Главная Коллекция "Otherreferats" Сельское, лесное хозяйство и землепользование Розробка нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного

Розробка нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного

Розповсюдження та особливості перебігу епізоотичного процесу сибірки в Україні. Продуктивні властивості окремих вакцинних штамів її збудника. Характеристика штаму-продуценту та антигену сибіркового стандартного виготовленому з його культуральної рідини.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 25.06.2014
Размер файла 30,3 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

РОЗРОБКА НОВОЇ ТЕХНОЛОГІЇ ВИГОТОВЛЕННЯ АНТИГЕНУ СИБІРКОВОГО СТАНДАРТНОГО

Завірюха Ганна Анатоліївна

03.00.20 - біотехнологія

Біла Церква - 2002

Анотація

Завірюха Г.А. Розробка нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук зі спеціальності 03.00.20.- біотехнологія. Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2002.

Розроблено нову технологію виготовлення антигену сибіркового стандартного для контролю преципітуючої сибіркової сироватки при встановленні діагнозу на сибірку за допомогою реакції преципітації (Асколі, диск-преципітація, дифузійна преципітація в агаровому гелі). Для виготовлення антигену використовують стерильний фільтрат культуральної рідини вакцинного штаму Bac. anthracis К-79Z з відповідним титром специфічного сибіркового білку - екзотоксину. Антиген, виготовлений за новою технологією, є речовиною високо специфічною, властивою лише для збудника сибірки і не містить групоспецифічних соматичних антигенів, які присутні в сомі клітин сибіркових та ґрунтових сапрофітних аеробних бацил.

На відміну від загальноприйнятої технології, нова технологія екологічно безпечна, економна, енергозберігаюча і не шкідлива для здоров'я людей. Застосування нового антигену в роботі діагностичних лабораторій ветмедицини України для встановлення діагнозу з сибірки, дало можливість звільнити державу від закупівлі подібного антигену за кордоном та щороку заощаджувати валютні кошти.

Ключові слова: сибірка, антиген сибірковий стандартний, реакція Асколі, диск-преципітації, дифузійної преципітації в агаровому гелі, групоспецифічні соматичні антигени, екстрацелюлярний токсин збудника сибірки.

Аннотация

Завирюха А.А. Разработка новой технологии изготовления антигена сибиреязвенного стандартного. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Белоцерковский государственный аграрный университет. Белая Церковь, 2002.

В Украине за последние 10 лет (1991-2000 гг.) заболевание сибирской язвой сельскохозяйственных животных зарегистрировано во всех областях и в АР Крым (169 неблагополучных по сибирской язве пунктов, 1338 больных животных).

Наиболее неблагополучными были Винницкая, Луганская и Хмельницкая области - по 14 неблагополучных пунктов. По 11-12 пунктов выявлено в Николаевской, Ровенской и Черкасской областях, 6-10 пунктов - в Киевской, Одесской, АР Крым и Сумской областях. В остальных областях от 1 до 5 пунктов. Среди заболевших сибирской язвой животных, преобладает крупный рогатый скот в возрасте 6-18 месяцев. В трёх областях (Ивано-Франковская, Волынская, Луганская) сибирской язвой болели пушные звери, которые заразились вследствие поедания мясного фарша, приготовленного из туш вынужденно убитого крупного рогатого скота не прошедших бактериологического контроля. Вспышки среди зверей характеризовались большим охватом поголовья и гибелью сотен животных. В Одесской, Херсонской, Хмельницкой и Киевской областях массовые заболевания сибирской язвой были среди крупного рогатого скота, иммунизированного зарубежной вакциной 8-10 месяцев назад. Каждая вспышка характеризовалась большим охватом поголовья и смертностью, а также значительными трудностями в ликвидации заболевания. В целом эпизоотическая ситуация по сибирской язве в Украине сложная и напряженная. Взято на учёт около 10 тыс. неблагополучных по сибирской язве пунктов и около 6 тыс. мест захоронений трупов животных павших от сибирской язвы. С целью недопущения заражения животных и людей, а также распространения сибирской язвы в Украине ежегодно осуществляется около 2 млн. различных лабораторных диагностических исследований. Для подтверждения диагноза обязательно проводятся серологические исследования по реакции Асколи, диск-преципитации. Для выполнения этой работы лаборатории ветеринарной медицины должны быть обеспечены сибиреязвенной преципитирующей сывороткой и антигеном сибиреязвенным стандартным для контроля. Украина не имела своего производства сибиреязвенных вакцин и диагностикумов. В нашу задачу входило разработать более совершенную технологию изготовления антигена сибиреязвенного стандартного. Предложенная нами технология, в отличии от зарубежных технологий предусматривает изготовление антигена из культуральной жидкости вакцинного штамма Bac. аnthracis K-79 Z. Экспериментально установлено, что выработка экзотоксина микробными клетками вакцинного штамма K-79 Z, зависит от количества микробов в инокуляте на единицу среды, температуры и продолжительности культивирования, вида и состава питательной среды и др.

Новая технология изготовления антигена сибиреязвенного стандартного экологически безопасна, безвредна для здоровья людей биопредприятия, не требует соблюдения повышенного охранного режима производства, экономит энергию и денежные средства. Освоение производства антигена в Украине и обеспечение им лабораторий ветмедицины дало возможность прекратить закупки антигена за рубежом и обеспечить стабильную работу лабораторий по проведению диагностических исследований на сибирскую язву.

