Вирусные заболевания животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

1. Вирус: строение и химический состав, функции структур вириона. Отличия вирусов от других инфекционных агентов. Формы существования вирусов. Правила работы в вирусологической лаборатории. Основные требования при работе с вируссодержащим материалом

2. Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота

3. Задача

Список используемой литературы

1. Вирус: строение и химический состав, функции структур вириона. Отличия вирусов от других инфекционных агентов. Формы существования вирусов. Правила работы в вирусологической лаборатории. Основные требования при работе с вируссодержащим материалом

Простые (безоболочечные) вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белка и представляют собой нуклеопротеиды или нуклеокапсиды. Сложные (оболочечные) вирусы кроме нуклеиновой кислоты и белка содержат также липиды и углеводы.

В отличие от клетки вирусы содержат один тип нуклеиновой кислоты -- или ДНК, или РНК. Каждая из них выполняет функцию вирусного генома. Структура нуклеиновых кислот у разных вирусов весьма разнообразная. По количеству цепей они бывают одно- и двуспиральными, по форме -- линейными и кольцевыми (циркулярными), а также непрерывными и фрагментированными.

Содержание нуклеиновой кислоты в вирионе различных вирусов составляет от 1 % у ортомиксо- и парамисовирусов до 32 % у парвовирусов и не коррелирует ни с систематическим положением вируса, ни со степенью сложности его организации.

Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК различных вирусов варьирует в широких пределах: от 2 МД у цирко- и парвовирусов ДО 375 МД у поксвирусов. Самые большие геномы содержат до нескольких сотен генов, самые маленькие -- несколько генов. По структуре молекулы ДНК бывают одно- и двуспиральными, линейными и кольцевыми. У вирусов с двуспиральными ДНК информация обычно закодирована на обеих спиралях, что говорит о максимальной экономии генетического материала. Большинство нуклеотидных последовательностей в молекуле ДНК встречается однократно. Однако в концевом фрагменте линейных ДНК возможно наличие ее начального участка в виде повтора, который бывает прямым или инвертируемым. Благодаря таким повторам молекулы ДНК могут приобретать циркулярную форму, которая обеспечивает их устойчивость к эндонуклеазам. Кроме того, стадия образования циркулярной формы обязательна для интеграции вирусной ДНК с геномом клетки.

Односпиральные молекулы ДНК обычно одной полярности. Исключение составляют аденоассоциированные вирусы (парвовирусы). Их вирионы содержат ДНК или одной полярности (условно называемой «плюс»), или противоположной (условно -- «минус»), Инфекционную активность эти вирусы проявляют только в том случае, когда в клетку проникают вирионы, содержащие ДНК обеих полярностей.

Вирусные РНК. Молекулярная масса вирусных РНК варьирует в пределах от 4--5 МД у нодавирусов до 32 МД у реовирусов.

Инфекционная активность молекулы РНК зависит от ее структуры. Различают РНК одно- и двуспиральные, по форме -- линейные, фрагментированные и кольцевые. Молекулы односпиральных РНК (гаплоидный геном) имеют форму одиночной полинуклеотидной цепи со спирализованными комплементарными участками. Некомплементарные участки могут образовывать «шипы», или «выступы».

По предложению Балтимора (1971) вирусы с односпиральными РНК из-за различий в функциях генома было принято разделять на две подгруппы. У вирусов первой подгруппы вирусный геном обладает функциями иРНК и их условно обозначают как плюс- нитевые вирусы, или вирусы с позитивным геномом. У вирусов второй группы РНК не обладает функцией иРНК. На ней, как на матрице, синтезируется комплементарная молекула. Это происходит только в присутствии вирусного белка -- фермента транскриптаза, который обязательно находится в структуре минус-нитевых вирусов (в клетках -- ее аналога нет).

Между двумя группами РНК-вирусов есть и структурные различия. РНК «плюс-нитевых» вирусов выполняет функцию иРНК и имеет на 5'- и З'-концах молекулы специфические структурные особенности, которых нет у минус-нитевых вирусов. Так, 5'-конец вирусных плюс-нитевых РНК, как и клеточных, имеет структуру, называемую «шапочкой» (от англ. cap). Она представляет собой 7-метилгуанин, присоединенный через пирофосфатную связь к гуаниновому нуклеотиду. На З'-конце «плюс- нитевых» РНК имеется до 200 и больше адениновых нуклеотидов, так называемых поли (А). Такая структурная модификация на 5'- и З'- концах и РНК очень важна для их функционирования: так, «шапочка» нужна для специфического узнавания и РНК рибосомами, а функция поли(А) заключается, по-видимому, в стабилизации молекул РНК. Исключение составляет 5'-конец РНК вируса полиомиелита. РНК этого вируса не содержит «шапочку»; вместо нее на 5'-конце имеется низкомолекулярный терминальный белок, ковалентно присоединенный к остатку урацила.

