Генетична структура м’ясних порід великої рогатої худоби Шароле та Герефорд за різними типами ДНК-маркерів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетична структура м'ясних порід великої рогатої худоби Шароле та Герефорд за різними типами ДНК-маркерів

Анотація

М.Л. Добрянська, молодший науковий співробітник К.В. Копилова, кандидат сільськогосподарських наук Ю.В. Подоба, кандидат сільськогосподарських наук

Л.В. Вишневський, кандидат сільськогосподарських наук К.В. Копилов, доктор сільськогосподарських наук Інститут розведення і генетики тварин НААН, Україна

Проведено аналіз генетичної структури тварин великої рогатої худоби м'ясного напрямку продуктивності за поліморфізмом генів тиреоглобуліну (TG), калпаїну (CAPN1 530) та ISSR-PCR - маркерами. Виявлено особливості генетичної структури тварин шароле та герефорд за поліморфізмом фрагментів ДНК, отриманих з використанням у якості праймерів 4-х послідовностей трита динуклеотидних мікросателітних локусів (АСС)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C; встановлено наявність комерційно-бажаних алелей за маркерами TG і CAPN1 530.

Розроблені останніми роками молекулярно-генетичні методи дають можливість оцінити рівень генетичного поліморфізму, аналізуючи безпосередньо геномні послідовності ДНК. Застосування в м'ясному скотарстві методів генетичного аналізу за ДНК-маркерами значно спрощує попередній відбір за певними характеристиками і надає можливість ефективно управляти процесом у сфері виробництва якісної продукції.

У країнах із розвинутим тваринництвом активно проводяться дослідження на різних породах великої рогатої худоби щодо виявлення генів, які беруть участь у формуванні якісних показників м'ясної продуктивності. Комерційні компанії вже пропонують тест-системи, які були розроблені на основі цих досліджень. Пройшли апробацію та рекомендовані Національним консорціумом з оцінки м'ясної худоби (NBCEC, USA) декілька комерційних тест-систем для визначення якісних показників туші за ДНК-маркерами. Результати цих аналізів є загальнодоступними на веб-сайті (http://www.nbcec.org).

Панелі маркерів комерційних тест-систем GeneSTAR®Tenderness та IGENITY® Profile для генетичного тестування ніжності м'яса представлені маркерами генів калпаїну, алельні варіанти якого безпосередньо впливають на поперечну пружність м'язового волокна [1, 5, 6]. Калпаїни є кальцій залежними протеїназами, що складаються із цілого ряду протеїназ µ-калпаїн (CAPN1), mкалпаїн (CAPN2) и калпастаїн (CAST). Калпаїн-системи вельми чутливі до коливань рівня іонів кальцію, температури, рН, які змінюються одразу після забою. Більшість дослідників вказують на кальпаїнові протеїнази, припускаючи, що ніжність - це насамперед результат калпаїн-опосередкованої деградації міофібріл та цитоскелету клітин.

Панель маркерів для генетичного тестування категорій якості м'яса GeneSTAR®Quality Grade складається з маркерів гену тиреоглобуліну, алельні варіанти якого пов'язані з різним ступенем накопичення внутришньом'язового жиру, що визначає мармуровість м'яса [2, 3, 4]. Тиреоглобулін (TG) - глікопротеїновий гормон, він синтезується у фолікулярних клітинах щитовидної залози та є попередником трийодтироніну (Т3) та тетрайодтироніну (Т4), які відіграють важливу роль у рості адипоцита, диференціації й гомеостазі жирових відкладень.

При аналізі популяцій на особливу увагу заслуговують методи, які дозволяють тестувати одночасно велику кількість поліморфних локусів, і, таким чином, давати комплексну характеристику геномів. Мікросателіти - короткі послідовності, які повторюються по всьму геному - підходящий інструмент для досліджень генетичної структури і генетичної спорідненості. Техніка ISSR-ПЛР дозволила значно збільшувати кількість високоваріабельних генетичних маркерів, які застосовуються для внутріпородного та міжпородного аналізів.

Метою дослідження є аналіз генетичної структури мікропопуляцій великої рогатої худоби м'ясного напрямку продуктивності шароле та герефорд за двома типами ДНК-маркерів для розроблення методології диференціації тварин за показниками якості м'ясної продукції.