Ключевые слова: сибирская язва, антиген сибиреязвенный стандартный, реакция Асколи, диск - преципитации, диффузионной преципитации в агаровом геле; группоспецифические соматические антигены, экстрацелюлярный токсин возбудителя сибирской язвы.

Annotation

Zaviriukha А.А. The development of a Novel Technology of Anthrax Standard Antigen Production. - Manuscript.

The thesis for the degree of Candidate of Agricultural Sciences, in specialized field 03.00.20 - bioteсthnology. Bila Tserkva State Agrarian University, Bila Tserkva, 2002.

A novel technology of anthrax standard antigen production has been developed for the control of precipitating anthrax serum in precipitation test (Ascoli test, disk-precipitation, agargel immuno-diffusion test) in laboratory diagnosis of anthrax. For the production of the antigen a sterile filtrate of culture fluid of vaccine strain Bac. Anthracis K -79 Z with certain titer of specific anthrax protein - exotoxin is used but not a filtrate of autoclaved microbes of anthrax causative agent virulent strain, according to the conventional technology. The antigen produced according to the novel technology is highly specific substance, which is only characteristic of anthrax causative agent, and it does not contain group specific somatic antigens that are present in the soma of bacterial cells of anthrax and anthrax-like bacilli. In contrast with the conventional technology the novel technology is safe, as regards ecology; it saves electric power and is harmless to humans health. The use of the new antigen in the work diagnostic laboratories of veterinary medicine in Ukraine to diagnose anthrax has made it possible not to purchase this antigen abroad and to save annually.

Key words: anthrax, anthrax standard antigen, Ascoli's test, dick precipitation test, agar gel diffusive precipitation test, group specific somatic antigens, extracellular toxin of anthrax agent.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Головним завданням гуманної і ветеринарної медицини є здійснення заходів, направлених на профілактику і боротьбу з хворобами спільними для людей і тварин, так званими антропозоонозами.

Сибірка - одне з найбільш небезпечних антропозоонозних захворювань, що супроводжується лихоманкою, сепсисом, інтоксикацією і великою смертністю. Захворювання розповсюджене на всіх континентах земної кулі (М.Г. Таршис, 1971; Н.Г. Ипатенко, 1982;) і зокрема в Україні (Г.П. Берёзкина и соавт, 1971; А.І. Завірюха, О.М. Харчук, Б.Л. Троценко, 1979).

Незважаючи на значні успіхи досягнуті в розробці методів діагностики, засобів профілактики та боротьби з сибіркою, ні одна країна світу не може заявити про її повну ліквідацію. Щорічно на земній кулі хворіє сибіркою більше 20 тис. людей і біля одного мільйона тварин ( Ипатенко Н.Г и соавт., 1987). За даними О.О. Бобильвої Л.М. Мухарської, А.С.Некрасової, 2001 в 1984-2001 рр. в Україні зареєстровано 105 випадків захворювання сибіркою людей, з яких 5 померло. Останнім часом, спори сибірки були застосовані в США, як засіб нападу (біологічна зброя) та політичного шантажу.

Вагомий внесок у вивчення сибірки, розробку методів діагностики, профілактики і боротьби зробили К. Davanie, R. Koch, L. Pasteur, Л.С. Ценковський, В.К. Високович, С.І. Вишелєський, Н.А. Міхін, Ф.А. Терентьєв, Н.Н Гінсбург, С.Г.Колєсов, Х.Х. Абдулін, М.В. Рево, M. Sterne, N. Stamatin, М.Г. Іпатенко, Г.В. Дунаєв, Є.Н. Шляхов, А.І. Завірюха та інші. Починаючи з відкриття збудника (Davanie, 1863) і до наших часів, в усіх розвинутих державах світу вивчення сибірки, розробка методів діагностики, засобів боротьби та профілактики ставиться в ряд найважливіших соціальних і народногосподарських проблем. Чи не найголовніше значення в боротьбі з сибіркою має своєчасне і достовірне встановлення діагнозу. Поряд з мікроскопічними і бактеріологічними дослідженнями діагностичні і наукові лабораторії ветеринарної медицини користуються серологічними методами досліджень: реакції Асколі, дифузійної преципітації, диск-преципітації. Для постановки цих реакцій необхідні і відповідні компоненти, зокрема преципітуюча сибіркова сироватка та антиген сибірковий стандартний.

З розпадом СРСР у незалежної держави Україна виникли проблеми з забезпеченням її не тільки діагностикумами, але і протисибірковими вакцинами для захисту тварин. Перед науковцями ІВМ УААН було поставлено завдання державної ваги - в короткий термін часу розробити вітчизняні технології виготовлення сибіркової вакцини та антигену сибіркового стандартного і забезпечити державу якісною продукцією власного виробництва, звільнивши її від імпортного постачання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною наукових досліджень, передбачених тематичним планом Інституту ветеринарної медицини УААН з виконання програми договору з Міністерством України у справах науки і технологій №2/1011-97 від 21.08.97 “Розробити нормативну документацію та нову технологію біофабричного виробництва антигену сибіркового стандартного ”, де здобувач був одним із основних виконавців.

