Размещено на http://www.allbest.ru/

ДНК-ДІАГНОСТИКА - ОБОВ'ЯЗКОВА УМОВА ВИСОКОРЕНТАБЕЛЬНИХ ТЕХНОЛОГІЙ СУЧАСНОГО ТВАРИННИЦТВА

М.І. Гиль, доктор сільськогосподарських наук,

професор

Сучасне сільськогосподарське тваринництво потребує різкого прискорення процесу створення й удосконалення порід, які б поєднували з високою продуктивністю стійкість до біотичних та абіотичних стресів, забезпечення продукцією певної якості і пристосованість до промислових технологій. Традиційні методи відбору за такими ознаками стають малоефективними, тому необхідний пошук нових під - ходів, які б дали змогу виявити якісно нові характеристики. Вони повинні відповідати ряду вимог, зокрема тестуватися на ранніх стадіях онтогенезу, не залежати від навколишнього середовища, мати простий характер успадкування. Таким вимогам відповідають молекулярно-генетичні маркери. Їх застосування у селекції було теоретично обґрунтоване О.С. Серебровським у 20-ті роки ХХ століття [19, 31]. Можна виділити три основних типи молекулярно-генетичних маркерів: імуногенетичні, біохімічні та ДНК-маркери.

Методика досліджень. На основі матеріалів наукових досліджень вітчизняних та світових лабораторій і академічних закладів [1-7, 9-80], власних дослідів [8] зроблено аналіз можливостей використання ДНК-технологій для забезпечення високорентабельних технологій сучасного тваринництва.

Результати досліджень. За останні роки накопичився великий масив даних про ефективність використання молекулярно-генетичних маркерів як на рівні білків, так і на рівні ДНК і РНК, для вирішення численних завдань генетики, селекції, збереження біорізноманітності, еволюції, картування хромосом, племінної справи [5, 7, 9-12, 15, 16, 29, 30, 33].

Так, у свинарстві відомо більше 100 еритроцитарних антигенів, які входять до 16 генетичних систем, а також ряд антигенів форменних елементів крові [25], використання яких дозволяє досліджувати структуру порід окремих генеалогічних ліній, вести селекцію за маркерами, типовими для їх представників. Проте, на основі тільки цього класу маркерів, не вдається повністю охарактеризувати рівень генетичної мінливості груп тварин, які селекціонуються, крім того, здебільшого вони не мають зв'язку з господарсько-корисними ознаками. Іншим способом оцінки генетичної мінливості є дослідження генетично детермінованого поліморфізму білків, що дозволяє виявити більшість алельних варіантів одного локусу. Приваблює тут моногенний характер успадкування, можливість одночасного аналізу великої вибірки живих організмів [26]. Однак, використання цих маркерів у селекційній практиці носить обмежений характер, що зумовлено низьким ступенем біохімічного поліморфізму у більшості свійських тварин [9, 34, 35]. Обґрунтовано погляд на те, що оцінка середньої гетерозиготності популяції на основі біохімічного поліморфізму є істотно заниженою порівняно з реальною [29], що пояснюється тим, що заміна однієї амінокислоти в структурі поліпептиду не завжди призводить до зміни сумарного електричного заряду і тому не може бути виявлено методом електрофоретичного розподілення білків. Крім того, аналіз структури білків дає змогу тестувати зміни тільки в сайтах-екзонах відповідних оперонів.

Принципово нові можливості в дослідженні генетичного матеріалу відкрилися у зв'язку з розвитком методів аналізу ДНК і виявленням поліморфізму різного класу її послідовностей. Одним із видів ДНК-маркірування є виявлення ДНК-поліморфізму за допомогою рестриктного аналізу, що отримав назву "поліморфізм довжини рестриктних фрагментів" (ПДРФ). Основою виникнення ПДРФ є декілька джерел: крапкові мутації [16], великі делеції та інсерції, транспозиції мобільних генетичних елементів. Позитивними якостями ПДРФ - маркерів є менделівський тип успадкування та його стабільність, кодомінантність прояву, відсутність плейотропного ефекту та високий ступінь поліморфізму. У методичному плані, зручність ПДРФ полягає в можливості виявлення цієї групи маркерів в усіх органах і тканинах на будь-яких стадіях розвитку досліджуваних об'єктів, довготривалість збереження зразків ДНК. Можливості ПДРФ практично не обмежені й залежать, головним чином, від кількості зондів, що використовуються, і набору ферментів рестрикції [33].