РНК минус-нитевых вирусов не имеет ни «шапочки», ни поли(А) и не способна вызывать инфекционный процесс. Необходимые для транскрипции вирусных белков модифицированные 5'- и 3'-концы для иРНК синтезируются на матрице геномной РНК в присутствии транскриптазы. Вирусная РНК ретровирусов хотя и является плюс-нитевой, однако не содержит «шапочку». Ее содержит гомологичная и РНК, которая синтезируется на матрице интегрированной в геном клетки провирусной ДНК.

Существуют вирусы, которые содержат как плюс-нитевые, так и минус нитевые РНК-гены, так называемые амбиполярные РНК.

Двуспиральные молекулы РНК впервые были обнаружены у реовирусов и были названы «диплорнавирусы».

Белки. Белки всех известных в настоящее время вирусов позвоночных являются основными компонентами вирионов и составляют от 57 до 90 % массы вириона. По аминокислотному составу вирусные белки принципиально не отличаются от состава белков животных.

В геноме вирусов кодируются две группы белков: структурные, которые входят в состав вирионов потомства, и неструктурные, участвующие в репродукции вируса на разных этапах, но не входящие в состав вирионов.

Структурные белки в составе вириона варьируют в широких пределах, что зависит от сложности организации вириона.

Простые вирусы животных содержат 3--4 белка, сложные, например вирусы оспы, -- более 30. Среди структурных белков различают две группы -- капсидные и пепломеры. Первая группа включает белки, которые формируют капсид (от греч. capsa -- вместилище), окружающий нуклеиновую кислоту, а также геномные белки и ферменты; вторая группа -- белки суперкапсидной оболочки, называемой пеплос (от греч. peplos -- покров, мантия). Простые вирусы содержат только капсидные белки, сложные -- и капсидные, и пепломеры.

Белки в составе вирусного капсида называются капсомерами. Основной их функцией является защита вирусного генома от неблагоприятных воздействий внешней среды. Они представляют собой идентичные полипептидные цепи (белковые субъединицы), которые обладают способностью к самосборке. Сборка капсида из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимодействии с нуклеиновой кислотой. Принцип субъединичности в строении капсида -- уникальное свойство капсидных белков, благодаря которому достигается огромная экономия генетического материала. Кроме того, в механизме самосборки заложена возможность контроля за белковыми субъединицами: дефектные и чужеродные белковые цепи не включаются в капсид. Принцип самосборки характерен только для простых вирусов. Сложные вирусы сборку осуществляют по более сложному многоступенчатому механизму. Однако отдельные ее этапы (формирование капсидов и нуклеокапсидов) основаны на самосборке.

Некоторые капсидные белки обладают ферментативной активностью и участвуют в транскрипции и репликации вирусного генома. Так, в вирионах всех «минус-нитевых» РНК-вирусов обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (транскриптаза); в вирионах ретровирусов -- РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, ревертаза) и другие ферменты. Наибольшее количество ферментов (более 10) обнаружено в составе вирусов оспы. Некоторые капсидные белки ковалентно связаны с концевой частью вирусного генома (геномные белки) и являются терминальными. Их функции неразрывно связаны с функциями генома и их регуляцией. Ферменты и геномные белки представлены единичными молекулами, тогда как капсомеры -- множественными.

Суперкапсидные белки (пепломеры) находятся в липопротеидной оболочке сложных вирусов. Они либо пронизывают липидный бислой вириона, либо не доходят до его внутренней поверхности. Являясь типичными внутримембранными белками, они, как правило, гликозилированы (гликопротеиды), т. е. к молекуле белка в определенных местах прикреплены углеводные цепи. Гликозилирование осуществляют клеточные ферменты, поэтому один и тот же вирус, но реплицирующийся в разных клетках, может иметь разные углеводные остатки по составу углеводов, длине углеводной цепи, месту прикрепления к белку.

У большинства сложных вирусов гликопротеиды формируют на поверхности вириона выступы -- «шипы» длиной 7--10 нм. В их состав входит несколько молекул одного и того же белка. Вирусы гриппа (ортомиксовирусы) имеют два типа «шипов», один из которых построен из гемагглютинина, другой -- из нейраминидазы. У парамиксовирусов также два типа «шипов» из двух гликопротеидов -- HN и F. Рабдовирусы имеют только один тип «шипов» из одного гликопротеида.

Молекула гликопротеида имеет внешний гидрофильный конец, несущий аминогруппу (N-конец), и внутренний гидрофобный конец, несущий гидроксильную группу (С-конец) и погруженный в липидный бислой. С-концом гликопротеид «заякоривается» (фиксируется) в липидном бислое, N-концом распознает чувствительную клетку хозяина и адсорбируется на ней. Такая функция вирусных белков получила название «адресная функция». Она выработалась у вирусов в процессе эволюции, когда среди огромного числа нечувствительных клеток вирусная частица узнает специфический рецептор на клетке хозяина за счет специфических белков на своей поверхности. Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, ведущее к проникновению вирусных частиц в клетку (белки слияния). Вирусные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних клеток, приводящее к образованию гигантских клеток -- синцитиев или симпластов.