Мета і задачі досліджень. Головною метою досліджень було на основі результатів вивчення біології збудника сибірки, зокрема його властивостей виробляти екстрацелюлярний токсин, розробити нову технологію виготовлення антигену сибіркового стандартного, освоїти його виробництво та впровадити в роботу державних лабораторій ветеринарної медицини України. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

вивчити розповсюдження та особливості перебігу епізоотичного процесу сибірки в Україні за останні десять років (1991-2000), провести аналіз діагностичних досліджень з сибірки за даними державних лабораторій ветеринарної медицини України (1991-2000) та визначити їх потреби в антигені сибірковому стандартному;

вивчити продуктивні властивості окремих штамів збудника сибірки, відібрати найбільш перспективні для отримання культуральної рідини з високим вмістом (титром) екзотоксину;

розробити принципово нову екологічно безпечну, енергозберігаючу та нешкідливу для здоров'я людей технологію виготовлення антигену сибіркового стандартного ;

дати порівняльну оцінку антигенів, виготовлених за різними технологіями, з окремих видів мікробів роду Bacillus;

дати характеристику штаму-продуценту та антигену виготовленому з його культуральної рідини;

розробити та затвердити нормативну документацію на виготовлення та контроль якості антигену сибіркового стандартного (ТУУ, інструкція);

організувати виробництво антигену сибіркового стандартного за новою технологією, провести його випробування в умовах роботи діагностичних лабораторій ветеринарної медицини та забезпечити їх цим діагностикумом, звільнивши державу від закупівель за кордоном.

Об'єкт дослідження: сибірка тварин, вірулентні, авірулентні вакцинні штами збудника сибірки та окремі види ґрунтових аеробних бацил, та фільтрати культуральної рідини з продуктами їх життєдіяльності.

Предмет дослідження: антиген сибірковий стандартний, виготовлений за новою технологією з вітчизняного вакцинного штаму збудника сибірки Bac.anthracis К-79Z, форми звітності 1- вет. і 4 -вет. Державного департаменту ветеринарної медицини та Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України за 1991-2000рр.

Методи дослідження: ретроспективний епізоотологічний аналіз, бактеріологічні, серологічні, біотехнологічні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено розповсюдження та особливості перебігу сибірки в Україні за останні 10 років (1991-2000). Проведено аналіз лабораторних досліджень щодо сибірки, що здійснюються щорічно в нашій державі з метою контролю за епізоотичною ситуацією. Теоретично та експериментально обґрунтовано необхідність розробки нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного для діагностики сибірки. Розроблена нова екологічно безпечна, енергозберігаюча та нешкідлива для здоров'я людей технологія, виготовлення специфічного антигену. Вперше для виготовлення сибіркового антигену використано стерильну культуральну рідину вітчизняного вакцинного штаму Bac.anthracis К-79Z. Розроблено і затверджено нормативну документацію на виготовлення і контроль якості антигену сибіркового стандартного (ТУУ, інструкція). Організовано і освоєно виробництво антигену сибіркового стандартного за новою технологією та впроваджено цей діагностикум в роботу діагностичних лабораторій ветеринарної медицини України.

Практичне значення одержаних результатів. Результати експериментальних досліджень по вивченню токсинпродукуючих властивостей вакцинних штамів збудника сибірки та окремих видів ґрунтових аеробних бацил, лягли в основу теоретичного обґрунтування можливості розробки принципово нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного, вкрай необхідного при встановлені лабораторного діагнозу щодо сибірки. Розробка нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного та освоєння його виробництва в Україні, дали можливість забезпечити діагностичні лабораторії ветеринарної медицини нашої держави антигеном власного виробництва та зняти проблему його закупівлі за кордоном. Виготовлення антигену сибіркового стандартного за новою технологією регламентовано вітчизняною нормативною документацією (ТУУ 46.15.381-99, інструкція), затвердженою Державним департаментом ветеринарної медицини України. Вивчення розповсюдження сибірки в Україні, особливостей перебігу її епізоотичного процесу за період 1991-2000рр. та аналіз об'ємів щорічних лабораторних досліджень з сибірки, дали можливість визначити особливості прояву інфекції серед різних видів та вікових груп тварин, в різні сезони року та визначити щорічні потреби лабораторій в антигені сибірковім стандартнім. Матеріали досліджень використані при розробці нормативної документації.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг методичних, епізоотологічних, та експериментальних досліджень (бактеріологічні, серологічні, біологічні, імунологічні), проведено огляд і аналіз літературних джерел, узагальнено отримані результати, оформлено рукописи дисертаційної роботи, автореферату, проекту нормативної документації. Здобувач прийняв активну участь в освоєнні виробництва та впровадженні антигену в роботу державних лабораторій ветеринарної медицини України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались і отримали позитивну оцінку: на щорічних звітних конференціях науково-виробничої діяльності вчених Інституту ветеринарної медицини УААН (1999-2001), на першій Всеукраїнській науково-методичній конференції фармакологів і токсикологів, м. Київ, 1998; на Всеукраїнському семінарі “Сучасні методи лабораторної діагностики деяких захворювань бактеріальної етіології сільськогосподарських тварин”, м. Тернопіль, 2000; на Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных”, м. Мінськ, 2000; на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення”, м. Київ, 2000.