Викликає значну зацікавленість і методичний підхід, який грунтується на виявленні високоваріабельних послідовностей, що містять тандемні повтори сателітної ДНК - мінісателітної і мікросателітної. Відомо, що мікросателітні послідовності не транслюються, але існує припущення про їх участь в процесах компактизації хромосом [9]. В той час як мінісателітна ДНК не несе змістовної інформації, але їй притаманна схильність до мейотичних рекомбінацій, що обумовлює виникнення алельних варіантів. Так, тандемні повтори в геномі свиней представлені різними послідовностями. Наприклад, одна з них містить кору 15-18 пар основ із структурою, що незначно змінюється [16]. Визначено, що більше 13% всіх секвенованих генів свиней представлені простими послідовностями, що повторюються [9]. Останнім часом для виявлення міні- і мікросателітної ДНК найчастіше використовують "полімеразну ланцюгову реакцію" (ПЛР), завдяки чому стало можливим проведення аналізу її поліморфізму за кожним, окремо обраним локусом. Маркерні системи, основані на виявленні сателітів та інші генетико-молекулярні технології аналізу спадковості тварин, можуть і відкривають можливості для генотипування організмів, паспортизації ліній і порід, характеристики популяцій, встановлення зв'язку поліморфізму окремих генів з локусами, які беруть участь у формуванні господарсько корисних ознак, у підвищенні продуктивності та племінних якостей сільськогосподарських тварин, діагностики їх окремих захворювань [8].

Виділяють такі основні напрями використання ДНК-технологій у тваринництві: дослідження геному сільськогосподарських видів тварин на наявність продуктивних якостей для вирішення селекційних завдань (MAS - Marker Assisted Selection - селекція за допомогою маркерів); дослідження генетичної структури організмів, створення генетичних паспортів порід, видів, таксономічних груп; виявлення генетичних захворювань на ранніх стадіях розвитку організму; діагностика інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин і проведення епізоотологічного моніторингу; діагностика статі ембріонів великої рогатої худоби; контроль якості сільськогосподарської сировини і продуктів харчування. Одні з цих напрямків не лише добре відпрацьовані, але й упроваджені у практику тваринництва, інші ж перебувають на стадії апробації [13, 14].

Простежено зв'язок алельних варіантів гена соматотропіну з молочною продуктивністю. З цією метою за локусом даного гена було протестовано основні породи великої рогатої худоби США, Канади, Японії [2, 50, 52, 59, 80]. З використанням 181 мікросателітного маркера у 5 хромосомах із 29 аутосом у великої рогатої худоби були картовані локуси кількісних ознак, пов'язані з молочною продуктивністю [43]. Вже визначено локалізацію головних генів молочної продуктивності худоби у хромосомах 1, 6, 9, 10 і 20, які асоційовані з такими характеристиками, як загальний надій у першу лактацію, масова частка жиру і білка у молоці [16].

Одним із маркерів, асоційованих з локусами кількісних ознак, є ген високої плодючості у овець породи бурулла-ген Fec B. Експресія цього гена обумовлює підвищення кількості овулюючих яйцеклітин і великий приплід у овець бурулла - як гомозигот, так і гетерозигот за геном Fec B. Прояв цього гена підтверджено в овець порід кембрідж, фінська, романівська, австралійський меринос [28, 54].

Відомо, що якість молока і можливість його використання у сироварінні пов'язана з наявністю алелей к-Cn. Розроблено надійний засіб, який дозволить тестувати А і В варіанти гена казеїну в ПЛР з подальшим ПДРФ-аналізом за рестриктазами Hind III, Tag I або Pst I [32, 56]. Практика свідчить, що високоякісні тверді сири можуть бути виготовлені лише із молока, отриманого від корів, які є носіями ВВ-генотипу за локусом к-Cn. Зважаючи на це, перетворення комбінованих порід великої рогатої худоби у нові молочні шляхом голштинізації є невиправданим саме тому, що більша частина к-Cn у молоці корів комбінованих порід належить до типу ВВ чи АВ, а се - ред к-Cn генотипів молочних порід переважає тип АА [8]. Дані, опубліковані в США [48], свідчать, що частка генотипу ВВ к-Cn для джерсейської породи складає 80%, швіцької - 65%, гернсейської - 30%, голштино-фризької - 20%. Виявлено, що частота к-Cn генів у датських фризів практично ідентична з їх частотою у голштино-фризів [39, 40]. Відповідно до результатів, отриманих J. Medrano, E. Aquilar-Cordova [62], частота алелі В складає 0,370 у тварин голштинcької породи, 0,300 - у популяції айрширської худоби, 0,450 - у джерсейській попу - ляції. А частота алелі А серед казеїнових варіантів генотипів к-Cn у голштино-фризькій популяції великої рогатої худоби в Угорщині була значно вищою частоти алелі В, що узгоджується з попередніми даними. У чистопородних голштино-фризів і помісних корів співвідношення генотипів АА та АВ склало відповідно 58,6% та 40%, тимчасом як бажаний ВВ-генотип - лише 1,4% [41]. За даними словацьких дослідників, частота В-алелі у голштино-фризів склала 0,210, у тварин чорно-рябої породи (німецький тип) - 0,220, симентальської породи - 0,560 і у породи пінцгау - 0,240 [74]. При порівняльному аналізі генетичної різноманітності порід Росії високу частоту алелі В за локусом к-Cn (q = 0,598, n = 642) виявлено в ярославської породи, а в інших порід найпоширенішим є алель А [4]. В Україні роботи з визначення генотипів порід великої рогатої худоби за локусом гена к-Cn з використанням методу ПЛР виконуються в лабораторії ДНК-технологій Інституту агроекології та біотехнології НААН України та ін. [9, 17, 18, 21, 22, 24].

