Вплив антибіотиків і середовищ для культивування ооцитів in vitro на якісні показники сперми бугаїв

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська Академія Аграрних Наук

Інститут тваринництва

УДК 619.615.33:591.3591.463.1:636.22/.28

Спеціальність: 03.00.20. - біотехнологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Вплив антибіотиків і середовищ для культивування ооцитів in vitro на якісні показники сперми бугаїв

Скляров Павло Миколайович

Харків-1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії культивування і трансплантації ембріонів Інституту тваринництва Української академії аграрних наук

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор, головний науковий співробітник відділу біотехнології та генної інженерії ІТ УААН Бугров Олексій Дмитрович, Інститут тваринництва УААН.

Офіційні опоненти:

1. Доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН, Сахацький Микола Іванович, директор Інституту птахівництва УААН,

2. Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Кругляк Андрій Петрович, завідувач лабораторії розведення червоно-рябої худоби та генофонду порід Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Провідна установа - Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок, м. Львів.

Захист дисертації відбудеться 23 березня 1999 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.65.356.02 при Інституті тваринництва УААН (312120, Харківська область, Харківський район, п/в Кулиничі).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту тваринництва УААН.

Автореферат розісланий 16 лютого 1999 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Снєгур Ф.М.

Анотації

Скляров П.М. Вплив антибіотиків і середовищ для культивування ооцитів in vitro на якісні показники сперми бугаїв.

Дисертація (рукопис) на здобуття наукового ступеню кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. Інститут тваринництва УААН. Харків, 1998.

В дисертації приведено дані про порівняльне вивчення виживаності сперми при використанні середовищ та добавок для культивування ооцитів in vitro. Розглянуто питання стосовно виживаності сперміїв в процесі обробки їх перед заплідненням in vitro (капацитації) і впливу цього процесу на результативність кріоконсервації.

Розроблено ефективний препарат для санації сперми бугаїв зі вмістом 25 мкг/мл гентаміцина і 100 ОД/мл ампіцилін, який забезпечує підвищення заплідненості сперми на 11-18%. З метою зберігання антимікробних властивостей запропоновано консервувати його в рідкому азоті при температурі - 196°С.

Ключові слова: сперма, спермії, середовище, добавка, виживаність, капацитація, кріоконсервація, заплідненість, санація.

Скляров П.Н. Влияние антибиотиков и сред для культивирования ооцитов in vitro на качественные показатели спермы быков.

Диссертация (рукопись) на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20. - биотехнология. Институт животноводства УААН. Харьков, 1998.

В диссертации приведены данные о сравнительном изучении выживаемости спермы при использовании сред и добавок для культивирования ооцитов in vitro. Установлено положительное влияние сред (TALP, BWW, Бринстера, ТСМ-199, Кребс-Рингера) и добавок (эпителия матки и яйцеводов, фолликулярной жидкости, фетальной сыворотки, гепарина, кофеина), которые используются для культивирования ооцитов и эмбрионов in vitro на выживаемость нативной и криоконсервированной спермы быков. Наиболее эффективной является среда TALP, а из добавок - эпителий яйцевода в концентрации 25%.

Рассмотрен вопрос, касающийся выживаемости спермиев в процессе обработки их перед оплодотворением in vitro (капацитации) и влияние этого процесса на результативность криоконсервации. Доказано, что процесс обработки перед оплодотворением in vitro не оказывает отрицательного влияния на выживаемость спермиев перед и после криоконсервации, а также на их оплодотворяющую способность.

Установлено положительное влияние комплекса антибиотиков гентамицина и ампициллина на выживаемость свежеразбавленной и замороженно-оттаянной спермы быков. Определено оптимальную концентрацию гентамицина (25 мкг/мл) и ампициллина (100 ЕД/мл), которые снижают микробную контаминацию спермы быков с сохранением её оплодотворяющей способности.

Разработан эффективный препарат для санации спермы быков, который обеспечивает повышение оплодотворяемости спермы на 11-18%. С целью сохранения антимикробных свойств предложено консервация его в жидком азоте при температуре - 196°С.

Ключевые слова: сперма, спермии, среда, добавка, выживаемость, капацитация, криоконсервация, оплодотворяемость, санация.

Sklyarov P.M. Effect of antibiotics and media for in vitro maturation of oocytes on qualitative characteristics of bull sperm.