Неструктурные белки менее изучены. Существуют определенные трудности в их выделении из зараженных клеток и очистки от клеточных белков. К ним относятся: предшественники вирусных белков, которые существуют в зараженной клетке очень непродолжительное время, а затем нарезаются; ферменты синтеза РНК и ДНК -- полимеразы; регуляторы стадий репродукции вирусов; ферменты, модифицирующие вирусные белки -- протеиназы и протеинкиназы.

Липиды и углеводы. В состав вирионов всех сложных (оболочечных) вирусов позвоночных кроме нуклеиновой кислоты и белков входят липиды и углеводы.

Состав липидов вирионов сходен с липидным составом клетки хозяина: примерно 50--60 % составляют фосфолипиды и 20--30 % -- холестерин. У отдельных представителей липидов содержится до 20--35 % от массы вириона (ортомиксо-, ретро-, буньявирусы). Липиды обнаружены только в суперкапсидной оболочке вирионов и имеют клеточное происхождение. Это связано с тем, что оболочечные вирусы формируются путем почкования на плазматической мембране клеток. Поэтому суперкапсидная оболочка вирионов представляет собой мембрану клетки-хозяина, модифицированную за счет встроенных в нее вирусных белков -- пепломеров. Липидный компонент стабилизирует структуру вирусных частиц, поэтому их обработка детергентами или липазами приводит к потере инфекционности.

Исключение составляют вирусы оспы. У них липиды не образуют дифференцированной оболочки. Обработка вирусов осповакцины жирорастворителями не приводит к потере инфекционной активности или каким-либо другим структурным изменениям вириона.

Углеводы находятся в вирионах в виде гликопротеинов, встроенных в суперкапсидный слой, а также гликолипидов и имеют клеточное происхождение. У отдельных представителей вирусов позвоночных содержание углеводов доходит до 7--8 % от массы вириона (ортомиксо-, тогавирусы). Химический состав их полностью определяется клеточными ферментами, которые обеспечивают перенос и присоединение сахарных остатков. В вирионах в основном обнаруживают фруктозу, сахарозу, маннозу, галактозу, нейраминовую кислоту, глюкозамин. Углеводы являются каркасом для локальных участков гликопротеидов, обеспечивают сохранение конформации белковых молекул и защищают от действия протеаз.

Структурная организация вирионов. Вирионы (вирусные частицы) по архитектуре подразделяются на два типа: имеющие внешнюю липопротеидную оболочку (сложные, или оболочечные, вирусы) и не имеющие такой оболочки (простые, или безоболочечные, вирусы).

Методами электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа детально изучено строение многих вирусов. Показано, что обязательный структурный компонент обоих типов -- капсид (белковый чехол), окружающий вирусную нуклеиновую кислоту. Капсид состоит из большого числа регулярно расположенных полипептидных молекул (субъединиц), которые называют капсомерами, или морфологическими единицами. На поверхности суперкапсидной оболочки также имеются морфологические субъединицы, которые называются пепломерами. Каждый капсомер (пепломер) состоит из структурных единиц, построенных из одной или нескольких гомологичных или гетерологичных полипептидных цепей и обычно соединенных друг с другом дисульфидной связью. Отдельную структурную единицу называют химической единицей или белковой субъединицей. Структурные единицы в составе капсида удерживаются нековалентными связями (водородными, ионными, гидрофобными). Капсид с заключенной в нем нуклеиновой кислотой называется нуклеокапсидом. У безоболочечных вирусов термины «нуклеокапсид» и «вирион» тождественны.

Капсомеры соединяются друг с другом строго определенным образом и образуют только два типа капсидов: спиральный и изометрический (квазиметрический). Только такие способы укладки капсомеров вокруг нуклеиновой кислоты (типы симметрии) обеспечивают формирование энергетически экономичных структур с минимумом свободной энергии.

Спиральный тип характерен для вирусов, у которых капсомеры ассоциируются (соединяются) с геномом и образуют спиралевидную или винтообразную структуру. Такой способ укладки капсомеров называется спиральным типом симметрии. Он характеризуется длиной, диаметром, шагом спирали и числом капсомеров на один оборот спирали. Так, у вируса Сендай (парамиксовирус) нуклеокапсид представляет собой спираль длиной около 1 мкм, диаметром 20 нм и шагом спирали 5 нм. Он состоит примерно из 2400 структурных единиц, каждая из которых является белком с молекулярной массой 60 кД. На каждый винт спирали приходится 11--13 субъединиц. Белковые молекулы присоединяются к РНК под углом 60°, в связи с чем нуклеокапсид на электронной микрофотографии имеет вид «елочки».

Изометрические капсиды представляют структуры, в которых капсомеры соединяются между собой в правильные многогранники, в центре которых расположен геном. Такой способ укладки капсомеров называется кубическим типом симметрии, а многогранник -- икосаэдром. Это означает, что он симметричен в трех взаимно перпендикулярных направлениях и его линейные размеры вдоль прямоугольных осей идентичны. Обычно изометрические капсиды состоят из 60 (или кратных 60) геометрически идентичных элементов, которые имеют 12 вершин, 20 граней и 20 ребер. Так, капсид вируса полиомиелита образован 60 белковыми структурными единицами, каждая из которых состоит из четырех полипептидных цепей (химических единиц) --vpl, vp2, vp3, vp4 (virion protein).