Порівняльний аналіз серед локальних та імпортованих в Україну порід великої рогатої худоби на наявність А і В алелів к-Cn показав, що локальні породи виділяються більш високою частотою В-алельного варіанта к-Cn. Висока частота зустрічальності ВВ-гомозигот у ярославської, червоної горбатівської, костромської, сірої української та лебединської порід. В англійської аборигенної породи - чорної уельської - частота ВВ - генотипу складає всього 4%. Частота зустрічальності В-алеля к-Cn у чорно-рябих голштино-фризів, імпортованих в Україну із Канади й Німеччини, а також у вітчизняної чорно-рябої ху - доби складає 0,105-0,293. Підвищеною частотою зустрічальності В-аллеля і гомозиготи ВВ виділялася чорно-ряба худоба, яка відтворюється в 30-кілометровій зоні Чорнобильської АЕС (0,387) [23]. Дослідження поліморфізму лактопротеїнів у чистопородних стадах червоної степової породи довели, що к-Cn у худоби цієї породи є двоалельною системою з алелями А і В, які мають частоту 0,65 і 0,35 відповідно [27]. Отже, знаючи розподіл к-Cn варіантів у окремих порід великої рогатої худоби, можна підібрати стадо корів, молоко яких буде використовуватися за цільовим призначенням - для виробництва високоякісних твердих сирів.

Останнім часом великого значення набуває визначення статі ембріонів великої рогатої худоби як додаток до запліднення і культивування ембріонів in vitro, оскільки це дозволяє накопичувати і пересаджувати ембріони бажаної статі. Один із способів діагностики статі за допомогою ПЛР оснований на ампліфікації Y-специфічних повторюваних послідовностей [1,37, 46, 47, 61, 68, 69].

На особливу увагу заслуговує вивчення поліморфізму гена гормону росту, що кодує важливий гормон гіпофізу - соматотропін, який обумовлює ріст організму та бере участь у багатьох обмінних процесах. Комплементарна ДНК гормону росту свині була клонована спочатку в 1983 [72] і пізніше в

1988 роках [20]. Виділено також хромосомні гени гормону росту пролактину і соматотропіну людини та деяких видів тварин. Хромосомний ген гормону росту свині був клонований у 1987 році [75]. P. D. Vize, J. R. E. Wells [75] клонували та секвенували фрагменти ДНК хромосоми свині розміром у 2231 п. н., який містить ген гормону росту. Клонований фрагмент, окрім кодуючих послідовностей та інтронів, містив 238 п. н. з 5 кінця гену до послідовності АТГ кодону першої амінокислоти прогормону та 412 пар нуклеотидів 3 кінця від термінуючого кодона. Як і інші члени GH-родини ген соматотропіну свині має п'ять екзонів і 4 інтрони розміром 242, 210, 197, 278 п. н., які локалізовані у позиціях, аналогічних генам соматотропінів інших видів тварин, що в цілому складає близько 2000 п. н. [42,44]. Щодо відомостей про структуру гена та організацію його локусу у великої рогатої худоби та свиней [63, 78], можна зробити висновок про наявність однієї його копії в хромосомах, хоча існують дані про присутність у геномі свиней ще одного гена гормону росту, відмінного від відомого [3]. У геномі людини ген гормону росту представлений двома копіями, які організовані в GH-локус 17-ої хромосоми у вигляді кластера, що містить 5 генів: 2 гени гормону росту та 3 гена хоріонічного соматомамматропіну [57]. Найчастіше в крові ссавців, риб та птиці зустрічається так звана нативна форма соматотропіну з молекулярною масою від 21 до 23 кДа. Первинна структура генів, що його кодують, встановлена для багатьох видів тварин [64, 79]. Так, наприклад, у людини ця форма кодується так званим нормальним геном (hGH-N) і локалізована в 17 хромосомі. У свиней відповідний ген знаходиться у 12-й [36], а у великої рогатої худоби - в 19-й парі хромосом [77]. Для вивчення механізму еволюції генів GH-родина є найбільш придатною моделлю [42, 73, 77]. Припускається, що еволюція від предкового гена до кластера проходила завдяки великій дуплікації та подальшій дивергенції послідовностей. Насиченість флангів, інтронних ділянок генів гормону росту помірними повторами створює передумови для підвищеної рекомбінантної здатності локусу [6, 42, 65]. В 5 та 3 кінцевих ділянках та інтронах гена гормону росту знаходяться структури, яким властива взаємодія з різноманітними регуляторними факторами. Наприклад, у першому та четвертому інтронах гена гормону росту свині виявляється коротка гексануклеотидна послідовність TGT (T/C) CT, яка необхідна для забезпечення зв'язку з глюкокортикоїд - рецепторним комплексом [78]. У гені гормону росту людини такі глюкопротеїд-рецептор-зв'язуючі ділянки знаходяться у частині першого інтрону та в межах 290 п. н.5 - фланкуючої послідовності [70].

