузль, коренів, приріст стебла та кореня, середня довжина міжвузля, співвідношення стебло-корінь) доведена репрезентативність вибірки в 20 рослин in vitro при дослідженнях клонального мікророзмноження картоплі.

7. Встановлено, що різноякісність живців in vitro картоплі (апікальні, медіальні, базальні) обумовлює відмінність в регенерації рослин, однак не впливає на накопичення вірусів в регенерантах. Найкраща регенерація спостерігається в медіальних та апікальних живців, але у останніх після 4-5 пасажу темпи її вповільнюються. Регенеранти базального походження характеризуються втратою із кожним наступним пасажем регенераційної здатності.

8. Доведено ефективність застосування "культури одного вузла", як методу прискореного розмноження оздоровленого матеріалу в умовах in vitro. Затрати на освітлення при цьому зменшуються на 93 % порівняно із контролем. Собівартість мікробульб при співставленні з традиційним методом знижується в середньому по сортах Косень-95, Слов'янка на 29,3 %.

Пропозиції для первинного насінництва

1. Диференційований підхід при виборі методу оздоровлення: поряд з культурою меристем рекомендуємо застосовувати метод оздоровлення шляхом відбору в полі рослин вільних від вірусів та виділенню з них бруньок або стеблових живців, при введенні сорту в культуру in vitro.

2. Для швидкого відтворення рослин in vitro краще застосовувати апікальні меристеми. Меристеми з верхівкових та базальних зон паростка слід вводити в культуру in vitro лише при значному розширенні масштабів робіт.

3. При підтриманні колекції оздоровлених сортів при живцюваннях для сповільнення старіння матеріалу та специфічного накопичення ендогенних біологічно-активних речовин необхідно використовувати живці, які розміщені вище 2-3 вузла.

4. Враховуючи особливість розподілу біологічно-активних речовин по зонах рослин в процесі розмноження матеріалу in vitro, рекомендуємо використовувати живці із апікальних (до 4-5 пасажу) і медіальних зон стебла рослини для пасажування та виробництва розсади, а базальні для отримання мікробульб.

5. Для зменшення собівартості шляхом зниження витрат на електроенергію, амортизацію електрообладнання та поліпшення організації виробництва насіннєвого матеріалу картоплі необхідно застосовувати метод одержання мікробульб in vitro із використанням " культури одного вузла".

Список опублікованих праць за матеріалами дисертації

Мацкевич В.В., Різник В.С., Таран О.П. Регенерація рослин in vitro та градієнт вірусної інфекції в них залежно від онтогенетичного віку живця // Картоплярство. - 1999. - Вип. 29. - С. 99-105. (Обробка експериментальних даних і формування тексту).

Мацкевич В.В., Таран О.П. Прояв онтогенетичної різноякісності та особливості впливу вірусної інфекції на ріст, розвиток і продуктивність рослин картоплі // Картоплярство. - 2000. - Вип. 30. - С. 176-184. (Отримання експериментальних даних і формування тексту).

Мацкевич В.В., Дульнев П.Г., Широконос А.М. Використання сполук з фітогормональною активністю в біотехнології картоплі // Вісник Державної агроекологічної академії України. - 2000. - С. 46-47. (Отримання, обробка експериментальних даних і формування тексту).

Мацкевич В.В. Порівняльна оцінка способів оздоровлення сортозразків картоплі від вірусної інфекції // Картоплярство. - Вип. 31. - С. 111-118.

Мацкевич В.В., Чечітко І.П. Застосування " культури одного вузла" як елементу ресурсозберігаючої технології одержання мікробульб in vitro // Картоплярство. - 2003. - Вип. 32. С. 113-117. (Отримання, обробка експериментальних даних і формування тексту).

Широконос А.М., Мацкевич В.В., Оптимальні вибірки рослин у дослідженнях картоплі в культурі in vitro // Фізіологія рослин - 2002. - 34, №4. - С. 353-359. (Отримання експериментальних даних і формування тексту).

Методичні рекомендації щодо проведення досліджень з картоплею / Куценко В.С., Осипчук А.А., Подгаєцький А.А., Кононученко В.В., Бугаєва І.П., Верменко Ю.Я., Знаменський О.П., Каліцький П.Ф., Кочура В.Д., Мороз І.Х., Назар С.Г., Олійник Т.М., Починок В.Я., Разкевич М.П., Різник В.С., Руденко Г.С., Рязанцев В.Б., Сидорчук В.І., Свертока В.Є., Тарасенко О.О., Тимошенко Т.В., Хареба В.В., Чередніченко Л.М., Шарапа М.Г., Мицько В.М., Кононученко А.О., Костюк І.І., Маленко І.М., Харченко В.В., Царенко М.І., Бондус Р.О., Кравченко В.В., Петров Є.Є., Сторожук В.А., Таран О.П., Чечітко І.П., Войцешина Н.І., Белошицька Н.Й., Мацкевич В.В., Таращенко Н.І., Захарчук Н.А. Немішаєве. - 2002.- 182с. (формування тексту підрозділу Оздоровлення картоплі методом термотерапії та культури меристем - С. 94-99.)

Мацкевич В.В., Різник В.С., Таран О.П. Вплив онтогенетичного віку живця на регенерацію рослин in vitro та градієнт вірусної інфекції. // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва (Тези доповідей міжнародної конференції, присвяченої 90-річчю від заснування Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва УААН - Харків, 1999. - С. 245-246. (Отримання, обробка експериментальних даних і написання тексту).