У оболочечных вирусов суперкапсид состоит из двойного слоя клеточных липидов и встроенных в него гликопротеидов. Они являются интрамембранными белками и формируют морфологические субъединицы -- пепломеры, которые в электронном микроскопе выглядят в виде выступов (отростков) или «шипов» разной формы. Так, например, у тогавирусов они имеют палочкообразную форму; у парамиксовирусов (PC-вирус) -- форму бутылки; у коронавирусов -- форму короны. У ортомиксовирусов (вирусы гриппа) гемагглютинин образует шипы палочкообразной формы, нейроминидаза -- в форме барабанной палочки. Изнутри липидного бислоя расположен внутренний белковый слой, образованный так называемым мембранным белком. Его еще называют внутренней белковой мембраной. Его функция заключается в дополнительной защите и стабилизации нуклеокапсида, который у оболочечных вирусов часто обозначают термином «сердцевина» (сог).

Наиболее сложно структурно организованы вирусы оспы. Их сердцевина (нуклеоид), содержащая вирусную ДНК в составе нуклеотида, имеет форму двояковогнутого кольца и окружена двумя линзообразными латеральными тельцами. Капсид окружен дополнительными внутренними белковыми структурами -- вирусным матриксом. По архитектуре вирусы оспы отличаются от всех других вирусов позвоночных и их принято называть вирусами со сложным типом симметрии.

Морфогенез вирусов. При репродукции вирусов внутри клетки формируются определенные структуры, в которых синтезируются и собираются компоненты дочерних вирионов. Эти структуры появляются в результате корпоративных взаимодействий структур клетки и вируса, где главенствующая роль принадлежит клетке, и их принято называть включения, «фабрики», клеточные матриксы, виропласты. В составе включений (матриксов) обнаруживаются клеточные структуры и компоненты вирионов, причем их соотношение меняется по ходу репродукции вирусов. Так, в начале в них преимущественно обнаруживаются скопления элементов клетки -- рибосом, (полисом), мембран, микротрубочек, осмофильных волокон. Позднее появляются компоненты вирионов (субвирусные компоненты) -- вирусные белки, нуклеопротеиды. На завершающих этапах репродукции в матриксах обнаруживается большое скопление вирионов, которые формируют кристаллоподобные колонии.

Локализация включений в клетке также связана с местом репродукции вирусов. Так, для ДНК-вирусов (реовирусы, аденовирусы, папилломавирусы, полиомавирусы), у которых репродукция проходит преимущественно в ядрах клеток, включения обнаруживаются вблизи ядерной мембраны. При окрашивании таких клеток можно увидеть так называемые внутриядерные включения. У РНК-вирусов репродукция вирионов проходит в цитоплазме клеток вблизи мембран эндоплазматической сети, аппарата Гольджи и других структур, где они образуют включения типа «тяжей» (парамиксовирусы), а затем транспортируются к плазматической мембране клеток. У сложных вирусов, таких, как вирусы оспы, включения образуются в цитоплазме, где они и репродуцируются. Сначала во включениях преобладают многочисленные вирусные белки нуклеоида. Позднее в них обнаруживаются пузырчатые субвирусные компоненты, а затем уже колонии вирионов.

Морфогенез оболочечных ДНК-вирусов проходит сложнее, чем безоболочечных. Так, изометрические нуклеокапсиды вируса герпеса формируются в ядрах, затем путем почкования через ядерную мембрану транспортируются в цитоплазму к аппарату Гольджи, после чего вирионы проходят через эндоплазматическую сеть аппарата Гольджи и захватывают ее мембрану. В результате вирионы имеют две оболочки: одну -- ядерную и другую -- цитоплазматическую. При морфогенезе оболочечных РНК-вирусов сначала в плазматическую мембрану клетки встраиваются трансмембранные гликопротеиды, а с внутренней стороны -- матриксный белок. К таким модифицированным участкам плазматической мембраны транспортируются нуклеопротеиды. Свертываясь в плотные «клубки», они проходят через эти участки мембраны и покрываются ею, приобретая тем самым внешнюю оболочку (суперкапсид). Такой способ формирования вирионов и выхода их из клетки называется почкованием. Выход из клетки сложных вирионов оспы может проходить либо путем почкования через мембраны во внутриклеточные вакуоли, либо при разрушении клеток т.е. путем «взрыва».

Правила работы с вируссодержащим материалом и техника безопасности (при работе студентов на кафедре).

При работе с вируссодержащим материалом необходимо выполнять следующие требования:

-не допускать рассеивания вирусов во внешней среде;

-предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой;

- обеспечить личную безопасность.

Для выполнения этих требований следует соблюдать следующие правила работы:

-необходимо быть очень внимательным, собранным и аккуратным;

-входить в помещение лаборатории и выходить из него только в халате, переодеваясь в гардеробе;

-работать только в халате с застегнутыми манжетами, шапочке и марлевой маске;

-в лаборатории строго соблюдать чистоту и порядок.

-На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов.