Специфічність експресії гена також забезпечується взаємодією факторів клітини з його певними ділянками. Так, у гені гормону росту людини та щура, вони специфічно поєднуються з 5-кінцевою ділянкою [58, 76]. У разі виникнення мутації в цих ділянках, порушується генна експресія. Таким чином, GH-локус в геномі тварин і людини має ряд елементів регулювання експресії, що забезпечує тканинноспецифічність транскрипції генів гормону росту, а також її контроль з боку гормональних факторів. Зміни, які можуть відбуватися в структурних та регуляторних ділянках гена, означають утворення нових алелей гена. Засобів виявлення таких алелей існує декілька: секвенування певних ділянок гена, виявлення ПДРФ, локус-специфічна ампліфікація з подальшим рестриктним аналізом ампліфікатів, ДНК-фінгерпринтінг. Вже в перших дослідженнях ПДРФ гена гормону росту було виявлено широкий поліморфізм фрагментів рестрикції. Так, для голштино-фризької рогатої худоби і гібридів виявлено 8 генотипів за довжиною фрагментів, що гібридизувалися із зондом рестриктних фрагментів [38]. А в дослідженнях Hallerman із співавторами [45] в популяціях тварин цієї ж породи і синтетичної чотирьохпородної лінії за рестриктазою EcoR1, HindIII і BgIII ідентифіковано за 3 гібридизаційними генотипами (фрагменти розміром від 4, 1 до 26 кб), за рестриктазою Bam H1 - чотири генотипи. Припускалося, що більшість виявлених ПДРФ є наслідком інсерційно-делеційних подій, що локалізувалися нижче структурного гена. Попередні дані вказували на можливе фізіологічне значення варіантів гена. Так, тварини, для яких характерні більш малі BgIII, BamH1 - фрагменти рестрикції, що гібридизувалися з зондом до гена гормону росту, мали більш високу швидкість росту.

Виявлено ПДРФ гена GН овець, який локалізований на ділянці 11 - ї хромосоми. Знайдено дві системи ПДРФ: при дії рестриктази TagI виявлено 4 алелі 490, 460, 450 п. н., мономорфний варіант - 560 п. н. При дії Pvu-II виявлено також два алелі - 520 і 410 п. н. Всі ідентифіковані алелі успадковуються кодомінантно [67]. Використовуючи техніку ПЛР-ампліфікації, B. W. Kirkpatrick, B. M. Huff [49] виявили поліморфізм гена гормону росту свині інсерційного походження в його 5 фланкуючій області і в другому інтроні. Австрійські дослідники за допомогою методу ПЛР-ампліфікації фрагментів 2 інтрона гена гормону росту провели аналіз його ПДРФ у свиней породи австрійський ландрас і австрійська велика біла. Встановлено суттєву диференціацію порід за частотами варіантів гена, причому підвищені частоти алелів Hae II - та MspI+ притаманні породі ландрас. Виявлений позитивний кореляційний зв'язок між варіантами гена гормону росту та ріанодин-рецепторного гена (відповідального за розвиток стресу у тварини), на думку авторів, може мати важливе селекційне значення [71]. Аналіз ампліфікованого фрагмента gGH свині, розміром 605 п. н. між позиціями 119 і 148 у тварин різних генотипів виявив два алелі за ApaI-сайту рестрикції і 4 алелі по двох CfoI-сайтах [55]. Вивчення успадкування алелей, а також гаплотипів ApaI/CfoI у родинному аналізі привело до висновку про менделівський характер їх розподілу. Важливо, що окремі зміни в структурі гена можуть призводити до амінокислотних замін у соматотропіні. Така ситуація має місце в положеннях 328, 368, і 377 карти гена (нумерація відповідна тій, яку використовували Vize P. D., Wells J. R. E. [75]) у другому екзоні. CfoI, DdeI і HaeII-сайти рестрикції виявляють заміни у білку: аланіну на валін, глютаміну на аргінін і аспарагінової кислоти на гліцин, відповідно. Відомості про виявлення в гіпофізах подібних варіантів соматотропіну відсутні.