2. Загальна методика і основні методи досліджень

Робота ґрунтується на результатах вивчення токсигенних властивостей вірулентних та вакцинних штамів збудника сибірки і окремих видів ґрунтових аеробних бацил. Дослідження проводились протягом 1997-2000рр. в лабораторії бактеріології Інституту ветеринарної медицини УААН. У дослідах використовували вірулентний, капсулоутворюючий штам збудника сибірки Bac. anthracis ІВМ-97Z, який застосовується біофабриками для визначення імуногенності вакцин проти сибірки тварин; безкапсульні авірулентні штами збудника сибірки: Bac. anthracis K-79Z (Завірюха А.І., Україна), Bac. anthracis 34F2 (Sterne М., Англія), Bac. anthracis 55 (Гаврилов В.П., ВНИИВВиМ) та ґрунтові аеробні бацили: Bac. cereus, Bac. subtilis, Bac. anthracoides (сибіркоподібна), Bac. megaterium (капустяна). Також використовували стандартну преципітуючу сибіркову сироватку (ТУ 46.21.956-76) виробництва Орловської біофабрики, високоочищенний агар Діфко, звичайний мікробіологічний агар, очищений за методикою авторського свідоцтва №1122001 (А.І. Завірюха, О.П. Степанюк,1980), та антиген сибірковий стандартний виробництва Тобольської біофабрики (Росія). Для вирощування мікроорганізмів застосовували рідкі (м'ясо-пептонний бульйон, бульйон Хоттінгера, 5%-вий гемогідролізат для культури тканин, середовище 199) та тверді (агаризовані) такі ж поживні середовища. Метаболіти сибіркових і ґрунтових аеробних бацил отримували за традиційною технологією (F. Belton, R. Stronge, 1954, Н.И. Александров и соавт., 1963;) та за методикою авторського свідоцтва № 1022362 (А.І. Завірюха, О.М. Харчук, 1979). В стерильних фільтратах культуральної рідини визначали наявність і кількість (титр) специфічного сибіркового білку за реакцією диск-преципітації (А.І. Завірюха, О.П. Степанюк, 1978), а його чистоту методом імунодифузії в агаровому гелі за O. Ouchterlony (1953). Бактерійні антигени із сибіркових і окремих видів ґрунтових аеробних бацил готували за методом С.Г. Колєсова (1976). Кількісні і якісні показники визначали у трьох повторностях дослідів. Зразком, до якого прирівнювали і з яким порівнювали, виготовлені антигени, був антиген сибірковий стандартний виробництва Тобольської біофабрики. Отриманні з бактеріальної маси та культуральної рідини антигени стандартизували за вимогами ТУУ 46.15.381-99.

Реактогенні властивості антигену сибіркового стандартного, виготовленого за розробленою нами технологією, а також його нешкідливість для білих мишей визначали за наявністю запального набряку на місці ін'єкції та кількістю тварин, що залишились живими через 10 діб після парентерального введення їм антигену. Вплив цього ж антигену на клітинний фактор імунітету визначали за реакцією гіперчутливості сповільненого типу за P. Lagrange et al. (1974).

Випробування придатності нового антигену сибіркового стандартного для постановки реакції Асколі в умовах виробництва, проводили в Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Розповсюдження сибірки в Україні та особливості перебігу епізоотичного процесу за період 1991-2000рр. вивчали за даними звітності (форма 1-вет.) Державного департаменту ветеринарної медицини України, користуючись методикою епізоотологічних досліджень (И.А. Бакулов, 1979). Аналіз щорічних об'ємів лабораторних досліджень з сибірки в Україні, проводили за даними річних звітів (форма-4 вет., за період 1991-2000). Статистичну обробку цифрових показників проводили за А.М. Мерков та Л.Е. Поляков (1974).

3. Результати досліджень

1. Розповсюдження сибірки в Україні та особливості перебігу її епізоотичного процесу (1991-2000)

Незважаючи на посилення та удосконалення заходів профілактики, та боротьби з сибіркою в Україні, покращення методичної і практичної роботи ветеринарно-санітарної та діагностичної служб, сибірка продовжує, хоч і в меншій кількості, вражати чутливих тварин, а від них заражаються і хворіють люди (О.О. Бобильова і співавт., 2001).

За останні 10 років (1991-2000) в Україні захворювання тварин сибіркою було зареєстровано в 169 населених пунктах, де захворіло 1338 різних видів тварин. Найбільш неблагополучними щодо сибірки, як і в минулі роки, були Вінницька, Луганська і Хмельницька області (по 14 неблагополучних пунктів). У Миколаївській, Рівненській, Харківській та Черкаській областях тварини хворіли сибіркою в 11-12 населених пунктах. Від 6 до 10 неблагополучних з сибірки пунктів зареєстровано у Київській, АР Крим, Одеській та Сумській областях. У таких географічно віддалених та різних за екологічними умовами областях, як Херсонська та Чернігівська, які в минулому були в списку найбільш неблагополучних щодо сибірки областей, в останні 10 років було виявлено лише по одному неблагополучному пункту. Відбулась активізація епізоотичного процесу сибірки в Рівненській області (11 неблагополучних пунктів). Три масових спалахи сибірки було зареєстровано серед хутрових звірів в Івано-Франківській, Волинській та Луганській областях. Тварини захворіли внаслідок згодовування фаршу, виготовленого з м'яса вимушено забитої і недослідженої лабораторно хворої сибіркою великої рогатої худоби. Якщо з загальної кількості (дат) захворілих виключити захворювання звірів спричинене діяльністю людини, як “вискакуючу дату”, то велика рогата худоба в загальній кількості захворілих становитиме більше 80% і це, переважно, молодняк віком 6-18 місяців.