Методика досліджень. Аналіз ДНК тварин було проведено на зразках крові від 65-ти тварин породи шароле та герефорд господарства ТОВ «Агро форт». ДНК виділяли сорбентним методом. Дослідження проводилися методом ПЛР-ПДРФ. Нами були підібрані оптимальні температурні та часові умови проведення ПЛР. Умови проведення полімеразної ланцюгової реакції: на 10 мкл ПЛР суміші було використано 4 мкл стерильної деіонізованої води, 2 мкл 5-ти кратного буфера (250 mM KCL, 50 mM Tric-HCL (pH 8,3), 7,5 mM MgCl2), 1 мкл суміші dNTP (по 2 mM кожного), суміш праймерів 0,8 мкл, Taq - полімераза 0,1 мкл, 2 мкл геномної ДНК.

Для ампліфікації гену тиреоглобуліна (ТG) були використані праймери: ТGf 5' - GGGGATGACTACGAGTATGACTG - 3', TGr 5'-GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGT - 3'. Довжина ампліфікованого фрагменту складає 548 п.н.

Для виявлення алельних варіантів С і Т гена ТG продукт ампліфікації обробляли рестриктазою PsuI.

Для ампліфікації гену калпаїн CAPN1 530 були використані праймери: CAPN1 530f 5'- TCTTCTCAGAGAAGAGCGCAG - 3', CAPN1 530r 5'- CTGCGCCATTACTATCGATC - 3'. Довжина ампліфікованого фрагменту складає 341 п.н. Для виявлення алельних варіантів A і G гена CAPN1530 продукт ампліфікації обробляли рестриктазою PsyI.

Дослідження генетичної структури ДНК за ISSR-маркерами проводили з використанням в якості праймерів фрагментів динуклеотидних і тринуклеотидних мікросателітних локусів, а саме: (АСС)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C.

Результати досліджень. Проведений аналіз поліморфізму фрагментів ДНК за ISSR-маркерами дозволив виявити особливості генетичної структури двох порід великої рогатої худоби шароле і герефорд. Сумарно було виявлено за чотирма маркерами 58 ампліконів, із них 35 фрагментів отримали з використанням тринуклеотидних мікросателітних повторів і 24 з використанням динуклеотидних повторів. В аналіз включали амплікони, які стабільно відтворювалися не менш ніж у трьох процедурах ампліфікації. Найбільша кількість ампліфікованих фрагментів була характерна для послідовності (АСС)6G - 21, для (GAG)6C та (AG)9C було виявлено по 14 фрагментів, а для (GA)9C - 10.

У генетичній структурі м'ясних порід великої рогатої худоби шароле та герефорд за ISSR-маркерами (АСС)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C мають місце 27 ідентичних за розміром фрагментів ампліфікації.

Для породи шароле за маркером (АСС)6G були виявлені індивідуальні фрагменти 1300 п.н., 1180 п.н., 850 п.н., 780 п.н., 650 п.н., 580 п.н., 540 п.н. і 420 п.н., що були відсутні у породи герефорд.

Для породи герефорд за маркером (GAG)6C виявилася характерною наявність ампліконів довжиною 1600 п.н., 1100 п.н., 900 п.н., 800 п.н., 650 п.н., 600 п.н.

При аналізі спектрів продуктів ампліфікації за маркером (AG)9C було виявлено характерні для породи шароле фрагменти довжиною 1050 п.н., 780 п.н., 720 п.н., 680 п.н., 620 п.н. За маркером (GA)9C спектри продуктів ампліфікації у обох порід виявилися подібними за винятком фрагменту розміром 250 п.н, що був характерним для породи шароле.

У цілому, найбільше число фрагментів спостерігалось у межах 1050-500 п.н. - 17 фрагментів, а найменше в діапазоні 1100-1750 п.н. - 9 фрагментів, до 500 п.н. було виявлено 15 фрагментів. Для маркеру (АСС)6G був характерний діапазон ампліфікованих фрагментів від 210 до 1750 п.н., для (AG)6C від 310 до 1600 п.н., (AG)9C - від 320 до 1700 п.н., а для (GA)9C від 250 до 1500 п.н. маркер ген м`ясний скотарство

У результаті порівняльного аналізу поліморфізму фрагментів ДНК у двох порід великої рогатої худоби при використанні чотирьох ISSR-ПЛР - маркерів встановлено, що спектри продуктів ампліфікації мають свої особливості, пов'язані з обраним праймером. Породи відрізнялися одна від одної кількістю і розміром ампліконів, а їх розмір варіював від 210 до 1750 п.н. Для визначення генотипів тварин ВРХ за локусами кількісних ознак (QTL), які пов'язані з генами м'ясної продуктивності, проведено аналіз поліморфізму генів тиреоглобуліну та калпаїну за маркерами TG і CAPN1 530, результати якого представлено в таблиці 1.