Знайдений ПЛР-рестриктний поліморфізм і для gGH бугая за ендонуклеазою ALuI, який виступає джерелом амінокис - лотних замін: лейцину в 127 положенні на валін і треоніну в

172 положенні на метионін [53]. Характерно, що метіонін в 172 положенні поліпептидного ланцюжка характерний тільки для місцевої японської худоби, в той час як алельні варіанти соматотропіну, що знаходяться в позиції 127 поліпептиду спостерігаються у всіх широко розповсюджених порід (голштинській, абердин-ангуській, герефордській). Не знайдено зв'язок між параметрами тіла тварин та варіантами гена. У дослідженнях M. C. Lucy et al. [60] показано зв'язок між генотипами корів із алельними варіантами гена за амінокислотною заміною валін-лейцин в 127-й позиції поліпептиду і молочною продуктивністю. Тварини, гомозиготні за алелем валіну, мали більш високі показники надою за лактацію, хоча за вмістом жиру та білку в молоці, значних розбіжностей у різних генотипів не виявлено.

Досліджено ДНК-поліморфізм в ТАТА-боксі gGH свиней різних порід у зв'язку із вмістом соматотропіну в гіпофізах і крові тварин, показниками розвитку та їх продуктивними якостями [66], в результаті чого виявлено вірогідну різницю за швидкістю росту між двома альтернативними ТАТА-гомозиготами і зроблено висновок про те, що GH-ген контролює цю кількісну ознаку. Продемонстрований зв'язок генетичних варіантів GH із вісьмома показниками відкладення жиру в туші свиней F2 родини мейшанЧп'єтрен [51]. Однак, серед тварин, що були використані в досліді, представлено тільки 14 різних генотипів та відсутня інформація про ефект окремих гаплотипів або алелей. Незважаючи на це, автори роблять висновок про безпосередній зв'язок між варіантами гена та показниками відкладення жиру в тушах.

Необхідно підкреслити, що більшість нуклеотидних замін у gGH припадає на сайти інтронів (1-й та 2-й) і 5-фланкуючої ділянки, особливістю яких є насиченість послідовностями, які відповідають за його експресію. Можна припустити, що деякі з цих нуклеотидних змін, що призводять до утворення алелей на рівні ДНК, мають фенотиповий вираз у вигляді зміни контролю експресії, іншими словами, алелі gGH можуть відрізнятися рівнем і специфічністю синтезу соматотропіну, а також регуляцією з боку різноманітних факторів [2].

Таким чином, генетичний поліморфізм соматотропіну може проявлятися як у вигляді варіантів білка, яким відповідають певні зміни у кодуючій частині гена, так зі у вигляді таких ДНК-алелей, походження яких пов'язано із замінами нуклеотидів і перебудовами в некодуючих ділянках та виявляються за допомогою вищевказаних методів виявлення ПДРФ. Рівень генетичного поліморфізму соматотропіна (ДНК-алелей) достатньо високий для того, щоб на його основі була створена генетична маркерна система, яка б за своєю інформативністю не поступалася імуногенетичним та білковим маркерам.

Безперечно, використання нетрадиційних методів селекції а також осмислення складних генетичних процесів, що відбуваються в популяціях тварин, дадуть змогу значно iнтенсифiкувати селекційний процес, зберегти i значно поліпшити iснуючi породи тварин, а також створити нові високопродуктивні породи, що вiдповiдають вимогам ринку та сучасним технологіям.

Перспективи подальших досліджень. Розв'язання маркерних характеристик за умов використання ДНК-типування тварин вже сьогодні визначило у технологіях тваринництва новітній напрям - геноміки й геномної селекції, що має стати у найскоріші терміни основою селекційно-племінної роботи. А обов'язковість проведення тестів з визначенням поліморфізму ДНК має бути внесено у ранг Закону України "Про племінну справу", на заміну імуногенетичного тестування тварин.

тваринництво молекулярний генетичний маркер

Література