В Одеській, Херсонській, Хмельницькій та Київській областях зареєстровано спалахи сибірки серед великої рогатої худоби, щепленої вакциною із штаму 55. Такі спалахи супроводжувались значним охопленням поголів'я (молодняк, дорослі) та труднощами боротьби з застосуванням загально прийнятих заходів (антибіотики, тотальне щеплення тощо). Лише імунізація абацилярною вакциною Антракол припиняла захворювання і розповсюдження сибірки (Завірюха А.І., Вербицький П.І. та інші, 2000).

В Чернігівській області виявлено два трупи лосів, які загинули від сибірки, що підтверджує існування природної вогнищевості у цієї недуги. Найбільше тварин захворіло сибіркою в 1993-1994рр. Сибірка сезонна хвороба і вражає тварин переважно в теплий період року (літо - осінь), коли тварини користуються пасовищем.

2. Аналіз результатів лабораторних досліджень з сибірки в Україні (1991-2000)

Порівняльний ретроспективний аналіз епізоотичної ситуації щодо сибірки в Україні показав, що за останні десять років (1991-2000) відбулося суттєве зменшення частоти спалахів захворювання серед різних видів тварин. Однак і до цього часу епізоотична ситуація в державі з цієї недуги залишається складною і напруженою, що вимагає подальших більш глибоких наукових досліджень проблеми та розробки більш ефективних заходів діагностики, профілактики і боротьби. Успіх боротьби з сибіркою знаходиться в прямій залежності від термінового і кваліфікованого встановлення діагнозу. Щорічно в Україні досліджується 9-12 тисяч зразків патологічного матеріалу і проб з туш вимушено забитих тварин, від 5 до 11 тисяч зразків шкірсировини, ґрунту, змивів з конструкцій тваринницьких приміщень, комор, холодильних камер, кормів тощо та більше 1 млн. зразків шкірсировини за реакцією Асколі. Внаслідок зменшення поголів'я дрібної рогатої худоби та свиней кількість лабораторних досліджень матеріалу від цих видів тварин зменшилась в порівнянні з 1991р. у 1,5-2 рази. Одночасово почали зростати об'єми лабораторних досліджень матеріалу від великої рогатої худоби (9 тис./рік). Починаючи з 1998р., лабораторії ветеринарної медицини в основному (84,3%) досліджують на сибірку матеріал від великої рогатої худоби та свиней. Шкури, зняті до встановлення діагнозу з загинувших та вимушено забитих хворих сибіркою тварин, є вагомим фактором в розповсюдженні інфекції. Щорічно лабораторіями ветеринарної медицини проводяться дослідження за реакцією Асколі більше 1 млн. проб шкірсировини, заготовленої у населення та по імпорту (Табл.1).

Таблиця 1 Об'єми щорічних досліджень шкірсировини щодо сибірки в Україні за реакцією Асколі (1991-2000)

Роки

Види шкірсировини та кількість зразків

Велика рогата худоба

Дрібна рогата худоба

коні

інші види тварин

всього

1991

836006

512172

-

16531

1364709

1992

788184

403038

4319

8155

1203696

1993

777854

389037

4631

8857

1180379

1994

964185

347616

5501

14828

1332130

1995

859879

317854

2713

19097

1199553

1996

961539

63028

1403

11655

1037625

1997

971008

60084

1500

12436

1045028

1998

321927

44001

5312

4693

375933

1999

436702

10483

452

3372

451009

2000

582218

26494

2305

9726

620743

1991-2000

7499502

2173817

28136

109350

9810805

М+/-м

7499502

2173817

3126,22

109350

9810805

+ - 6823,31

+ - 5890,03

+ - 2286,99

+ - 1649,37

+ - 1649,37

З даних таблиці 1 видно, що до 1998р. в Україні щорічно досліджувалось за реакцією Асколі 1,0-1,3 млн. проб шкур. В 1998-1999рр. об'єми досліджень скоротились в 2-3 рази, але в 2000р. в порівнянні з 1999р. знову збільшились в 1,4 рази.

Вивчення епізоотичного стану та об'ємів щорічних лабораторних досліджень з сибірки показали, що епізоотична ситуація з цієї хвороби залишається складною і вимагає чіткої роботи лабораторій щодо встановлення діагнозу. З цих причин лабораторії ветеринарної медицини повинні бути забезпечені відповідними діагностикумами. Через відсутність вітчизняного виробництва цих діагностикумів, в нашу конкретну задачу входило розробити нову технологію виготовлення антигену сибіркового стандартного.

3. Розробка нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного

В доступній літературі ми знайшли лише одну роботу (С.Г. Колєсов, 1976), де описано спосіб виготовлення антигену в Росії. Для цього використовують змив колоній мікробів, вірулентного штаму з агаризованого поживного середовища. Отриману суспензію автоклавують, висушують до постійної ваги, розчиняють у фізіологічному розчині 1:3000 - 1:5000, фасують в ампули, стерилізують, запаюють ампули і реалізують. Така технологія екологічно небезпечна, енергоємна, шкідлива для здоров'я людей біофабрики, економічно затратна, а сам антиген містить групоспецифічні соматичні протеїни, що звільняються в результаті деструкції бактеріальних клітин і реагують позитивно з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки в реакції Асколі.