-Запрещается курить и принимать пищу;

-материалы и инструменты для работы дежурный по группе получает у лаборанта кафедры и раздает студентам;

-пользоваться только стерильными инструментами и посудой; открывать и закрывать сосуды (пробирки, флаконы, чашки и т. п.) у пламени горелки; не брать пипеток в рот;

-отработанные инструменты, включая шприцы (в разобранном виде), складывать в стерилизатор для последующего обезвреживания и кипячения;

-отработанные пипетки собирать в сосуд с дезинфицирующим раствором;

-твердые и жидкие отходы (вата, бумага и т. д.) собирать в специально приспособленные контейнеры для последующей стерилизации;

-запрещается выливать или сбрасывать отходы в унитазы и раковины;

-если студент случайно разольет вируссодержащий материал, он обязан немедленно сообщить об этом преподавателю и вместе с ним обеззаразить рабочее место;

-в конце занятия студент должен привести в порядок свое рабочее место, сдать дежурному весь материал и инструменты, вымыть руки с мылом.

2. Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота

вирус инфекционный рогатый скот

Парагрипп-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота (транспортная лихорадка) -- острая контагиозная болезнь главным образом телят, характеризующаяся лихорадкой и поражением органов дыхания.

Впервые вирусная природа болезни установлена в США в 1959 г. В СССР это заболевание было обнаружено в 1968 г. Болезнь зарегистрирована во всех странах мира, в том числе в России.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Paramyxoviridae, подсемейству Paramyxovirinae, роду Respirovirus. Вирионы вируса плеоморфные, но чаще сферической или нитевидной формы, диаметр 150 нм и более. Состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются характерные выступы. Геном представлен единой односпиральной линейной молекулой минус-РНК.

В естественных условиях вирус ПГ-3 вызывает заболевание у крупного рогатого скота, поражая до 90--100 % животных. Болеют телята не старше одного года. Имеются сообщения о выделении вируса от буйволов, овец, лошадей. Антитела к вирусу ПГ-3 обнаружены у 60 -100% клинически здоровых телят, овец, коз, верблюдом, собак, крыс. Отмечено, что у буйволов и ягнят вирус ПГ-3 может быть причиной поражения органов дыхания и желудочно-кишечного тракта.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус чувствителен к многократному замораживанию и оттаиванию, быстро погибает под действием УФ-излучения; воздействие жирорастворителями (эфир, хлороформ) ведет к полной потере инфекционной активности. Низкие значения pH губительно действуют на вирус, он хорошо сохраняется при pH 6,8--7,5. Прогревание при 50 ?С в течение 80 мин ведет к его полной инактивации. Обработка 0,4%-ным раствором формалина и 1%-ным раствором в-пропиолактона уничтожает инфекционность вируса. Воздействие 0,4%-ным этиленимином в течение 20 ч не действует на гемагглютинирующую активность, но уничтожает инфекционность вируса. Вирус хорошо переносит лиофилизацию.

Антигенная структура. В вирионах обнаружено шесть полипептидов (L, Р, NP, М, HN, F), три из которых (L, Р, NP) связаны с нуклеокапсидом и три (М, HN, F) входят в состав липопротеидной оболочки; два из них (HN, F) являются гликопротеинами, которые образуют выступы наружной оболочки. Они ответственны за гемагглютинирующую, нейраминидазную активность, адсорбцию вирионов на клеточной поверхности и за слияние клеток.

Антигенная вариабельность. В антигенном отношении все штаммы вирусов ПГ-3, выделенные в различных странах, идентичны и соответствуют прототипному штамму SF-4, выделенному в США. Установлены некоторые различия в гемагглютинирующей, нейраминидазной и синцитийобразующей активности. Установлено сходство (но не идентичность) между штаммами вируса ПГ-3 крупного рогатого скота и овец. Близкое антигенное родство вируса ПГ-3 крупного рогатого скота имеет с вирусом парагриппа человека третьего серотипа.

Антигенная активность. Вирус ПГ-3 обладает выраженной антигенной активностью. Как при естественной, так и при искусственной иммунизации появляются специфические антитела, которые обнаруживаются в РТГА, PH, РСК и РДП. Первыми выявляют антигемагглютинины (на 6--7-й день), которые обнаруживаются на значительном уровне (1:64--1 : 256) в течение 6 мес.

Культивирование вируса. Для размножения вируса ПГ-3 можно успешно применять первичные культуры клеток почек эмбриона крупного рогатого скота (ПЭК), почек, легких телят (ПТ, ЛТ) и тестикул бычков (ТБ). Кроме того, вирус ПГ-3 размножается и в перевиваемых линиях клеток: Таурус 1, МДВК, ПС (почки сайги), ПЛЭК, ВНК-21 и др. Все штаммы вируса вызывают сходное цитопатическое действие, характеризующееся образованием синцития и вакуолей. Сроки проявления гемадсорбции и ЦПД зависят не от штамма, а от вида культуры клеток. Вирус ПГ-3 размножается также в развивающихся куриных эмбрионах, однако зараженные эмбрионы не погибают.

