Біологічні властивості та індикація вірусу інфекційної анемії коней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 578.825.1. 578.831.1

03.00.06. - вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Біологічні властивості та індикація вірусу

інфекційної анемії коней

Матвієнко Наталія Миколаївна

Київ-2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вірусології Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, Старчеус Анатолій Павлович, Інститут ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, завідувач лабораторією вірусології

Офiцiйнi опоненти:

доктор біологічних наук, професор Бучацький Леонід Петрович, провідний науковий співробітник Київського національного університету імені Тараса Шевченка

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Дерябіна Олена Григорівна, провідний науковий співробітник сектору гібридомних технологій та генної інженерії Інституту ветеринарної медицини

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України.

Захист дисертації відбудеться "11" червня 2002 року о 14 годинi на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корп. 12, ауд. 215

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "7" травня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.

Анотації

Матвієнко Н.М. Біологічні властивості та індикація вірусу інфекційної анемії коней. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю - 03.00.06 - вірусологія. - Київський Національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертація присвячена дослідженню біологічних особливостей вірусу інфекційної анемії коней. Представлені результати порівняльного вивчення референтних штамів вірусу інфекційної анемії коней: EIA P 337 V 26 13 і Wyoming W 40 та ізолятів вірусу, які виділені від коней господарств Черкаської - З 14261/97, Ч 17714 /01 та Сумської - С 14378/98 областей. Досліджено особливості культивування вірусу інфекційної анемії коней. Вивчено цикл репродукції вірусу ІНАН в чутливих біологічних системах. Змодельована інфекція на природно чутливих тваринах та проведена гістологічна оцінку ураження організму під дією вірусу, встановлені біохімічні зміни в сироватці крові хворих коней.

У роботі представлені методичні підходи з використання реакції імунофлуоресценції для індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней. Вперше в Україні розроблена тест-система для індикації вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл. Проведено аналіз діагностичної ефективності методу флуоресціюючих антитіл з існуючими лабораторними тестами. кінь вірус анемія

Ключові слова: інфекційна анемія коней, ізоляти, ФІТЦ-кон'югат, флуоресценція, діагностика, реплікація, антиген, антитіла, сироватки.

Матвиенко Н.М. Биологические свойства и индикация вируса инфекционной анемии лошадей. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности - 03.00.06 - вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена исследованию биологических особенностей вируса инфекционной анемии лошадей. Представлены результаты сравнительного изучения референтных штаммов вируса инфекционной анемии лошадей: EIA P 337 V 26 13, Wyoming W 40 и изолятов вируса, которые выделены от лошадей хозяйств Черкасской - З 14261/97, Ч 17714/01 и Сумской - С 14378/98 областей. Исследованы особенности культивирования вируса инфекционной анемии лошадей. Изучен цикл репродукции вируса ІНАН в чувствительных биологических системах. Смоделирована инфекция на естественно чувствительных животных и проведена гистологическая оценка поражения организма под действием вируса, установлены биохимические изменения в сыворотке крови больных лошадей.

В работе представлены методические подходы по использованию реакции иммунофлуоресценции для индикации антигена вируса инфекционной анемии лошадей. Впервые в Украине разработана тест-система для индикации вируса инфекционной анемии лошадей методом флуоресцирующих антител. Проведен анализ диагностической эффективности метода флуоресцирующих антител с существующими лабораторными тестами.

Ключевые слова: инфекционная анемия лошадей, изоляты, ФИТЦ-коньюгат, флуоресценция, диагностика, репликация, антиген, антитела, сыворотки.

N.M. Matvienko. Biological characteristics and indication of the equine infectious anemia virus.- Manuscript.

The thesis for Ph.D. degree (biology) in specialized field - 03.00.06 - Virology. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

The thesis concerns a study of biological characteristics of the equine infectious anemia (EIA) virus. The results of comparative studies of equine infectious anemia virus referent strains: EIA P 337 V 26 13 and Wyoming W 40 and virus isolates from horses originated from the farms in Cherkasy region -Z 14261/97, CH 17714/ 01 and Sumy region-S 14378/98 hove been presented. The physical and chemical features of the isolates hove been studied. It was stated established that the isolates strains do not differ by their physical and chemical characteristics from the referent strains. The obtained data serve a ground for the further study of biological and molecular characteristics of EIA virus strains circulating on the territory of Ukraine.