Дослідження тварин двох порід за геном тиреоглобуліну виявили відносно невисоку концентрацію частоти комерційно-бажаного алелю Т, який впливає на накопичення внутришньом'язового жиру і формування мармуровості м'яса. В породі шароле вона склала - 0,166, в породі герефорд - 0,113. Переважно дані популяції складаються з гомозиготних тварин генотипу СС, частка яких складає 69,7 % для породи шароле і 77,4 % для породи герефорд. Це може вказувати на те, що при формуванні стад використовували переважно бугаїв, які не є носіями бажаного алелю Т. У досліджених популяціях тварин великої рогатої худоби породи герефорд гомозиготних тварин ТТ за геном тиреоглобуліну не виявлено, а для породи шароле частота генотипу ТТ склала 0,030.

Таблиця 1. Розподіл алельних варіантів генів тиреоглобуліну та калпаїну у великої рогатої худоби порід шароле та герефорд господарства ТОВ„Агрофорт” (2011р.).

У дослідженій популяції великої рогатої худоби породи герефорд за геном тиреоглобуліну фактична гетерозиготність вища за очікувану, тобто існує статистично достовірний надлишок гетерозиготних тварин. Таким чином, бажаний для формування мармуровості м'яса алель Т присутній у генофонді стада у достатній концентрації, що можна використовувати при подальшому розведенні та відборі для формування стад тварин визначеного напрямку використання.

При аналізі результатів досліджень за геном калпаїну було також виявлено статистично достовірні відмінності між фактичною і очікуваною гетерозиготністю (табл.1). Фактична гетерозиготність в обох породах перевищувала очікувану. Загалом, концентрація бажаного алелю G - що має зв'язок з такою якісною характеристикою м'яса, як ніжність, спостерігалась на достатньо високому рівні в обох породах. Генетична ідентифікація гетерозиготних за геном калпаїн тварин з метою обмеженого їх використання у розведенні сприятиме формуванню гомогенних стад великої рогатої худоби за ознакою ніжності м'яса.

Генетична структура великої рогатої худоби породи шароле за міжмікросателітними послідовностями ДНК відрізняється від породи герефорд наявністю/відсутністю характерних ампліконів: за маркером (АСС)6G - 8 ампліконів, (GAG)6C - 6 ампліконів, (AG)9C - 5 ампліконів, (GA)9C - 1 амплікон.

За двома ДНК-маркерами TG і CAPN1 530, асоційованими з якісними показниками м'ясної продуктивності, генетична структура великої рогатої худоби породи шароле схожа з генетичною структурою породи герефорд, які розводяться в господарстві ТОВ „Агрофорт”. В проаналізованому поголів'ї концентрація комерційно-бажаних алелей за ДНК маркером TG, алель Т якого впливає на мармуровість м'яса, складає 16,6 % у шароле і 11,3 % у герефордів. За ДНК маркером CAPN1 530, алель G якого характеризує генетичну детермінацію ніжності м'яса, концентрація цього алелю складає 89,4 % у шароле і 83,9 % у герефордів.

Література

1. Association of polymorphisms in the calpain I, calpain II and growth hormone genes with tenderness in bovine M. longissimus dorsi / S. Costello, E. O'doherty, D.J. Troy [et al.] // Meat. Science. -- 2007. -- Vol. 75. -- P. 551--557.

2. Assessment of single nucleotide polymorphisms in genes residing on chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits in Bos indicus cattle / E. Casas, S.N. White, D.G. Riley [et al.] // J. Anim. Sci. -- 2005. -- Vol. 83. -- P. 13--19.

3. Barendse W.J. Assessing lipid metabolism. Int. Pat. Appl. WO99/23248. // World Interrnational Properti Organization. -- Geneva, 1999.

4. Barendse W.J. The TG5 thyroglobulin gene test for a marbling quantitative trait loci evaluated in feedlot cattle / W.J. Barendse, R. Bunch, M. Thomas [et al.] // Austr. J. Exp. Agricult. -- 2004. -- Vol. 44. -- P. 66.

5. Calcinns, C.R. Relationships among calcium dependant protease, cathepsing B and H, meat tenderness and the response of muscle to aging / C.R. Calcinns, S.C. Seiderman // J. Anim. Sci. -- 1988. -- Vol. 66. -- P.1186--1193.

6. Page B.T. Evaluation of single-nucleotide polymorphisms in CAPN1 for association with meat tenderness in cattle / B.T. Page, E. Cassas, M.P. Heaton [et al.] // J. Anim. Sci. -- 2002. -- Vol. 80. -- P. 3077--3085.

Размещено на Allbest.ru