Гемагглютинирующие свойства. Вирус хорошо агглютинирует эритроциты морской свинки и с меньшей активностью -- эритроциты кролика, свиньи, коровы, обезьяны, мыши, буйвола, голубя, овцы, козы; не агглютинирует эритроциты лошади. Данные об агглютинации эритроцитов кур противоречивы. Свежевыделенные штаммы вируса лучше агглютинируют эритроциты при 4 °С, чем при 37 °С. Гемагглютинирующая активность вируса повышается значительно после обработки эфиром и твином.

Гемадсорбирующие свойства. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3, приобретают свойство адсорбировать на своей поверхности эритроциты морской свинки и слабее -- эритроциты других видов животных. Вирус вызывает диффузную адсорбцию эритроцитов. Важно отметить, что гемадсорбция проявляется раньше, чем цитопатическое действие в инфицированных клетках.

Экспериментальную инфекцию можно воспроизвести на телятах при отсутствии у них специфических антител. Лабораторные животные к вирусу невосприимчивы. Некоторым исследователям удалось вызвать экспериментальную инфекцию у ягнят, поросят и мышей-сосунов.

Клинические признаки. Инкубационный период болезни длится 1--2 дня. Клиническая болезнь проявляется по-разному: от легких ринитов и бронхитов до тяжелой бронхопневмонии. Течение болезни обусловлено многими предрасполагающими стрессовыми факторами (нарушения кормления и содержания, транспортировка, скученность и т. д.), иммунным и физиологическим состоянием животных; способом заражения; дозой и вирулентностью вируса. Раньше ПР-3 называли «транспортной лихорадкой».

У животных отмечают повышение температуры тела до 41-- 42 °С в течение 1--2 нед, угнетение, одышку, серозно-слизистые истечения из носа, глаз, иногда развивается диарея, отказ от корма. Если нет осложнений секундарной бактериальной микрофлорой, то через 2--3 нед животные выздоравливают. При тяжелом течении болезни наблюдают сильный кашель, интенсивные выделения из носа, глаз, ротовой полости, появление эрозий на слизистой оболочке рта. У телят при подостром и хроническом течениях отмечают слизисто-гнойные выделения из носа и глаз, признаки плеврита, пневмонии, иногда энтерита. У взрослых животных инфекция, как правило, не сопровождается симптомами респираторного заболевания, однако у стельных коров она может привести к внутриутробному заражению плода, абортам или рождению нежизнеспособных телят.

На исход болезни влияют многие осложняющие стрессовые факторы, вирулентность циркулирующего штамма вируса, одновременное инфицирование животных другими вирусами (аденовирусы, вирусы инфекционного ринотрахеита, диареи и др.), хламидиями и пастереллами.

Патологоанатомические изменения. В основном находят в органах дыхания: катаральное воспаление слизистой носа, гиперемия слизистой и слизисто-гнойный экссудат в трахее, бронхах, уплотненные очаги в легких, признаки эмфиземы. Заглоточные и бронхиальные лимфатические узлы отечные, с кровоизлияниями. На плевре, брюшине, эпикарде -- точечные кровоизлияния. На слизистой сычуга -- кровоизлияния, эрозии и язвы. Слизистая кишечника отекшая, с кровоизлияниями.

Локализация вируса. Вирус ПГ-3 быстро размножается в клетках респираторного тракта и других органов. Через 1 -- 10 дней после заражения его можно выделить из экскретов респираторного тракта, гортани, трахеи, легких, регионарных лимфатических узлов, селезенки, печени, надпочечников. Изолируют также из тестикул телят и быков и довольно часто из спермы быков-производителей.

Источник инфекции -- больные животные. Заражение происходит воздушно-капельным путем и, возможно, перорально с молоком больных коров. Не исключается возможность передачи возбудителя половым путем, так как его обнаруживают в сперме, вагинальных выделениях, тканях абортированных плодов.

Диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

ПГ-3 диагностируют с использованием набора диагностикумов, выпускаемых биологической промышленностью. Ее обычно проводят параллельно с исследованием материала на аденовирусную, респираторно-синцитиальную инфекции, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею крупного рогатого скота.

Предварительный диагноз на ПГ-3 ставят в течение 2--3 дней на основании положительных результатов обнаружения вирусного антигена в патологическом материале в РИФ с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений. Окончательно болезнь диагностируют в течение 10--30 дней на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса, обнаружения 4-кратного и более прироста антител в парных пробах сывороток кропи.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию отправляют патологический материал от больных животных, взятый в первые 2--3 дня болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии заболевания.

От больных животных берут: смывы со слизистых оболочек носа, глаз и прямой кишки с помощью стерильного ватно-марлевого или поролонового тампона; кровь в первые 3 дня заболевания (не менее чем от 10 животных) и через 3 недели от тех же животных (для получения парных сывороток).

От животных, убитых с диагностической целью, берут кусочки легких, селезенки, слизистые оболочки носовой полости, трахеи, кишечника, регионарные лимфатические узлы.

Кусочки органов массой до 20 г помещают в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые флаконы с резиновыми пробками); ватно-марлевые тампоны (смывы) -- во флаконы с раствором Хенкса или физиологическим раствором. Материал в термосе с охлаждающей смесью и сопроводительное письмо доставляют в лабораторию с нарочным.

В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2--3 мин, отжимают и удаляют, а содержимое флаконов центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для выделения вируса, из осадка клеток делают мазки для РИФ.

Из кусочков органов убитого животного готовят мазки-отпечатки для РИФ и 10%-ную суспензию вируса для его выделения.

Лабораторная диагностика. Обнаружение вирусного антигена в патологическом материале (мазках-отпечатках) проводят с помощью РИФ; вирусную нуклеиновую кислоту определяют с помощью полимеразной ценном реакции (ПЦР)

Изоляцию вируса из патологического материала проводят в первичной культуре клеток ПЕК, ЛЕК,ПТ,ТБ или и перевариваемых линиях клеток Таурус I,ПЛЭК и др. Вирус считают выделенным, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД 1Д положительную (РГАд) с эритроцитами морской свинки.

Вирус ПГ-3 можно выделять и на куриных эмбрионах, которые лучше заражать в амниотическую полость. Выделение вируса на естественно-восприимчивых животных не проводят вследствие дороговизны и большой трудности в подборе телят, не имеющих специфических антител. Лабораторные животные нечувствительны к вирусу ПГ-3.

Идентификацию выделенного вируса проводят в серологических реакциях: РТГАд, РИФ, РТГА, PH, ИФА. Наиболее быстрый метод идентификации выделенного вируса, обладающего гемадсорбирующими свойствами, -- РТГАд с эритроцитами морской свинки.

Ретроспективная диагностика. Для этой цели исследуют парные сыворотки крови, взятые не менее чем от 10--15 животных с интервалом 2--3 нед. Сыворотки исследуют в серологических реакциях: РТГА (чаще), ИФА, PH. Предложена очень чувствительная и простая реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Кроме исследования парных сывороток крови при серодиагностике ПГ-3 рекомендуется метод выявления секреторных антител в РТГА. Для этого берут пробы носовых секретов от 10--15 животных, проявивших клинические признаки болезни, и повторно -- через 6--8 дней.

Положительным результатом исследования на ПГ-3 считают в случае выявления антител во второй пробе носовых секретов в титре 1 : 16 и выше (при отсутствии антител в первой пробе) или в случае установления 4-кратного и более увеличения титра антител но второй пробе по сравнению с первой.

Дифференциальная диагностика. Лабораторными исследованиями исключают ряд болезней, протекающих клинически сходно: аденовирусную, респираторно-синцитиальную инфекции, инфекционный ринотрахеит, вирусную диарею, хламидиоз, хотя эти инфекции очень часто протекают в различных ассоциациях.

Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшие животные в течение 3--4 мес невосприимчивы к повторному заражению. Важный фактор иммунитета -- локальная невосприимчивость клеток слизистой оболочки респираторных органов, вызванная образованием секреторных антител и интерферона, чаще выявляемых в более высоком титре после интраназальной вакцинации живым вирусом, чем после подкожной вакцинации инактивированным вирусом. Гуморальные антитела после вакцинации сохраняются у животных в течение 6--12 мес. В защите против парагриппа-3 преобладают гуморальные факторы, но хорошо выражен также клеточный иммунитет. Телята, родившиеся от иммунных коров, получают антитела с молозивом. Продолжительность колострального иммунитета составляет 1,5--2 мес. Однако некоторые исследователи считают, что молозивные антитела предохраняют около 50 % телят месячного возраста. Вакцинация телят более эффективна в период угасания материнских антител, так как колостральные антитела препятствуют активной продукции сывороточных антител в связи с блокированием вакцинного антигена, поэтому рекомендуют прививать телят интраназально.

Для специфической профилактики парагриппа-3 применяют в основном живые вакцины из аттенуированных штаммов вируса. Все чаще применяют живые комбинированные вакцины, содержащие аттенуированные штаммы вирусов ПГ-3, ИРТ, ВД и инактивированные пастереллы и хламидии.

3. Задача

Через две недели после возращения с дачи хозяева собаки обратили внимание на изменение ее поведения: собака неадекватно реагировала на резкие звуки, впадала в ярость, через несколько минут ее поведение резко менялось, появилась обильная саливация , изменился голос, собака щелкала зубами , как будто ловила мух .Через три дня собака пала.

Патолого- анатомическое вскрытие павшей собаки не проводили

Предварительный диагноз: Бешенство; Болезнь Ауэски; Чума Плотоядных.

Отбор патматериала Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных -- голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые мешки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указывают отправителя и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрения в заболевании животного бешенством, дату и подпись врача, отправляют с нарочным.

Лабораторная диагностика включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша--Негри и биопробу на белых мышатах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический у-глобулин.

На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 15--20 °С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят специфический флуоресцирующий г-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °С на 25--30 мин. Затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с pH 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдают разной величины и формы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ 3 мес после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген + + антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5--3 мл расплавленного 1,5 %-ного раствора агара .