The properties of equine infectious anemia virus cultivation have been investigated. The reproduction cycle of the EIA virus in sensitive biological systems has been studied. The infection has been simulated in naturally sensitive animals. The relationship between the disease stage, virus reproduction and appearance of clinical signs has been established. The immune response is associated with permanent viremia facilitating the development of circulating immune complexes "antigen-antibody". In their turn immune complexes induce fever and organs' lesions. Thus, anemia in EIA is caused by erythrocytes' hemolysis and the bone marrow hemopoiesic function reduction. The organs' lesions in foal occur as a result of immune response of lymphocytes to virus infected cells. A histological evaluation of the organism damage caused by the virus has been mode, biochemical changes in the sick horse blood serum have been established.

The obtained data will promote the study of prolonged virus persistence mechanism and the disease periodical relapses, as well as the possibility of this disease efficient prophylaxis.

Methodical approaches in the application of immunofluorescence test for EIA virus antigen indication are presented in this work. For the first time in Ukraine a test-system for indication of infectious anemia virus using the method of fluorescent antibodies has been developed. The analysis of the fluorescent antibodies method diagnostic efficiency has been made with existing development laboratory tests.

Introducing the fluorescent antibodies method for indication of infectious anemia virus antigen into the practice of veterinary medicine laboratories will considerably increase the efficiency of horses examination and serologic diagnosis of the infectious equine anemia in Ukraine.

Key words: equine infectious anemia, isolates, FITС-conjugate, fluorescence, diagnosis, replication, antigen, antibodies, sera.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Важливе місце серед питань сучасної вірусології посідають повільні інфекції людини та тварин. Ця проблема викликає особливий інтерес через те, що в основі розвитку повільної інфекції покладені порушення генетичних, імунологічних і фізіологічних механізмів, які забезпечують довготривалу персистенцію вірусу в організмі та різноманіття форм інфекційного процесу. Разом з тим, вивчення повільних інфекцій дасть змогу зрозуміти молекулярний механізм, що визначає уповільнений характер патологічного процесу. Здатність вірусу до підтримання різних форм персистенції є важливим екологічним механізмом, що сприяє збереженню збудника як виду. Отже, діапазон проблем, що спричиняються персистенцією вірусів, надзвичайно широкий і потребує пильної уваги та подальшого вивчення. На сьогодні серед повільних інфекцій тварин досить поширеною є інфекційна анемія коней (ІНАН). Біологічні особливості вірусу інфекційної анемії коней, а зокрема суттєві труднощі при культивуванні в умовах in vitro, нечутливість лабораторних тварин до вірусу значно утруднює вивчення циклів розмноження, динаміку накопичення вірусу, вивчення локалізації в органах і тканинах ураженого організму. Не маючи задовільного методу титрування вірусу інфекційної анемії, надзвичайно важко розробити і контролювати технологічні параметри отримання вірусної сировини. На сьогоднішній день в Україні не існує жодного методу індикації антигену в культуральній системі, що надзвичайно важливо для виробництва діагностичних препаратів.

Не дивлячись на те, що за останні роки досягнуто певних успіхів у вивченні хвороб коней та вдосконалення заходів боротьби з ними, є ще багато не вирішених питань. Не повністю вивчене поширення захворювання на інфекційну анемію коней в Україні, не розроблені підходи до прогнозування та профілактики.

Лабораторна діагностика з використанням загальноприйнятих серологічних методів не дає очікуваних результатів. Не проводиться експрес-діагностика для виявлення антигену вірусу ІНАН. Своєчасне виявлення вірусу серед поголів'я коней, дозволить суттєво зменшити втрати та зберегти кошти, а для цього необхідна досконала лабораторна діагностика. За даними канадських та американських фахівців, які займаються вивченням цього захворювання [Sugiura T., Matsumura T., Fukunaga М., 1986 та Neurath A., Strick N., 1990], найбільш чутливими, швидкими та специфічними методами діагностики є реакція імунофлуоресценції (РІФ) та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Але придбання діагностичних наборів для їх виконання нашими спеціалізованими лабораторіями практично не можливе, оскільки їх ціна досить висока. Отже, в сучасних умовах для ефективної діагностики та профілактики інфекційної анемії коней в Україні нагальною потребою є створення та виробництво вітчизняного набору для виявлення антигену вірусу ІНАН в реакції імунофлуоресценції, який би задовольнив більшість лабораторій, що займаються такими дослідженнями. Це зумовило вибір теми роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в плані державного завдання Інституту ветеринарної медицини УААН згідно з тематикою " Розробити ефективну систему діагностики, терапії і профілактики інфекційних хвороб коней" з 1.01.1996 року до 30.12.2000 року

№ 01297u012747 та № 79/1 "Розробити засоби і методи діагностики інфекційної анемії коней" від 04.01.2001 року, № 0101u002655.