Анотація

Мацкевич В.В. Удосконалені методи оздоровлення картоплі від вірусів та використання отриманого матеріалу в первинному насінництві. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 06. 01.14 - насінництво. - Інститут цукрових буряків УААН, Київ, 2004.

Виконаними протягом 1998-2003 рр. дослідженнями обґрунтовано напрями удосконалення методів оздоровлення картоплі від вірусів та прискореного розмноження вихідного насіннєвого матеріалу.

Встановлена оптимальна репрезентативна вибірка в 20 рослин in vitro для біометричних показників при дослідженнях клонального мікророзмноження картоплі.

Встановлено вплив сортових особливостей та виду меристем на ефективність звільнення від вірусів методом культури меристем.

При звільнені від вірусів сортів Світанок київський, Кобза встановлено перевагу методу добору здорових рослин і введення їх в культуру in vitro бруньками та живцями над культурою меристем. Метод дозволяє прискорити процес оздоровлення та знизити собівартість безвірусного матеріалу.

Встановлено, що при багаторазовому живцюванні в умовах in vitro регенерація рослин картоплі залежить від різноякісності живців вихідної рослини. Вперше для нових вітчизняних сортів розроблено ресурсозберігаючий метод отримання мікробульб in vitro який дозволяє збільшити вихід мікробульб та зменшити на 93% затрати на освітлення.

Проведено економічну оцінку ефективності удосконалення методів оздоровлення та прискореного розмноження вихідного насіннєвого матеріалу картоплі.

Ключові слові: картопля, вірус, культура меристем, культура in vitro, регенерація, мікробульба.

Аннотация

Мацкевич В.В. Усовершенствованные методы оздоровления картофеля от вирусов и использование полученного материала в первичном семеноводстве. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.01.14 - семеноводство. Институт сахарной свеклы УААН, Киев, 2004.

В исследованиях, выполненных в течение 1998-2003 гг. обосновано пути усовершенствования методов оздоровления картофеля от вирусов и ускоренного размножения исходного семенного материала.

Изучена зависимость ошибки опыта от количества растений. Установленна оптимальная репрезентативная выборка в 20 растений in vitro для биометрических показателей при исследованиях клонального микроразмножения картофеля.

Установлено влияние сортовых особенностей и вида меристем на эффективность освобождения от вирусов методом культуры меристем. Которое проявляется у большем количестве безвирусных регенерантов сорта Свитанок киевский сравнительно с сортом Кобза. Высочайший выход растений свободных от вирусов, сравнительно с другими видами меристем, получен из апикальных меристем (соответственно 90,0% и 87,7%). Верхушечные и базальные виды меристем регенерируют меньше всего безвирусных растений по сорте Свитанок киевский соответственно 84,0% и 82,5%, по сорте Кобза 81,0% и 67,9%.

При освобожденнии от вирусов сортов Свитанок киевский, Кобза установлено преимущество метода отбора здоровых растений и введение их у культуру in vitro почками и черенками над меристемнотканевым. Метод позволяет ускорить процесс оздоровления и снизить себестоимость безвирусного семенного материала.

Установлено, что при многоразовом черенковании в условиях in vitro регенерация растений картофеля зависит от разнокачественности черенков исходного растения. В случае из апикальными черенками сначала наблюдается вспышка вегетативной силы, но на 4-5 черенкование происходит его затухание. Регенеранты медиального происхождения имеют стабильные темпы роста и развития. С каждым пассажем черенки базального происхождения теряют регенерационную способность.

Впервые для новых отечественных сортов картофеля (Косень-95, Тирас, Загадка, Повинь, Серпанок, Забава, Обрий, Славянка, Фантазия) разработан ресурсосохраняющий метод получения микроклубней in vitro - "культура единственного узла" позволяющий увеличить выход микроклубней и уменьшить на 93% затраты на освещение. При применении этого метода ускоряется начало столоно- и клубнеобразования и значительно сокращается осветительный период (до 7-10 дней зависимо от сорта).

Ключевые слова: картофель, вирус, культура меристем, культура in vitro, регенерация, микроклубень.

Summary

Matckevith V.V. Improved methods of potato sanitation against viruses and using of obtained material in primary seed growing. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of agricultural sciences on a specialty 06. 01.14 - Seed Growing. - Sugar beet research institute UAAS.- Kiev, 2004.

Scientific researches performed during 1998-2003 proved lines of improvement methods of potato sanitation against viruses and accelerated reproduction of initial seed materials.

Under researches the optimal representative sample of 20 plants in vitro for biometrical indexes of potato clonal micro reproduction was determined.

Influence of varieties particularities and species of meristem on effectiveness of deliverance from viruses by the merisystem culture method was determined.

During deliverance from viruses of Svitanok Kyivsky and Kobza varieties it was determined the advantage of the method of healthy plants selection and their inoculation in the culture in vitro as buds and sprouts over meristem-tissue method. This method allows to speed up sanitation process and to decrease a cost price of free of virus material.

It is determined that, when multiply grafting in vitro conditions is using, regeneration of potato plants is depends on different quality of initial plant graft.

Resources-economy method of obtaining microtubers in vitro is discovered for new home varieties. It allows to increase microtubers output and to decrease lighting costs on 93%.

It was estimated economic effectiveness of improvement of the methods of sanitation and accelerated reproduction of initial seed potato materials.

Key words: potato, virus, meristem culture, culture in vitro, regeneration, microtuber.

Размещено на Allbest.ru