После застывания в агаре делают лунки по трафарету диаметром 4--5 мм, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером.

От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) -- какие-либо три отдела мозга, у мышей -- весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.

После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °С на 6 ч, затем оставляют при комнатной температуре на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.

Реакцию считают положительной при появлении между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический г-глобулин, одной или двух-трех линий преципитации любой интенсивности.

Бактериальная контаминация и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП.

Материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.

Выявление телец Бабеша--Негри. На предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов головного мозга (как для РИФ), не менее двух препаратов из каждого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Манну, Ленцу и т. д.)

Пример окраски по Селлерсу: на свежий, невысохший препарат наносят краситель, покрывая им весь препарат, выдерживают 10--30 с и смывают фосфатным буфером (pH 7,0--7,5), высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре (в затемненном месте) и просматривают под микроскопом с масляной иммерсией.

Положительным результатом считают наличие телец Бабеша-- Негри -- четко очерченных овальных или продолговатых гранулированных образований розово-красного цвета, расположенных в цитоплазме клеток или вне их.

Данный метод имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных специфических включений.

Биопроба. Она более эффективна по сравнению со всеми указанными выше методами. Ее ставят при получении отрицательных результатов предыдущими методами и в сомнительных случаях.

Для биопробы отбирают белых мышей массой 16--20 г. Нервную ткань из всех отделов головного мозга растирают в ступке со стерильным песком, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии, отстаивают 30--40 мин и используют надосадочную жидкость для заражения мышат. При подозрении на бактериальное загрязнение добавляют на 1 мл суспензии по 500 ЕД пенициллина и стрептомицина и выдерживают 30--40 мин при комнатной температуре. На одну биопробу заражают 10 -- 12 мышат: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно в область носика или в верхнюю губу по 0,1--0,2 мл.

Зараженных мышат помещают в стеклянные банки (лучше аквариумы) и наблюдают за ними в течение 30 дней, ведя ежедневную регистрацию. Гибель мышей в течение 48 ч считают неспецифической и не учитывают в оценке результатов. При наличии вируса бешенства в патологическом материале с 7--10-го дня после заражения у мышей наблюдают следующие симптомы: взъерошенность шерсти, своеобразную горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. У павших мышей головной мозг исследуют в РИФ, на обнаружение телец Бабеша--Негри и ставят РДП.

Биопробу на бешенство считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Бабеша-- Негри или выявляют антиген методами РИФ или РДП. Отрицательный диагноз -- отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.

Рекомендуют для ранней диагностики методом биопробы (особенно это важно, когда исследуемое животное покусало человека) использовать для заражения не 10--12, а 20--30 мышат, и с третьего дня после заражения ежедневно забивать по 1-2 мышонка для исследования их головного мозга в РИФ. Это позволяет (в положительных случаях) сократить срок исследования на несколько дней.

В лабораторной практике иногда ставят метод так называемой специфической биопробы. Сущность его в том, что мыши заболевают при заражении мозговой тканью больных бешенством животных и не заболевают, если эту ткань предварительно обработать (10 мин при 37 °С) антирабической сывороткой.

Некоторые исследователи рекомендуют проводить прижизненную диагностику бешенства методом иммунофлуоресцентного исследования отпечатков роговицы подозреваемых в заболевании бешенством животных, но эффективность этого метода невысока.

Обычно в лаборатории проводят исследование в следующей последовательности: из головного мозга делают мазки-отпечатки для РИФ и обнаружения телец Бабеша--Негри, ставят РДП, при получении отрицательных результатов делают биопробу.

При высококвалифицированном выполнении РИФ получают 99--100 % совпадения с биопробой. Тельца Бабеша--Негри выявляют лишь в 65--85 % случаев бешенства, в РДП -- от 45 до 70 %.

Специфическая профилактика. В настоящее время для профилактики бешенства применяют инактивированные и живые вакцины. Условно вакцины можно разделить:

на вакцины первого поколения, которые готовят из головного мозга животных, инфицированных фиксированным вирусом бешенства;

вакцины второго поколения, которые готовят из штаммов вируса бешенства, адаптированных к культуре клеток;

вакцины третьего поколения, которые получают с помощью генно-инженерных методов.

За рубежом разработали и в некоторых странах успешно применяют рекомбинантную вакцину, которая содержит рекомбинантный вирус оспы, несущий ген основного гликопротеида оболочки вируса бешенства.

В настоящее время начата разработка и показана возможность применения ДНК-вакцин для профилактики бешенства. В России и СНГ широко применяют инактивированную вакцину из штамма Щелково-51, которую готовят с использованием культуры клеток ВНК-21.

Достижения науки по оральной вакцинации лисиц в естественных условиях природы представляют значительную веху в борьбе с природными очагами инфекции.

Список используемой литературы

1.Ветеринарная вирусология. Р.В. Белоусова, Э.А. .Преображенская, И. В. Третьякова. «КолосС»2007 г. Москва

2.Практикум по ветеринарной вирусологии. Р.В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э.А. .Преображенская. «КолосС»2006 г. Москва

Размещено на Allbest.ru