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було вивчення біологічних властивостей вірусу, особливостей інфекційного процесу при ІНАН коней, розробка і впровадження методів для діагностики захворювання на ранніх етапах, виявлення локалізації вірусу ІНАН в органах та тканинах коней за допомогою реакції імунофлуоресценції, а також проведення порівняльної оцінки методу з існуючими лабораторними тестами.

Для досягнення поставленої мети потрібно було вирішити такі завдання:

вивчити цикл репродукції вірусу ІНАН в чутливих біологічних системах та дати морфологічну характеристику вірусу;

дослідити особливості культивування вірусу інфекційної анемії коней;

змоделювати інфекцію на природно чутливих тваринах та провести гістологічну оцінку ураження організму під дією вірусу;

визначити біохімічні зміни в крові хворих коней;

розробити тест-систему для індикації вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл;

порівняти діагностичну ефективність методу флуоресціюючих антитіл з існуючими лабораторними тестами (РДП, РЗК, ІФА).

Об'єкт дослідження - вірус інфекційної анемії коней.

Предмет дослідження - біологічні властивості вірусу інфекційної анемії коней.

Методи досліджень - включали метод біологічного тестування з використанням культури клітин та чутливих тварин, клінічні (хворі на інфекційну анемію коні), визначення гематологічних та біохімічних показників крові хворих тварин, вірусологічні та серологічні (індикація антигену вірусу інфекційної анемії коней).

Наукова новизна роботи. Проведено виділення в Україні місцевих ізолятів вірусу ІНАН, вивчені фізико-хімічні та деякі біологічні властивості цих ізолятів. Зроблена їх порівняльна оцінка з референтними штамами вірусу ІНАН. Отримані результати дають можливість підібрати штами для виробництва діагностичних та вакцинних препаратів. Одержано нові практичні дані щодо вивчення таких теоретичних питань, як латенція та персистенція при ІНАН коней та інших повільних інфекціях родини Retroviridae.

Вперше був розроблений і запропонований для впровадження в повсякденну практику метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней за допомогою РІФ, впровадження якого в практику лабораторій ветеринарної медицини дозволить значно підвищити рівень обстеження коней та проводити серологічну діагностику інфекційної анемії коней в Україні.

Запропонована модифікована реакція імунофлуоресценції є високочутливою, специфічною та придатною для проведення масових досліджень на інфекційну анемію коней.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней з одного боку розширює набір методів діагностики при цій хворобі, а з іншого боку дає можливість швидко ідентифікувати вірус ІНАН, який циркулює на цей час серед поголів'я досліджуваних коней. Вивчені імунобіологічні властивості будуть корисними при виробництві препаратів для діагностики та профілактики ІНАН.

На запропонований метод складена нормативно-технічна документація, яка після її затвердження, дозволить налагодити виробництво діагностичних наборів.

Методика постановки реакції викладена у "Методиці постановки реакції для індикації антигену вірусу ІНАН", яка розглянута Методичною комісією та затверджена Вченою радою ІВМ УААН від 14 грудня 2001 року. Запропоновано використовувати цей метод в наукових та практичних дослідженнях.

Отримані наукові дані можуть бути використані в навчальних курсах університетів з вивчення біологічних властивостей вірусів тварин.

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробка схеми експериментів, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретація автором здійснені особисто. Результати дослідження з отримання компонентів для РІФ здійснені спільно з науковими співробітниками лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України, гістологічні дослідження здійснені з участю наукових співробітників кафедри патологічної анатомії Національного аграрного університету.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та апробовані на:

засіданнях Вченої ради ІВМ УААН 1997-2001 рр.(з розгляду матеріалів річних звітів і за результатами аспірантури);

науково-практичній конференції "Зооантропонозні хвороби, засоби профілактики і боротьби" (23-24 жовтня 1997 р., м. Гродно);

ІІ Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (7-10 вересня, 1998 р., м. Київ);

Конференції молодих вчених, м. Суми (1998 р.);

ІІ (ІХ) з'їзді українського мікробіологічного товариства (2000 р, м. Чернігів);

Всеукраїнській конференція молодих вчених "Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення" (11 жовтня 2000 р., м. Київ);

ІІІ Міжнародному Симпозіумі "Україна-Австрія. Сільське господарство: наука і практика" (14-16 вересня 2000 р., м. Чернівці);

Проведені міжлабораторні комісійні випробування "Метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл", які оформлені відповідними документами.

Публікації. Основні положення роботи викладені в 6 статтях, із них 4 надруковані у фахових виданнях.