The dissertation (manuscript) for the degree of "Candidate of Agricultural Sciences" in speciality 03.00.20. - biotechnology. Institute of Animal Science. Kharkov, 1998.

Data of a comparative study on sperm survival when medium and additions in vitro oocytes are used are given in the dissertation. The problem of spermatozoa survival in the course of their treatment before in vitro fertilization and influence of this process on cryopreservation was considered.

The effective preparation for bull semen sanation with 25 mg/mlgentamycin and 100 UE/ml ampicillin, which provided increase in bull semen fertility by 11-18% was developed. It was proposed to preserve in liquid nitrogen at temperature - 196°C to maintain its antimicrobial properties.

Key words: sperm, spermatozoa, medium, additive, survival, capacitation, cryopreservation, fertilizing ability, sanation.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сперма бугаїв використовується для штучного осіменіння і запліднення in vitro. В останньому випадку для її попередньої обробки (капацитації) і культивування з ооцитами застосовують різні середовища і добавки. Однак, при цьому практично не дослідженим залишається питання про вплив цих середовищ та добавок на такий показник сперми, як виживаність. сперма ооцит бугай антимікробний

При штучному осіменінні важливим є таке питання, як санація сперми бугаїв-плідників. Актуальність його пов'язана з тим, що існуючі методи одержання та зберігання сперми не забезпечують в усіх випадках вільної від мікроорганізмів сперми. Санація при цьому не завжди приводить до бажаних результатів в зв'язку з тим, що деякі препарати або не ефективні по відношенню до мікрофлори сперми, або є токсичними до сперміїв.

Мета досліджень. Метою досліджень було вивчення впливу на якісні показники сперми бугаїв синтетичних середовищ і добавок, які використовуються для культивування ооцитів in vitro, а також розробка ефективного антибактеріального препарату для санації сперми бугаїв-плідників.

В завдання досліджень входило:

1. Встановлення впливу на виживаність сперміїв середовищ і добавок для культивування ооцитів.

2. Визначення виживаності сперміїв в процесі капацитації.

3. Вивчення впливу обробки сперміїв перед заплідненням in vitro на результативність кріоконсервації.

4. Визначення впливу гентаміцину та ампіциліну на виживаність нативної сперми бугаїв.

5. Визначення виживаності і запліднювальної здатності сперміїв при додаванні антибіотиків перед заморожуванням і при розморожуванні.

6. Розробка ефективного антимікробного препарату для санації сперми бугаїв.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше дана біологічна порівняльна оцінка середовищ і добавок, які використовуються для культивування ооцитів поза організмом. Встановлено позитивний вплив середовищ (TALP, BWW, Брінстера, ТСМ-199, Кребс-Рінгера) і добавок (епітелію матки і яйцеводів, фолікулярної рідини, фетальної сироватки, гепарину, кофеїну), які використовуються для культивування ооцитів і ембріонів in vitro на виживаність нативної і кріоконсервованої сперми бугаїв. Найбільш ефективним було середовище TALP, а з добавок - епітелій яйцеводу в концентрації 25%. Доказано, що процес обробки сперміїв перед заплідненням in vitro не чинить негативного впливу на виживаність сперміїв перед і після кріоконсервації, а також на їх запліднювальну здатність.

Встановлено позитивний вплив комплексу антибіотиків гентаміцину і ампіциліну на виживаність свіжорозбавленої і заморожено-відтанутої сперми бугаїв. Визначено оптимальну концентрацію гентаміцину - 25 мкг/мл і ампіциліну - 100 ОД, які знижують мікробну контамінацію сперми бугаїв зі збереженням її запліднювальної здатності.

Розроблено антимікробне середовище для розморожування сперми бугаїв у відкритих гранулах і спосіб тривалого його зберігання в рідкому азоті.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено порівняльне вивчення виживаності сперміїв бугаїв при використанні середовищ і добавок для культивування in vitro, а також вивчено виживаність сперміїв у процесі обробки їх перед заплідненням in vitro і визначено вплив цього процесу на результативність кріоконсервації.

Розроблено препарат для санації сперми бугаїв, який забезпечує підвищення заплідненості сперми на 11-18 % і рівень мікробної забрудненості у відповідності до вимог держстандарту для сперми, замороженої у відкритих гранулах. Крім цього, практичне значення препарату полягає в тому, що він має антимікробну активність протягом тривалого часу при зберіганні в рідкому азоті і забезпечує санацію сперми безпосередньо перед введенням її в статеві шляхи самки.