3.1. Вивчення токсинпродукуючих властивостей різних мікробів роду Bacillus

Основною відмінною рисою мікробних клітин збудника сибірки, крім вірулентних властивостей, є їх здатність під час розмноження in vivo та in vitro виробляти і виділяти за межі клітинної оболонки (в кров, рідке живильне середовище) продукт свого метаболізму - екзотоксин. Виділення екзотоксину відбувається під час вирощування як в нерухомому живильному середовищі, так і в середовищі, яке перемішується або протікає через бактеріальну масу. Активність виділення екзотоксину сибірковими бацилами та його кількість в культуральній рідині під час вирощування мікробів залежать від повноцінності середовища за складом поживних речовин, вірулентності мікроба, кількості бактеріальних клітин в інокуляті, що вноситься на одиницю об'єму середовища та подовженості культивування в часі. Навіть різні вакцинні штами збудника сибірки, які, казалось би, повинні продукувати однакову кількість екзотоксину під час вирощування в ідентичних умовах, продукують різну його кількість. Найбільш активним продуцентом є, спеціально відселекційований за цією ознакою, вітчизняний вакцинний штам К-79Z збудника сибірки. Незважаючи на те, що вирощування мікробів різних штамів збудника сибірки здійснювалось в різних за складом поживних речовин середовищах, вітчизняний штам (К-79Z) в таких же умовах продукував на 2-5 порядків більше екзотоксину, ніж зарубіжні вакцинні штами (55 ВННИВВиМ, 34F2). Найкраще і найбільше продукують мікроби сибірки екзотоксину під час вирощування в середовищі 199. За кількістю отриманого екзотоксину найближче до середовища 199 знаходиться бульйон Хоттінгера. Для порівняння за цією ознакою, були досліджені не тільки мікроби вакцинних штамів збудника сибірки, але і мікроби восковидної та сінної паличок. За своїми тінкторіальними і культурально-морфологічними ознаками ці види дуже схожі між собою. Встановлено, що ці сапрофітні бацили під час вирощування в однакових із збудником сибірки умовах та на ідентичних середовищах, не продукують за межі клітинної оболонки метаболітів, які можуть бути виявлені за допомогою преципітуючої сибіркової сироватки.

Популяція мікроорганізмів може розмножуватись довгий час без лізису окремих клітин (Г.В.Дунаєв,1972), якщо забезпечити необхідні умови вирощування (надходження свіжого поживного середовища, видалення продуктів метаболізму, наявність життєвого простору тощо). Такі умови забезпечує метод інкубації мікробів в протікаючому через бактеріальну масу поживному середовищі. Вирощування Bac. аnthracis, Bac. cereus і Bac.anthracoides за такою методикою ще раз підтвердило, що збудник сибірки продукує в культуральну рідину екзотоксин. Мікроби спороутворюючих сапрофітів (Bac. cereus, Bac.anthracoides) таких метаболітів не продукують, тому реакція преципітації з їх культуральною рідиною негативна.

Таким чином, експериментально доведено, що під час виготовлення антигену шляхом термічної деструкції бактеріальних клітин збудника сибірки і окремих видів ґрунтових аеробних бацил, у виготовленому антигені залишаються групоспецифічні білки соми бактеріальних клітин, які реагують позитивно з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки. Антигени, виготовлені з культуральних рідин цих мікроорганізмів, не містять групоспецифічних білків. Отже культуральна рідина вакцинного штаму Bac. anthracis K-79Z, яка містить специфічні для цього виду протеїни, придатна для виготовлення антигену сибіркового стандартного.

3.2 Характеристика штаму Bac. anthracis К-79Z - продуцента екзотоксину

За морфологічними, культуральними і тінкторіальними ознаками штам Bac. anthracis К-79Z не має якихось тільки йому властивих ознак в порівнянні з штамами СТИ-1 та 55. Штам Sterne 34F2 має відповідні особливості в будові колоній, вирощених на МПА. Антигени, виготовлені, як з автоклавованої бактеріальної маси, так із фільтрату культуральної рідини, дають позитивну реакцію преципітації з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки. Однак, кількість (титр) антигену в культуральних рідинах цих штамів не однакова. Із всіх досліджених нами вакцинних штамів ( К-79Z, ІВМ 97Z, 55, 34F2) вітчизняний штам К-79Z має найменшу залишкову вірулентність. Він патогенний лише для білих мишей масою 16-18 г. в дозі 4-8 млн. мікробних клітин. Всі інші вакцинні штами мають значно більшу патогенність для цього ж виду тварин: в 2-100 разів. Штам К-79Z не патогенний для морських свинок, кролів, сільськогосподарських тварин. Одноразове щеплення морських свинок в дозі 10,0-12,5 млн. живих спор створює у них напружений імунітет проти двох летальних доз вірулентного штаму Bac. anthracis ІВМ-97Z під час контрольного зараження. В дозі 20,0-25,0 млн. живих спор створює у сільськогосподарських тварин протисибірковий імунітет строком не менше 12 місяців. Штам К-79Z є виробничим штамом для виготовлення вітчизняної живої протисибіркової вакцини та антигену сибіркового стандартного.

Із всіх взятих в дослід вакцинних штамів, штам К-79Z під час вирощування в однакових умовах, на таких же рідких поживних середовищах, більш активно нарощує бактеріальну масу та продукує на 2-5 порядків більше екстрацелюлярного токсину.