Структура і обсяг роботи. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 140 сторінках машинописного тексту і містять вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, експериментальну частину, результати роботи та їх обговорення, висновки, список використаних джерел та додатки. Список літератури охоплює 211 найменувань, із них 145 - іноземні.

Огляд літератури

Огляд літератури складається з розділів, в яких наведені дані останніх років стосовно вивчення біологічних властивостей вірусу інфекційної анемії коней. Висвітлені питання розповсюдження захворювання серед поголів'я коней у світі та на Україні. Обговорюються питання лабораторної діагностики інфекційної анемії коней.

Матеріали і методи досліджень

Об'єктом дослідження були референтні штами вірусу інфекційної анемії коней: EIA P 337 V 26 13, надісланий з Японії, і Wyoming W 40, надісланий з США, та ізоляти вірусу виділені від коней із господарств Черкаської - З 14261/97, Ч 17714/01 та Сумської - С 14378/98 областей та адаптовані до культури лейкоцитів коня.

Робота проводилась на базі Інституту ветеринарної медицини УААН в лабораторії вірусології, в лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України, в лабораторії гістології кафедри патологічної анатомії Національного аграрного університету.

При вивченні фізико-хімічних властивостей вірусу досліджували вплив хлороформу, зміни рН, підвищеної температури та іонів магнію на інфекційну активність. У випадку чутливості вірусу до хлороформу спостерігали відсутність цитопатичної дії (ЦПД) вірусу, обробленого хлороформом, при наявності ЦПД у флаконах, де знаходився не оброблений хлороформом вірус. Готували буферні розчини з рН від 4,0 до 9,0. Про ступінь впливу рН на інфекційну активність вірусу робили висновок за різницею в титрах інфекційності вірусу до та після обробки. Про дестабілізуючу дію іонів магнію судили із зниження чи відсутності зниження інфекційності вірусу при прогріванні в присутності MgCl2 в порівнянні з титром вірусу, прогрітого без нього.

Для дослідження морфології віріонів використовували метод негативного контрастування. Препарати досліджували в електронному мікроскопі TESLA (виробництва Чехії) при експериментальному збільшенні 50000.

Культивування вірусу інфекційної анемії коней в культурі лейкоцитів коня та нирки ембріону коня здійснювали за модифікованими нами методиками.

До суспензії лейкоцитів додавали фітогемаглютінін (ФГА)-PHITOHMAGGLUTININ M, фірми "Seromed®", Німеччина. Для культивування використовували пеніцилінові флакони та чашки Кареля. Культуру вирощували в атмосфері, що містила 2% вуглекислого газу.

Для отримання первинно-трипсинізованих та субкультур використовували нирки ембріонів коня віком 7-10 місяців. Одержання культури проводили за методом дезагрегації тканини при обробці трипсином згідно рекомендацій Р.В. Білоусова. Культивування проводили в матрасах об'ємом 50 та 100 см 3. Життєздатність клітин визначали за допомогою фарбування 0,4%-ним розчином три панового синього. За зміною морфології клітин спостерігали при щоденному прогляданні флаконів під світловим мікроскопом, використовуючи збільшення 8, 40.

Для гістологічного дослідження відбирали шматочки від уражених тварин з печінки, селезінки, серця, лімфатичних вузлів та нирок. Відібрані шматочки поміщали у 10% нейтральний розчин формаліну. Фіксували впродовж місяця. Гістологічні препарати готували за методикою Потоцького М.К., виготовлення гістологічних зрізів проводили на санному мікротомі та наклеювали їх на предметні скельця. Фарбували гістологічні зрізи гематоксиліном Караці та еозином. Для гістохімічного виявлення заліза препарати фарбували за Перлсом. Зміни виявляли, проглядаючи препарати під світловим мікроскопом. Пігменти, що містили залізо, забарвлювались в блакитний колір (берлінська лазур), ядра - в червоний.

Гематологічні дослідження проводили за стандартними методиками з використанням камери Горяєва та гемометра Салі (Кондрахін І.П., 1985).

При вивченні біохімічних показників крові вміст загального білка визначали на рефрактометрі за рефракцією сироватки крові, тобто за визначенням коефіцієнту заломлення пучка променя в сироватці крові коней. Визначення білкових фракцій в сироватці крові проводили нефелометричним методом.

Визначення антитіл до вірусу інфекційної анемії коней в сироватках крові коней проводили за допомогою реакції дифузної преципітації (РДП) з використанням набору "Антиген и антисыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей в РДП" Щолківського біокомбінату ТУ 46-21-379-77.

На підставі одержаних даних були сформовані дослідні та контрольні групи.

Постановку реакції імунофлуоресценції здійснювали за модифікованою нами методикою.

Виділення імуноглобулінів із сироваток крові та отримання ФІТЦ-кон'югату проводили за методиками, розробленими та вдосконаленими в лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України. Використовували флуоресцеїнізотіоціанат (ФІТЦ) - FITC- FW 3894, F -3651, lot 79H 5070, виробник фірма "Sigma". Після закінчення процесу кон'югації в реакційній суміші могли міститись залишки ФІТЦ, органічні розчинники та солі буферних розчинів. Ці залишки є однією з причин неспецифічного світіння при фарбуванні досліджуваних препаратів. Для очищення кон'югату використовували колонку з сефадексом різних дисперсних форм (G 50, G 25). Були підібрані оптимальні умови проходження кон'югату через колонку, що дозволило скоротити втрати білка до мінімуму.

Повноту очистки препарату визначали методом висхідної хроматографії на папері (Перадзе Т.В., 1985).

Для підтвердження специфічності ФІТЦ-кон'югату визначали вміст білка, співвідношення барвника та білка та досліджували його в реакції імунофлуоресценції.

Статистичні методи обробки результатів дослідження - варіаційний та кореляційний аналізи (Сепетлієв Д.,1968, Колемаєв В.,1991).

Матеріал документували мікрофотографіями.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Аналіз захворювання коней на інфекційну анемію в Україні

В Україні захворювання коней на інфекційну анемію реєструється в 10 областях. Найбільший відсоток ураження поголів'я відмічено в північних Поліських областях, зокрема в Волинській, Житомирській, Рівненській та Черкаській. Загалом по Україні в 1998 році на 11934 обстежених коней зафіксовано 1,40 % хворих тварин, в 1999 на 7866 обстежених - 0,70 %, а в 2000 на 8693 обстежених - 0,64 %, що свідчить про низький рівень діагностичних та профілактичних заходів

Поголів'я коней в Україні з 1993 року до 2000 року зросло з 750 тис. до 900 тис. тварин, а об'єм серологічних досліджень зменшився з 2,04% до 0,96%. Така ситуація сприяє стійкому збереженню вогнищ вірусу ІНАН

При аналізі наведених даних відмічається стійка тенденція до зменшення кількості діагностичних досліджень. Перш за все, це пов'язано з тим, що для проведення діагностичних досліджень використовується лише РДП, а в Україні виробництво цих діагностикумів відсутнє. Значна кількість коней зосереджена в приватних та фермерських господарствах, які через брак коштів не можуть придбати діагностикуми для обстеження коней на вірусні інфекції.

Таким чином, надзвичайно низький рівень обстеження наявного поголів'я коней не дає можливості об'єктивно оцінити ситуацію щодо розповсюдження захворювання на ІНАН. При аналізі ситуації в окремих господарствах відмічено, що хвороба, з'явившись, згодом реєструється постійно, що сприяє стійкому збереженню вогнищ та широкому розповсюдженню вірусу серед наявного поголів'я коней.

2. Репродукція вірусу інфекційної анемії коней в чутливих культурах клітин

З метою вивчення чутливості вірусу та підбору оптимальних умов культивування використовували культуру лейкоцитів коня та первинно-трипсинізовану культуру нирки ембріону коня.

Вірус, адаптований до первинно-трипсинізованої культури нирки ембріону коня, культивували впродовж 54 днів. Розмноження та накопичення вірусу в культурі проходило без видимих морфологічних змін, тому індикація вірусу проводилась з використанням РІФ. Експериментально підтверджено, що РІФ є високочутливим методом для виявлення вірусу в цій системі. Максимальна концентрація вірусу відмічена на 5-7 пасажі, що відповідає 25-35 добі культивування. Отримані дані дозволяють використовувати цю культуру клітин для індикації, накопичення та вивчення біологічних властивостей вірусу ІНАН.

Для адаптації вірусу до культури лейкоцитів коня було проведено 7 сліпих пасажів строком культивування до 7-10 діб.

З метою встановлення можливої цитопатичної дії вірусу на культуру, проводили щоденні спостереження під малим збільшенням світлового мікроскопу, порівнюючи заражені культури з контролями. При цьому звертали увагу на морфологію клітин, строки прикріплення і відшарування їх від скла, тривалість життя та інші зміни.

Гіпертрофія клітин відмічалась протягом 2-10 діб культивування: клітини втрачали округлу форму, у частини із них з'являлись виступи цитоплазми (псевдо події). На 5 добу культивування відбувалось незначне розрідження моношару клітин, деякі з них зморщувались і відшаровувались від скла, інші лишались на склі, але були нежиттєздатними. До кінця строку культивування (10 доба) 50% клітин, що прикріпились до скла, були нежиттєздатні. Результати експерименту наведені у таблиці 1

Таблиця 1 Характер цитопатичної дії вірусу ІНАН в культурі лейкоцитів коня

Час культивування

Флакони з культурою

(години)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

К

К

К

0-24

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

24-48

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

48-72

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

_

72-96

_

+

_

_

+

_

_

+

_

_

_

_

96-120

_

+

+

_

_

+

_

_

+

_

_

_

_

120-144

_

+

+

+

_

+

+

_

+

+

_

_

_

144-168

_

+

+

+

_

+

+

_

+

+

_

_

_

168-192

+

+

+

+

_

+

+

_

+

+

_

_

_

192-216

+

+

чс

+

+

чс

+

+

чс

+

чс

чс

_

216-240

с

с

с

с

Чс

с

чс

с

с

с

с

с

с

Примітка: " -" - відсутність змін у клітинах; " +" - наявність ЦПД; чс - часткове сповзання моношару; с - сповзання моношару; К - контроль.

Наявність вірусу ІНАН в культуральному середовищі перевіряли за допомогою РІФ в непрямій модифікації. При дослідженні накривних скелець під люмінесцентним мікроскопом у флаконах, де спостерігалось ЦПД, в цитоплазмі клітин було світіння антигену вірусу з інтенсивністю 3+ та 4+.

Було встановлено, що в культурі лейкоцитів відбувається розмноження вірусу з яскраво вираженою цитопатичною дією. ЦПД характеризувалась зміною морфології клітин зі значними ділянками ураження клітин, аж до повного порушення моношару. Відмічено, що ЦПД проявлялось на 4-10 добу культивування. Зі збільшенням кількості пасажів час прояву ЦПД скорочувався. Встановлено, що культура лейкоцитів коня є найбільш придатною для накопичення вірусу, визначення його титру та дає можливість отримувати антиген для діагностичних досліджень.

3. Моделювання інфекційного процесу на чутливих тваринах

Біологічною особливістю вірусу інфекційної анемії коней є його здатність інтегрувати в геном клітини-господаря, не викликаючи таким чином прояву клінічних ознак хвороби та утворення антитіл в сироватці крові.

Для відтворення інфекційного процесу на тваринах було проведено пошук лабораторних моделей, в яких би відслідковувались характерні клінічні ознаки та виявлені специфічні антитіла до вірусу в сироватці крові. Відібрали курей, кролів, морських свинок та поросят. За піддослідними тваринами проводили спостереження впродовж 240 днів. Лише у кролів та поросят відмічено часткове приживання вірусу, але титр специфічних АТ в РДП до вірусу ІНАН надзвичайно низький, і після 30 дня досліду антитіла не виявлялись. Решта піддослідних тварин нечутлива до вірусу. Для отримання специфічних імунних сироваток необхідно мати титр антитіл до вірусу ІНАН не нижче 1:32. Тому наступні дослідження були проведені на природно чутливих тваринах - конях.

Для відтворення інфекційного процесу використовували лошат 3-х місячного віку. В процесі розвитку хвороби у заражених лошат відмічали характерні клінічні симптоми: рецидивуючу лихоманку, слабкість, жовтушність слизових оболонок. На початку хвороби при першому підйомі температури не було зафіксовано різкого відхилення від норми гематологічних показників. При проведенні щоденних гематологічних досліджень визначали лейкоцитарну формулу крові. Анемія виникала внаслідок пригнічення еритропоезу та лізісу еритроцитів, які піддавались впливу вірусу та були фагоцитовані клітинами ретикулоендотеліальної системи.

Під час дослідження відібраних сироваток крові лошат методом титрування в культурі клітин лейкоцитів коня вірус виявляли за 2-5 днів до першого підйому температури тіла. Величина титру вірусу швидко зростала і зменшувалась паралельно з підйомом і зниженням температури, вірус майже не визначався при її нормалізації. Найбільший титр вірусу (105.16ЦПД 50/0,5 см 3) виявляли при першому підйомі температури, надалі титр вірусу зменшується. При інтенсивній репродукції вірусу відмічене збільшення кількості лейкоцитів та еритроцитів, особливо це характерно у період лихоманки. Надалі, з розвитком інфекційного процесу, ці показники відновлювались до норми.

Наведені дані свідчать про те, що ступінь вираження клінічних ознак захворювання на інфекційну анемію коней корегує з інтенсивністю реплікації вірусу в організмі. Вірус в найвищих титрах визначається на висоті температурної реакції, депонується в печінці, селезінці, клітинах крові та лімфовузлах. Це було підтверджено при проведенні гістологічного аналізу патматеріалу.

4. Гістологічний аналіз змін у органах коней під впливом вірусу інфекційної анемії

При проведенні гістологічного аналізу органів коней, уражених вірусом ІНАН, було встановлено зміни в печінці, селезінці, легенях, лімфатичних вузлах, серці. Ступінь вираженості цих змін залежав насамперед від концентрації вірусу та стадії розвитку інфекційного процесу. Найбільш характерні зміни виявлені в печінці (дифузні проліферати лімфоїдних клітин) та в селезінці (дифузна гіперплазія, різке зменшення гемосидерину). Встановлені зміни можуть бути використані при вивченні динаміки захворювання та його діагностики.

5. Біохімічні показники крові при інфекційній анемії

При проведенні біохімічних досліджень було відмічено, що у коней хворих на ІНАН відбувається різке зменшення білкового коефіцієнту (відношенням між кількістю альбумінів і сумою глобулінів) в порівнянні до такого у здорових тварин. В групі коней з гострою стадією інфекційного процесу, зумовленого вірусом ІНАН, білковий коефіцієнт сироватки крові менше за такий в контрольній групі тварин у 2,3 рази, що вказує на наявність диспротеїнемії.

Вказані зміни свідчать про активну імунологічну реакцію макроорганізму на дію вірусу та можуть мати певне діагностичне й прогностичне значення.

Зазначимо, що згадані біохімічні дослідження можуть бути використані для оцінки ступеню активності запального процесу та для контролю ефективності лікування. Вони можуть мати діагностичну й прогностичну цінність.

6. Характеристика фізико-хімічних властивостей вірусу інфекційної анемії коней

Метою цих досліджень було встановлення додаткових критеріїв для вивчення біологічних властивостей вірусів, виділених від хворих коней, та порівняння їх з референтними штамами вірусу ІНАН, отриманих з США та Японії. Спираючись на існуючі в літературі дані, вивчали вплив на віруси низьких температур, іонів магнію при температурі +40С та +560С, обробки хлороформом та зміни рН. Результати проведених дослідів дають змогу ідентифікувати виділені ізоляти вірусу від хворих коней. За своїми властивостями вони ідентичні референтним штамам P 337 V 26 і Wyoming W 40 вірусу ІНАН.

7. Реакція імунофлуоресценції для індикації антигену вірусу ІНАН

Метою досліджень було встановлення можливості використання РІФ для індикації антигену вірусу ІНАН, проведення методичної розробки постановки реакції та розробка біотехнології отримання компонентів вітчизняної тест-системи. За допомогою РІФ вивчено локалізацію АГ вірусу ІНАН при дослідженні патологічного матеріалу від коней, хворих на ІНАН. Для порівняння використовували стандартний набір діагностикумів фірми VMRD, Inc. (США).

Розробку компонентів для постановки РІФ почали з отримання вірусспецифічних конячих та кролячих поліклональних сироваток. Із них виділяли імуноглобулінову фракцію. Імуноглобуліни мітили флуоресцеїнізотіоціанатом (ФІТЦ), отримуючи ФІТЦ-кон'югат. Використовували цей барвник тому, що його яскраво-смарагдова флуоресценція під люмінесцентним мікроскопом має високий квантовий вихід. Після процесу кон'югації квантовий вихід падає, але світіння лишається достатньо інтенсивним. Враховуючи всі ці обставини, використали наступну схему отримання ФІТЦ- кон'югату:

виділення гамма-глобулінової фракції із сироватки крові кролів та коней за допомогою сульфатно-риванолового методу;

з'єднання ФІТЦ з білком. Кінцева концентрація білка в реакційній суміші складала 1-2%, а ФІТЦ брали з розрахунку 3 мг на 100 мг білка. Кон'югація проходила при температурі 2-4 0С протягом 24 годин при постійному перемішуванні за допомогою магнітної мішалки;

очищення кон'югату за допомогою пропускання через колонку з сефадексом;

перевірка чистоти очистки кон'югату методом висхідної хроматографії на папері.

Виходячи з експериментальних даних, встановлено, що отриманий ФІТЦ-кон'югат є чутливим і специфічним для індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней.

Для діагностики інфекційної анемії коней можна використовувати такі методи: реакцію дифузної преципітації (РДП), яка до останнього часу лишалась єдиним тестом для оцінки рівня специфічних АТ в крові коней, імуноферментний аналіз (ІФА), реакцію зв'язування комплементу (РЗК) та реакцію імунофлуоресценції (РІФ). Проведені нами експериментальні дослідження свідчать про те, що РІФ не поступається за рядом критеріїв існуючим методам діагностики ІНАН. Разом з тим, цей метод є найбільш експресним у порівняні з іншими лабораторними тестами. Слід також відмітити, що використання РІФ дає змогу проводити індикацію АГ вірусу ІНАН в культуральній системі, що є надзвичайно важливим при отриманні вакцинних та діагностичних препаратів.

Розроблений метод за своєю інформативністю не поступається існуючим тестам, але і не виключає їх проведення у разі необхідності. Впровадження його в практику дослідних та діагностичних лабораторій дозволить підвищити рівень діагностичних досліджень та проводити диференційну діагностику ІНАН, що дозволить значно зменшити економічні збитки в спеціалізованих господарствах.

Висновки

1. Вірус інфекційної анемії коней здатний викликати цитопатичну дію в культурі лейкоцитів коня. Прояв ЦПД відмічений на 72-96 годину після інфікування і характеризується зміною морфології клітин.

2. Отримана первинно-трипсинізована культура нирки ембріону коня є чутливою до вірусу ІНАН. Вірус репродукується в цій культурі без прояву ЦПД.

3. Виділені ізоляти вірусу ІНАН від хворих коней із господарств України - Черкаської - З 14261/97, Ч 17714 /01 та Сумської - С 14378/98 областей, досліджені їх фізико-хімічні властивості, зокрема чутливість до хлороформу, температури, зміни рН. При морфологічному дослідженні встановлено, що розмір їх віріонів складає 80-90 нм. За вказаними властивостями виділені ізоляти подібні з референтними штамами EIA P 337 V 26 13 та Wyoming W 40.

4. Встановлено, що кролі, кури, морські свинки та поросята не чутливі до вірусу ІНАН. Впродовж 240 днів спостереження титри специфічних антитіл в РДП в сироватках крові цих тварин були надзвичайно низькими (1:2-1:8), або взагалі не виявлялись.

5. Гістологічними дослідженнями різних органів коней хворих на ІНАН встановлено, що вірус найчастіше уражує печінку (дифузні проліферати лімфоїдних клітин), селезінку (дифузна гіперплазія, різке зменшення гемосидерину), та лімфатичні вузли.

6. При дослідженні біохімічних показників крові коней в період гострого перебігу хвороби встановлене значне зниження білкового коефіцієнту (відношенням між кількістю альбумінів і сумою глобулінів)- 0,55±0,168 у крові хворих коней у порівняні до такого у здорових тварин -1,308±0,236. Ці зміни можуть бути використані для оцінки ступеню активності інфекційного процесу, а також мати діагностичну й прогностичну цінність.

7. Експериментально доведена можливість використання РІФ для індикації антигену вірусу ІНАН. Розроблені компоненти вітчизняної тест-системи можуть були використані при індикації антигену вірусу ІНАН в культурі лейкоцитів коня та в патматеріалі з різних органів коней.

Список основних праць, опублікованих за темою дисертації

1. Матвієнко Н.М. Репродукція вірусу інфекційної анемії коней в чутливих біологічних системах //Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2001.- № 37.- С.191-195.

2. Старчеус А.П., Матвієнко Н.М. Гістологічні дослідження органів коней, хворих на інфекційну анемію//Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2001.- № 42.- С.165-167.

3. Матвієнко Н.М. Культивування вірусу інфекційної анемії коней в культурі лейкоцитів коня//Вісник аграрної науки. - 2000. - № 10. - С.76-77.

4. Старчеус А.П., Матвієнко Н.М. Індикація антигену вірусу збуднику інфекційної анемії коней за допомогою методу флуоресціюючих антитіл// Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. - 2001.- Том 3.-№ 2.- С.158-160.

5. Матвієнко Н.М. Чутливість клітинних культур до вірусу інфекційної анемії коней// Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології.-2000.-№7.- С.59-60.

6. Матвієнко Н.М. Вдосконалення лабораторної діагностики інфекційної анемії коней //Вісник Сумського державного аграрного університету. - 1999.-№4.-С.132-133.

7. Матвієнко Н.М. Дослідження локалізації вірусу інфекційної анемії коней при експериментальній інфекції//Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених: "Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення". Київ. 11 жовтня 2000.-С.50-51.

8. Матвієнко Н.М. Особливості лабораторної діагностики інфекційної анемії коней//Тези ІІ Міжнародної конференції "Біоресурси та віруси". Україна.7-10 вересня 1998.- Київ.-с.28.

Размещено на Allbest.ru