Особистий внесок здобувача. Більшість досліджень виконано автором самостійно. Науково-виробничі досліди проведено за участю автора. Методичні підходи та схеми дослідів відпрацьовано спільно з науковим керівником.

Впровадження результатів досліджень. Результати досліджень впроваджено в д/г "Кутузівка", відділку "Фрунзе" д/г "Українка" та держплемзаводі "Червоний Велетень" Харківської області.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були викладені, обговорені і отримали позитивну оцінку на вчених радах Інституту тваринництва УААН, а також на Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження Яценка О.Е. (Харків, 1997р.); Міжнародній науково-виробничій конференції "Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин" (Асканія-Нова, 1997 р.); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження С.З. Гжицького "Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва" (Львів, 1997р.); Міжнародній конференції, присвяченій 70-річчю від дня народження Ф.І. Осташко (Харків, 1998р.); конференції молодих вчених ІТ УААН (Харків, 1998 р.); Міжнародній конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях" (Одеса, 1998 р.); Міжнародній науковій конференції "Стратегия и тактика борьбы с инфекционными болезнями" (Харків, 1998 р.).

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, висновків та пропозицій виробництву. Містить 38 таблиць, 1 рисунок та 11 додатків. Список літератури включає 352 найменування, у тому числі 179 іноземною мовою.

Матеріали та методика досліджень

Лабораторні дослідження проводилися в відділі біотехнології і генної інженерії Інституту тваринництва УААН і Харківській облсанепідстанції; науково-виробничі досліди - в відділку "Фрунзе" д/г "Українка", д/г "Кутузівка" і ДПЗ "Червоний Велетень" Харківської обл.

Матеріалом для досліджень була нативна сперма, одержана від бугаїв-плідників, які утримувалися на станції штучного осіменіння д/г "Українка", і заморожено-відтанута сперма з кріобанку відділу біотехнології і генної інженерії.

У дослідах використовували середовища TALP, BWW, Брінстера, ТСМ-199, Кребс-Рінгера і добавки - гепарин, кофеїн, епітелій матки і яйцеводу, фолікулярну рідину, фетальну сироватку.

Капацитацію сперміїв проводили шляхом інкубації з гепарином та центрифугування за методикою J.J. Parrish et al. (1986).

Заморожування сперми в облицьованих та відкритих гранулах проводили за Харківською технологією і на фторопластовій пластині за загальноприйнятою методикою з розрахунку не менш 15 млн. активних сперміїв в дозі після розморожування.

Середовища з антибіотиками готували з розрахунку 12, 25, 50 чи 100 мкг гентаміцину і 100 ОД ампіциліну на 1 мл середовища, для чого використовували 4%-ний розчин гентаміцину сульфату та ампіциліну натрієву сіль. Спермосан-3 додавали з розрахунку 50 тис. од. на 100 мл середовища.

Сануюче середовище для розморожування сперми після приготування розфасовували в поліетиленові ампули по 1 мл, герметично упаковували, заморожували шляхом занурення в рідкий азот, в якому зберігали до використання.

При деконсервації сперми попередньо розморожували середовище на водяній бані при t=40°С протягом 5 хв., а потім використовували його як звичайний 2,9 %-ний розчин цитрату натрію.

Виживаність і абсолютний показник виживаності сперми визначали за В.К. Міловановим (1962):

,

де - показник початкової активності сперміїв;

- сума показників активності через кожну годину.

Коефіцієнт токсичності (нешкідливості) розраховували за формулою, запропонованою М.Г. Балашовим (1972):

де - середнє число рухливих сперміїв у вихідній спермі;

- середнє число рухливих сперміїв через 3 години після розбавлення сперми середовищем з препаратом.

Запліднюючу здатність сперміїв визначали за відсутності наступних статевих циклів протягом 2-х місяців і за даними ректального дослідження на тільність після осіменіння через 3 місяці. Заплідненість визначали за відсотком тільних від загальної кількості первинно осіменених корів. В досліді і контролі використовували клінічно здорових тварин за принципом груп-аналогів за породою, віком і часом прояву першого статевого циклу після отелення. Виявлення корів в охоті проводили двічі на добу (вранці та ввечері). Сперму вводили мано- і ректо-цервікальним способами згідно діючої інструкції.

Відбір проб та бактеріологічні дослідження проводили відповідно до держстандартів 20909.1-75 та 20909.2-75.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою персо-нального комп'ютера Pentium-120 згідно програмного забезпечення: WORD 7.0, EXEL 7.0, MICROSOFT OFFICE фірми "MICROSOFT" (Ойвин И.А., Плохинский Н.А., 1970, Лакин Г.Ф., 1990).

Результати досліджень

В першій серії дослідів ми вивчали вплив на виживаність сперміїв середовищ та добавок для культивування in vitro ооцитів. Результати досліджень приведено в табл. 1.

Таблиця 1 Виживаність сперміїв в середовищах для культивування in vitro

В ході досліджень було встановлено, що в дослідному середовищі TALP в порівнянні з контролем виживаність підвищувалась для заморожено-відтанутої і нативної сперми на 2,0 і 3,1 год. (Р<0,001), а абсолютний показник виживаності на 3,6 і 7,5 од. (Р<0,01), відповідно. В середовищі BWW дослідні показники були вище контрольних на 1,7 год. (Р<0,001) і 1,6 год. - для нативної та 2,8 од. (Р<0,001) і 3,3 од. - для заморожено-відтанутої сперми. Досліди з середовищем Брінстера показали, що в порівнянні з контролем виживаність і абсолютний показник виживаності підвищувалися на 1,7 год. (Р<0,001) і 3,1 од. - для нативної і 0,5 год. (Р<0,001) і 2,3 од. - для заморожено-відтанутої сперми. В середовищі ТС-199 ці показники були вище контрольних на 1,1 год., 3,7 од. та 1,2 год. (Р<0,01), 2,4 од., відповідно для нативної та заморожено-відтанутої сперми. В середовищі Кребс-Рінгера показники виживаності сперміїв в порівнянні з контролем збільшувалися на 0,5 год., 1,2 од. - для нативної і на 0,3 год., 0,5 од. - для заморожено-відтанутої сперми.

В результаті досліджень було встановлено, що перевірені середовища для культивування in vitro позитивно впливали на виживаність сперміїв бугаїв. Показники виживаності в середовищах погіршувалися в такій послідовності: 1) TALP, 2) Брінстера, 3) BWW, 4) ТСМ-199 і 5) Кребс-Рінгера.

В наступній серії дослідів ми вивчали вплив різних добавок для культивування сперміїв і ооцитів на виживаність сперміїв бугаїв. Результати приведено в табл. 2.

При використанні гепарину було встановлено, що він у всіх досліджуваних концентраціях підвищував виживаність сперміїв в порівнянні з контролем. Найкращі результати було одержано при додаванні 100 ОД гепарину. При цьому виживаність і абсолютний показник виживаності перевищували контроль на 1,8 год. (Р<0,001), 5,9 од. (Р<0,01) - для нативної і на 1,6 год. (Р<0,01), 2,0 од. (Р<0,01) - для заморожено-відтанутої сперми. Найбільш ефективною концентрацією кофеїну виявилося додавання його в дозі 600 мкг. При цьому виживаність і абсолютний показник виживаності перевищували контроль на 1,5 год. (Р<0,01), 4,8 од. (Р<0,01) та 0,7 год. (Р<0,01), 1,6 од. (Р<0,01), відповідно для нативної і заморожено-відтанутої сперми. Епітелій матки найбільш ефективний був у 25% концентрації, коли виживаність і абсолютний показник виживаності в досліді були краще контрольних на 0,8 год., 3,0 од. і 0,5 год. (Р<0,01), 1,6 од., відповідно.

При додаванні епітеліальних клітин яйцеводу найкращі показники виживаності спостерігалися при додаванні їх в концентрації 25 %, дослідні показники були вище контролю на 2,0 год. (Р<0,001), а абсолютний показник виживаності - 3,4 од. -- відповідно для нативної і на 1,8 год. (Р<0,01), 2,8 од. - для заморожено-відтанутої сперми. Найкращі результати при використанні фолікулярної рідини було одержано при додаванні її в концентрації 25%, коли в досліді виживаність і абсолютний показник виживаності були вище контролю на 2 год. (Р<0,01), 3,5 од. та 0,6 год. (Р<0,01), 1,8 од. - відповідно, для нативної і заморожено-відтанутої сперми.

Фетальна сироватка найбільш ефективною була при додаванні її в 10% концентрації, в цьому випадку дослідні показники виживаності були вище контрольних на 1,8 год. (Р<0,001), абсолютний показник виживаності - 9,9 од. (Р<0,001) та на 1,1 год. (Р<0,01), 3,2 од. (Р<0,01) - відповідно для нативної і заморожено-відтанутої сперми.

Таблиця 2 Виживаність сперміїв при використанні добавок (на 1 мл цитрату натрію)

Досліди з використанням добавок показали, що добавки, як і середовища, не впливають негативно на виживаність сперміїв бугаїв, а навпаки, в тій чи іншій мірі покращують їх.

Це свідчить про те, що добавки сприятливо діють на обмін речовин сперміїв і їх фізіологічний стан.

Таблиця 3 Виживаність сперміїв бугаїв в процесі капацитації

В ході досліду було встановлено, що найкращі показники було одержано після інкубації сперміїв з гепарином, а після центрифугування спостерігалася тенденція до зниження виживаності. Однак в порівнянні з контролем дослідні показники виживаності були кращими в усіх випадках. Тобто процес обробки сперміїв перед заплідненням in vitro не впливав негативно на виживаність сперміїв.

У наступних експериментах вивчали дію цього ж процесу на результативність кріоконсервації і осіменіння. Результати досліду приведено в табл. 4.

Таблиця 4 Виживаність та заплідненість капацитованих сперміїв бугаїв після заморожування-відтавання

При дослідженні сперми, замороженої в відкритих гранулах встановлено (див. табл. 7), що оптимальним є додавання антибіотиків тільки при розморожуванні, так як при додаванні антибіотиків перед заморожуванням заплідненість була нижче, а додавання антибіотиків одночасно при заморожуванні і розморожуванні, як встановили раніше, було токсичним по відношенню до сперміїв.

Таблиця 7 Додавання антибіотиків при заморожуванні і розморожуванні сперми в відкритих гранулах

Враховуючи раніше одержані дані по виживаності, мікробній забрудненості, заплідненості сперми при додаванні антибіотиків, а також їх токсичності по відношенню до сперміїв і чутливості до них мікрофлори, нами було розроблено сануюче середовище для розморожування сперми бугаїв, замороженої в відкритих гранулах (пріоритетна довідка на патент №98062850 від 02.06.1998 р.) і проведено виробничий дослід по його застосуванню. Результати досліду приведено в табл. 8.

Даним середовищем є 2,9%-вий розчин натрій лимоннокислого тризаміщеного п'ятиводного, в який з метою надання йому антимікробних властивостей ми ввели антибіотики широкого спектру дії гентаміцин та ампіцилін в концентрації 25 мкг/мл і 100 ОД/мл, відповідно. Крім цього, з метою більш тривалого зберігання ним антимікробних властивостей його зберігають в рідкому азоті при температурі - 196°С.

Таблиця 8 Заплідненість корів при використанні сануючого середовища

При використанні довгозбереженого середовища було осіменено в загальній кількості 259 голів, з яких тільними виявилося 162 голови (62%). В контролі було осіменено 224 голови, з яких тільними виявилося 108 голів (48%). Тобто, застосування сануючого середовища підвищувало заплідненість сперми на 14%.

Висновки

1. Всі досліджені середовища (TALP, BWW, Брінстера, ТСМ-199 і Кребс-Рінгера) для культивування ооцитів підвищували виживаність нативної і заморожено-відтанутої сперми. Найбільш ефективним було середовище TALP, при використанні якого виживаність була вище не тільки в порівнянні з контролем, але й в порівнянні з іншими дослідними середовищами.

2. Всі досліджені добавки (гепарин, кофеїн, епітелій матки і яйцеводів, фетальна сироватка і фолікулярна рідина), які застосовуються для культивування in vitro, підвищували виживаність сперміїв. Найбільш ефективною з застосованих добавок було додавання клітин епітелію яйцеводу корів в концентрації 25 %, коли показники виживаності були вище як контрольних, так і інших дослідних.

3. В процесі капацитації (обробки сперміїв перед заплідненням in vitro) виживаність сперміїв нативної і заморожено-відтанутої сперми бугаїв не знижувався в порівнянні з контролем, а навіть мала тенденцію до покращення.

4. Процес обробки сперміїв перед заплідненням in vitro не чинив негативного впливу на результативність кріоконсервації, тобто на виживаність і заплідненість сперми.

5. Для пригнічення мікробної контамінації нативної сперми відповідно до норм держстандарту оптимальним було додавання антибіотиків гентаміцину і ампіциліну в концентрації відповідно 25 мкг та 100 ОД на 1 мл середовища.

6. При заморожуванні сперми в облицьованих гранулах її санації оптимальним було додавання 25 мкг гентаміцину і 100 ОД ампіциліну на 1 мл середовища №1 перед заморожуванням, що підвищувало її виживаність після деконсервації в порівнянні зі спермою, яка не містила антибіотиків і з додаванням антибіотиків в обидва середовища.

7. Для санації сперми, замороженої в відкритих гранулах, оптимальним було додавання антибіотиків при розморожуванні в концентрації 25 мкг гентаміцину і 100 ОД ампіциліну на 1 мл 2,9 %-ного розчину натрію лимоннокислого тризаміщеного п'ятиводного.

8. Рівень мікробної забрудненості в відповідності до вимог держстандарту для сперми, замороженої в відкритих гранулах, забезпечувався лише при додаванні антибіотиків в процесі розморожування.

9. Розроблено ефективне антимікробне середовище для розморожування сперми бугаїв, яке забезпечує рівень мікробної забрудненості відповідно до вимог держстандарту, а також підвищує заплідненість на 11-18 %, зберігаючи при цьому бактерицидну дію на протязі тривалого часу завдяки зберіганню її при температурі - 196°С.

Пропозиції виробництву

1. Для санації сперми бугаїв з метою підвищення її біологічної та санітарної якості, а також запліднюваності корів та телиць пропонується використовувати додавання 25 мкг гентаміцину і 100 ОД ампіциліну на 1 мл середовища №1 при заморожуванні в облицьованих гранулах.

2. Для санації сперми, замороженої у відкритих гранулах, рекомендується розмороження її в 2,9 %-ному розчині натрію лимоннокислого тризаміщеного п'ятиводного з додаванням 25 мкг гентаміцину і 100 ОД ампіциліну на 1 мл.

4. Одержані дані можна використовувати в ВУЗах для читання лекцій.

Список опублікованих робіт на тему дисертації

1. Скляров П.М. Вплив комплексу антибіотиків гентаміцин+ампіцилін на переживаємість та запліднювальну здатність сперміїв бугаїв-плідників //Зб. наукових праць "Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини". - Харків. - 1998. - Вип. 3. - С.54-58.

2. Скляров П.Н. Определение влияния антибиотиков (ампициллина и гентамицина) на переживаемость спермиев быков //Науково-технічний бюлетень ІТ УААН. - Харків. - 1998. - №74. - С.44-48.

3. Бугров О.Д., Скляров П.М. Додавання антибіотиків в сперму бугаїв //Зб. наукових праць "Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини". - Харків. - 1998. - Випуск 3. - С.52-54.

4. Бугров А.Д., Скляров П.Н. Криоконсервация капацитированных спермиев //Зб. матеріалів ІІ Міжнародної конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях". - Одеса. - 1998. - С.85-86.

5. Бугров А.Д., Скляров П.Н. Предупреждение микробной загрязнённости спермы быков //Зб. матеріалів ІІ Міжнародної конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях". - Одеса. - 1998. - С.88-90.

6. Бугров А.Д., Скляров П.Н. Результаты осеменения спермой, содержащей антибиотики //Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції, присвяченої 100-річчю від дня народження О.Ю. Яценка. - Харків. - 1998. - С.119-120.

7. Бугров О.Д., Тихона Г.С., Скляров П.М. Використання комплексу антибіотиків гентаміцина з ампіциліном для деконтамінації ембріонів корів та сперми бугаїв //Зб. статей Міжнародної науково-практичної конференції, присвяченої 100-річчю Львівської ветеринарної академії ім. С.З. Гжицького "Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва". - Львів. - 1997. - С.120-121.

8. Бугров А.Д., Тихона Г.С., Скляров П.Н. Использование комплекса антибиотиков гентамицина и ампициллина для санации спермы и эмбрионов //Матеріали Міжнародної науково-виробничої конференції "Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні с.- г. тварин". - Київ, Асканія-Нова. - 1997. - С.78-79.

9. Заявка на винахід №98062850 від 02.06.1998 р. з пріоритетом //Бугров О.Д., Скляров П.М. /Сануюче середовище для розморожування сперми сільськогосподарських тварин.

Размещено на Allbest.ru