Зберігають штам К-79Z у вигляді суспензії спор консервованих 30% гліцерином, при 4-80 С або ліофільно висушеної і запаяної в ампули бактеріальної маси (таблетка). Для виконання науково-дослідних робіт дозволяється зберігати штам на косячках МПА в холодильнику, в пробірках під гумовою пробкою. Таку культуру пересівають один раз на 6 місяців.

Вперше для виготовлення антигену сибіркового стандартного запропоновано використовувати культуральну рідину цього штаму, яка містить екзотоксин у відповідному титрі специфічного білку.

4. Вивчення бактеріальних антигенів, виготовлених із різних видів мікробів роду Bacillus

Антигени виготовляли за методикою С.Г. Колєсова (1976) з вірулентних (Bac.anthracis K-79Z) і авірулентних (вакцинних) штамів збудника сибірки, та окремих видів ґрунтових аеробних бацил. Встановлено, що бактерійні антигени з сибіркових і ґрунтових аеробних бацил, однаково реагують з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки як в нативному вигляді, так і в розведенні 1:3000 - 1:10000. Позитивна реакція преципітації обумовлена наявністю в сомі сибіркових і сапрофітних аеробних бацил групоспецифічних білків, які звільняються після руйнування клітин під час виготовлення антигенів. Дослідження антигенів за реакцією дифузної преципітації в агаровому гелі показали, що антиген стандартний сибірковий виробництва Тобольської біофабрики, а також бактерійні антигени, виготовлені нами з вірулентних та авірулентних мікробів сибірки шляхом автоклавування, не є достатньо специфічними антигенами властивими лише для збудника сибірки. Такі ж білки соми бактеріальних клітин містяться і в антигенах, виготовлених таким же способом, з бактерійної маси окремих видів ґрунтових аеробних бацил. Про це свідчить наявність ідентичних ліній преципітації як у стандартного сибіркового антигену, так і в антигенах, виготовлених з мікробної маси сибіркових і сапрофітних аеробних бацил.

5. Вплив екзотоксину (антигену) вакцинного штаму Bac. аnthracis K-79Z на клітинний фактор імунітету тварин

Отримавши екзотоксин збудника сибірки в максимально чистому вигляді, за методикою авторського свідоцтва № 1022362, ми вирішили дослідити його вплив на клітинний фактор імунітету, який має пряме відношення до формування протисибіркового імунітету у щеплених вакциною чи перехворілих сибіркою тварин та визначити його нешкідливість для організму білих мишей.

Це завдання вирішували за допомогою реакції гіперчутливості сповільненого типу. Після одночасної ін'єкції тест-антигену (еритроцити барана) і досліджуваного антигену (екзотоксин Bac. anthracis K-79Z), в організмі тварин формується гіперчутливість сповільненого типу, яка проявляється реакцією на місці ін'єкції досліджуваного антигену.

Встановлено, що екстрацелюлярний токсин збудника сибірки є активним стимулятором клітинного фактора імунітету і може застосовуватись в комплексі з іншими антигенами для підсилення їх впливу на імунну систему тварин. Культуральна рідина вакцинного штаму К-79Z збудника сибірки з титром специфічного сибіркового білку 1:128 - 1:256 нешкідлива для організму тварин. Після ін'єкції вона не спричиняє місцевої та загальної реакції у білих мишей і морських свинок, та їх загибель.

4. Аналіз і узагальнення результатів дослідження

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукового завдання, що виявляється в розробці принципово нової технології виготовлення антигену сибіркового стандартного - невід'ємного компонента при встановленні діагнозу на сибірку методом серологічних досліджень (реакція Асколі, диск-преципітації). Основним недоліком відомої технології (С.Г. Колєсов,1976) є робота з вірулентним штамом збудника сибірки, яка завжди тамує небезпеку зараження людей і довкілля. Розроблена нами технологія передбачає роботу з вакцинним, авірулентним штамом Bac. anthracis K-79Z, зокрема з його стерильним фільтратом культуральної рідини, яка містить екзотоксин - специфічний антиген збудника сибірки. Аналіз епізоотичної ситуації і об'ємів діагностичних лабораторних досліджень з сибірки в Україні за останні десять років (1991-2000) показав, що ця недуга продовжує спричиняти захворювання і загибель тварин і вимагає підвищеної уваги щодо профілактики та своєчасного і достовірного встановлення діагнозу. Наші дослідження були направлені на вирішення проблеми забезпечення потреб держави антигеном сибірковим стандартним - невід'ємним компонентом при встановленні діагнозу з сибірки.

штам сибірка антиген

Висновки

Розроблено нову екологічно безпечну, енергозберігаючу та нешкідливу для здоров'я людей вітчизняну технологію виготовлення антигену сибіркового стандартного. Освоєно його виробництво та впроваджено в роботу діагностичних лабораторій ветеринарної медицини України. Розроблено і затверджено Державним департаментом ветеринарної медицини України нормативну документацію (ТУУ, інструкція) на виготовлення і контроль антигену сибіркового стандартного.

Вперше для виготовлення антигену сибіркового стандартного використано стерильний фільтрат культуральної рідини авірулентного (токсинпродукуючого), вакцинного штаму К-79Z збудника сибірки, який містить екстрацелюлярний токсин цього штаму.

Сучасна епізоотична ситуація щодо сибірки характеризується спорадичними спалахами захворювання переважно серед великої рогатої худоби віком 6-18 місяців та хутрових звірів.

В Україні на протязі 1991-2000рр. сибіркою захворіло 1338 тварин (ВРХ-458, ДРХ-82, свині-16, коні-1, хутрові звірі-781 гол.) в 169 населених пунктах. Концентрація неблагополучних з сибірки пунктів, сезонність прояву (літо-осінь) недуги, функціональна подовженість епізоотичних вогнищ обумовлені біологічними властивостями збудника та ландшафтно-кліматичними умовами природних зон.

Контроль за перебігом сибірки в Україні та попередженням розповсюдження інфекції серед тварин за межі епізоотичного вогнища здійснюється державними лабораторіями ветеринарної медицини, які щорічно проводять біля двох мільйонів діагностичних досліджень за реакцією преципітації, для постановки якої використовують антиген сибірковий стандартний.

Антиген сибірковий стандартний, виготовлений шляхом термальної деструкції мікробів збудника сибірки та антигени, виготовлені за такою ж технологією з окремих видів ґрунтових аеробних бацил реагують позитивно в реакції преципітації з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки.

Антиген сибірковий стандартний, виготовлений за новою технологією з культуральної рідини збудника сибірки, реагує позитивно в реакції преципітації (Асколі, РДП, диск-преципітація) з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки. Антигени, виготовлені за такою ж технологією з культуральних рідин окремих видів ґрунтових аеробних бацил не реагують з антитілами преципітуючої сибіркової сироватки.

Пропозиції виробництву

При дослідженні матеріалу на сибірку за реакцією преципітації, контроль преципітуючої сибіркової сироватки необхідно здійснювати за допомогою антигену сибіркового стандартного вітчизняного виробництва.

Для охорони здоров'я людей та запобігання забруднення вірулентним збудником сибірки довкілля, виробництво і стандартизацію антигену сибіркового стандартного необхідно проводити за розробленою нами технологією, дотримуючись вимог інструкції на виготовлення і контроль якості та технічних умов (ТУУ 46.15.181-99).

В стаціонарно неблагополучних щодо сибірки пунктах запобіжні щеплення молодняку великої рогатої худоби необхідно розпочинати з 60-денного віку вакциною із штаму К-79Z. Всіх дорослих чутливих до сибірки тварин імунізувати цією ж вакциною двічі на рік - весною і осіню.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Завірюха Г.А. Токсинпродукуючі властивості збудника сибірки і застосування його метаболітів в діагностиці захворювання // Вісник Сумського Державного аграрного університету.-Суми.-1999.-Вип. 4.-С.80-82

Завірюха Г.А. Вплив умов культивування на вироблення токсину вакцинним штамом К-79Z збудника сибірки // Науковий вісник Львівської Державної ветеринарної академії ім. С.З. Гжицького.-Львів.-2000.-Т.2.-ч.1.-С.58-60.

Завірюха Г.А., Пліска Н.І. Диференціальна діагностика збудника сибірки від сибіркоподібних бацил // Вісник Білоцерківського Державного аграрного університету.-Біла Церква.-1999.-Вип. 9.-С.66-68.(Дисертантка провела диференційну діагностику збудника сибірки)

Завірюха А.І., Завірюха Г.А., Гопка Т.Б., Козій Р.С. Вакцинопрофілактика та імунітет при гастроентеритах телят // Ветеринарна медицина України.-1999.-№ 12.-С.18-19. (Дисертантка отримала необхідну кількість екзотоксину вакцинного штаму К-79Z, виготовила Бовітокс, прийняла участь у проведенні дослідів та зробила висновки)

Завірюха А.І., Завірюха Г.А., Пліска Н.І. Особливості диференційної діагностики збудника сибірки та перспектива вирішення проблеми // Ветеринарна медицина України.-2000.-№ 12.-С.20-21. (Дисертантка провела дослідження з порівнянням методів діагностики )

Завірюха Г.А. Нова технологія виготовлення антигену сибіркового стандартного // Матеріали науково-практич. конф. молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення.,” Київ,2000 // Ветеринарна медицина . Міжвідомчий тематичний науковий збірник.-Харків.-2001.-Вип.79.-Т.1.-С.133-136.

Завирюха Г.А. Совершенствование серологической диагностики сибирской язвы // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных. Материалы междунар. Научно-практич. конф.- Минск.:Хата.-2000.-С.99-100.

Завірюха А.І., Завірюха Г.А. Екзотоксини патогенних мікроорганізмів і їх роль у формуванні імунітету // Актуальні проблеми ветеринарної фармакології, токсикології. Збірник наукових праць Першої Всеукраїнської науково-методичної конференції ветеринарних фармакологів і токсикологів.-Київ.-1998.-С.52.(Дисертантка виготовила антиген, провела дослідження і узагальнення результатів).

Завірюха А.І., Завірюха Г.А., Пліска Н.І. Антиген сибірковий стандартний // ТУУ 46.15.381-99. Держстандарт України. УкрЦСМ; зареєстровано 07.12.1999р. в книзі обліку за № 081/023958.

Завірюха А.І., Завірюха Г.А., Пліска Н.І. Інструкція з виготовлення і контролю антигену сибіркового стандартного // Українська академія аграрних наук . Інститут ветеринарної медицини; від 21 грудня 1999р.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены