Коагглютинирующий и Fab2-флуоресцирующий диагностикумы при лейкозе крупного рогатого скота

Известные иммунологические тесты (ИФА, РИД), основанные на выявлении антител к ВЛКРС, не дают абсолютно достоверных результатов. Часть инфицированных животных, вследствие низких титров антител к ВЛКРС, может остаться необнаруженной. Таким образом, нераспознанное инфицированное животное становится источником заражения (Кузнецова В.Н., Кузнецов Н.В., Симонян Г.А.,1997).

В свое время (Ferrer J.F.,1980) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота предлагался метод иммунофлуоресценции (МИФ). Этот метод, сочетающий высокую чувствительность люминесцентного анализа с высокой специфичностью серологического, находит все более широкое применение для идентификации патогенных микроорганизмов и их антигенов. Однако, в диагностике ВЛКРС-инфекции это направление не нашло практического применения ввиду того, что интерпретация получаемых при этом результатов нередко бывает затруднена, особенно при исследовании тканевых препаратов (мазки крови), т.к. флуоресцирующие антитела обладают способностью вызывать неспецифическое свечение гетерологичных структур. Это затрудняет идентификацию объекта исследования и соответственно снижает разрешающую способность МИФ.

Неоднократно предлагались различные методы подавления наведенного неспецифического свечения, среди которых наиболее эффективным является контрастирование препаратов альбумином, меченым родамином сульфохлоридом (Smith C.W., Marshall G.D., Eveland W.C.,1958; Носков Ф.С., 1969). Однако и этому приему присущи недостатки (Майборода Г.М., Камфорин Л.Е., Борщевский Ю.М., 1969; Медведьева Н.А., Камфорин Л.Е., Майборода Г.М.,1969).

Анализируя возможные причины возникновения наведенной неспецифической флуоресценции, было высказано предположение, что источником ее могут быть цитофильные свойства IgG, конъюгированного с флуорохромом. Как известно, эти свойства IgG определяются эффекторным центром цитотропизма, расположенной в аминоконцевой части Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина (Forsgum U., 1973).

ВЛКРС репродуцируется в лимфоцитах. А лимфоциты на своей поверхности имеют рецепторы к Fc- фрагменту антител. В цельной молекуле иммуноглобулинов, кроме Fab₂-фрагментов, присутствуют и Fc-фрагменты, являющиеся цитофильными для лимфоидных клеток. Значит, использование цельных молекул иммуноглобулинов приводит к неверной интерпретации результатов при использовании МИФ. Сведений об использовании флуоресцирующих Fab₂-фрагментов антител в диагностике лейкоза крупного рогатого скота в доступной нам литературе мы не обнаружили.

Другим способом повышения специфичности иммуноглобулиновых диагностикумов является использование клеток золотистого стафилококка, синтезирующих протеин А (Goding J.M., Marchalonis J.J., Atwell J.L.,1978), в реакции коагглютинации (РКОА). Данный протеин А обладает способностью вступать в соединение с иммуноглобулинами класса G человека, лабораторных и производственных продуцентов антител (кроликов, морских свинок, крыс, мышей, коз и крупного рогатого скота). При этом, белок А присоединяет молекулу IgG через Fc-фрагмент. Получаемый коагглютинирующий диагностикум способен специфически соединяться с антигенами, не только находящимися в растворе, но и фиксированными на клеточной поверхности. При этом Fab₂-фрагменты антител ориентированы наружу, это значительно повышает специфичность такого диагностикума и устраняет нежелательные связи с клетками. Такой диагностикум широко применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. Сведения о применении его в диагностике лейкоза крупного рогатого скота в доступной нам литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что данная тема является актуальной в плане создания и применения диагностических препаратов.

Связь работы с крупными научными программами, темами

- Применение флуоресцирующих Fab₂-фрагментов антител для индикации лимфоцитов периферической крови, инфицированных ВЛКРС.

Личный вклад соискателя. Данная диссертационная работа является законченным научно-исследовательским трудом по изучению возможности использования РКОА и флуоресцирующих Fab₂-фрагментов антител в иммунологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Исследования выполнены лично автором в соответствии с основными направлениями научных исследований Витебской ордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины.

Апробация результатов работы. Материалы исследований доложены: на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава, студентов, аспирантов и молодых преподавателей Витебской ордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины (Витебск, 1996-1998 г.г.); II международной научно-практической конференции «Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства» (Витебск, 1996); научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых преподавателей (Витебск, 1997); научно-практической конференции, посвященной 70-ти летию клинических кафедр ВГАВМ (Витебск, 1998); IV Республиканской научно конференции студентов и аспирантов РБ (НИРС-98, Гродно,1998); международной научно-практической конференции «Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве», посвященной 100-летию со дня рождения академиков Х.С.Горегляда и М.К.Юсковца (Минск, 1998); научно-практической конференции «Молодежь, наука, аграрное образование и производство» (Витебск 1999); III международной научно-практической конференции (Витебск, 1999); II международной научно-практической конференции «Исследования молодых ученых в решении проблем животноводства» (Витебск, 2002).

Опубликованность результатов исследований. По теме диссертации опубликовано одиннадцать научных работ, общим объемом 65 страниц (из них 45 страницы лично автором): 1- в журнале «Весцi Акадэмii аграрных навук РБ»; 2-в трудах академии; 6-в материалах международных конференций; 1- методические рекомендации, утвержденные отделом ветеринарии Витебского областного комитета по сельскому хозяйству и продовольствию и внедренные в производство; 1- методические указания, утвержденные Республиканской ветеринарной лабораторией.

Структура и объем работы. Работа изложена на стр. и состоит из следующих разделов: введения, общей характеристики работы и основной части: обзор литературы, собственные исследования, анализ и обсуждение результатов исследований, выводов и предложений производству, списка литературы, включающего 183 источника, в том числе 101 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.

Основная часть

Лейкоз крупного рогатого скота регистрируется во всех районах и областях и большинстве животноводческих хозяйств Республики Беларусь. Количество инфицированных животных с каждым годом уменьшается в связи с планомерно проводимыми ветеринарно-санитарными мероприятиями. Однако полностью ликвидировать это заболевание не удается в связи с несовершенством общепринятых тестов, либо с их дороговизной. Поэтому, мы считали необходимым проанализировать эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Беларусь, чтобы определить необходимость в более доступных методах диагностики ВЛКРС на ранних этапах инфицирования.

Результаты проведенных исследований показали, что лейкоз крупного рогатого скота имеет еще довольно широкое распространение на территории Республики Беларусь. Он регистрируется повсеместно, за исключением нескольких хозяйств Минской области. В государственном секторе процент инфицированности крупного рогатого скота по Республике Беларусь составляет 0,69%, в частном секторе -2,25%. В результате проведения ветеринарно-санитарных мероприятий процент инфицированности снизился в 2001 году по сравнению с 2000 годом на 0,1%, но для полной ликвидации инфекции необходимы методы диагностики, способные выявлять животных-вирусоносителей на ранней стадии инфицирования, с момента внедрения вируса в организм.

Для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота применяется реакция иммунодиффузии и иммуноферментный анализ, которые не способны выявлять животных-вирусоносителей на ранних стадиях инфицирования, т.е. до образования антител, что приводит к распространению болезни. Известная высокочувствительная полимеразно-цепная реакция в ближайшем будущем не доступна многим ветеринарным лабораториям из-за своей дороговизны, Поэтому общая концепция работы заключается в усовершенствовании методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, которые были бы дёшевы, доступны для производства в условиях республики и могли бы выявлять антигены ВЛКРС на ранней стадии инфицирования.

Для достижения поставленной цели в первой серии опытов было необходимо разработать и оценить, с точки зрения возможной оптимизации, основные этапы получения моноспецифических антител с применением общепринятых биохимических методов иммуносорбции и элюции белков. Мы изучили возможность получения моноспецифических антител к антигенам ВЛКРС, используя полимеризацию вирусных белков глутаровым альдегидом. Для оценки специфичности моноспецифических антител использовали известные иммунологические и иммунохимические методы. Нами была проведена значительная экспериментальная работа по поиску оптимальных условий для максимального выхода моноспецифических антител с высокой специфичностью.

Во второй серии опытов необходимо было получить иммунохимически чистый IgG к ВЛКРС из моноспецифических антител. С этой целю мы использовали свойство золотистого стафилококка шт. Cowan-1 связываться с Fc-фрагментами IgG. В результате проведенных экспериментов были определены оптимальные условия для получения максимального количества данного иммуноглобулина с высокой специфичностью. Для этого мы использовали известные биохимические и иммунологические методы.

В третьей серии опытов исследовали возможность приготовления и использования в диагностике лейкоза крупного рогатого скота коагглютинирующего диагностикума и флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG на основе полученного нами иммунохимически чистого IgG к ВЛКРС. Для этих целей мы использовали рекомендации НИИ им. Л.Пастера г.Санкт-Петербурга по приготовлению коаагглютинируюшего диагностикума и метод расщепления IgG, рекомендованный R.R. Porter (1959). Метку Fab₂-фрагментов IgG флуоресцеинизотиоцианатом проводили по методике, предложенной П.С.Барбаном (1973).

О специфичности предлагаемых методов судили по сопоставлению с реакцией иммунодиффузии в начале опыта и по прошествии 21 дня с момента выявления антител в РИД у животных-вирусоносителей.

Расчет экономической эффективности применения РКОА и флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG проводили согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной Начальником Главного управления ветеринарии с Государственной ветинстанцией МСХ и Продовольствия РБ 10 мая 2000 года.

Полученный цифровой материал подвергли статистической обработке по Стъюденту-Фишеру при помощи компьютерной программы «Stadia».

Данные по усовершенствованию диагностики лейкоза крупного рогатого скота вошли в «Методические рекомендации по иммунологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденные Начальником управления ветеринарии комитета по сельскому хозяйству и продовольствию Витебского облисполкома (Витебск, 1998 г.) и «Методические рекомендации по получению и применению коагглютинирующего и Fab2-флуоресцирующего диагностикумов для индикации антигенов в лимфоцитах периферической крови», утвержденные Республиканской ветеринарной лабораторией (Минск, 2002 г.).

Результаты экспериментальных исследований

Распространение лейкоза крупного рогатого скота в Республике Беларусь. К 1991 году инфекция ВЛКРС была зарегистрирована в 97,8% хозяйств с интенсивностью инфицированности коров вирусом лейкоза в колхозах и совхозах - 19,6%, госплемзаводах 29,5%, госплемпредприятиях - 7,7%, молодняка крупного рогатого скота старше 6-ти месячного возраста - 7,8%, животных частного сектора - 9,7% (Русинович А.А., Король Н.М., Савицкий Н.В., 1998).

. Лейкоз крупного рогатого скота распространен во всех областях Республики Беларусь, наибольшее инфицирование скота ВЛКРС наблюдается в Брестской и Гомельской областях, меньше - в Минской и Витебской областях.

В результате проводимых ветеринарно-санитарных мероприятий количество инфицированных животных сократилось в Республике Беларусь к 2001 году до 0,1% при исследовании коров серонегативной группы и составило 2913 животных.

В государственном секторе процент инфицированности крупного рогатого скота по Республике Беларусь составляет 0,69%, в частном секторе -2,25%, что в 3,3 раза выше, чем в государственном.

Получение коагглютинирующего диагностикума и использование его в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Получение моноспецифических антител. Для получения моноспецифических антител нами разработана и предложена методика на основе полимеризованного антигена с помощью глутарового альдегида.

В результате проведенных исследований был выбран оптимальный вариант получения моноспецифических антител. Вначале готовили иммуносорбент. Для этого 100мг вирусного антигена и 400мг БСА растворяли в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера с pH-5,0. Проверяли pH и, при необходимости, доводили pH до 5,0 с помощью 1N HСl. К этому раствору добавляли 2 мл 2,5% -ного водного раствора глутарового альдегида. Глутаровый альдегид добавляли по каплям при осторожном перемешивании раствора белка. Смесь оставляли при комнатной температуре на ночь. За это время происходит гелеобразование. Образовавшийся гель тщательно промывали забуференным фосфатным буфером, а затем элюирующим раствором для удаления нековалентно связанных белков, тщательно гомогенизировали, пропуская с помощью шприца через иглу, и суспендировали в фосфатном буфере с pH-7,4. Центрифугировали, надосадочную жидкость сливали, повторно гомогенизировали и суспендировали в 0,2 M HCl-глициновом буфере с pH-2,8. Перемешивали 15 минут при комнатной температуре и центрифугировали. Гранулы геля нейтрализовали 1 M K₂ HPO₄. Промывали дистиллированной водой и переносили гель в раствор 0,1 М лизина, инкубировали ночь при температуре 4С. После этого промывали фосфатным буфером и в нем оставляли, добавив 0,01% азида натрия. При этом полученный иммуносорбент можно хранить при 4С продолжительное время.

Выделение антител проводили следующим образом. Полученный иммуносорбент центрифугировали и сливали надосадочную жидкость, добавляли 20 мл гипериммунной сыворотки из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» производства Курской биофабрики и перемешивали 1 час при комнатной температуре. Затем центрифугировали и сливали надосадочную жидкость. Иммуносорбент промывали холодным ЗФР путем центрифугирования до тех пор, пока ОП₂₈₀ не становилось меньше 0,05. Затем проводили элюцию 50 мл 0,2 М HСl-глицинового буфера pH- 2,8. Элюцию повторяли этим же буфером с pH-2,2. Элюанты объединяли и нейтрализовали 1 М раствором K₂HPO₄. Затем проводили диализ против ЗФР на холоду. Полученные моноспецифические антитела консервировали азидом натрия и проверяли в РИД c антигеном из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота», серия 47, контроль 47, изготовленный 16.03.98 г. производства Курской биофабрики), которую ставили согласно «Методических указаний по диагностике лейкоза крупного рогатого скота в Республике Беларусь» (1993).

При выделение антител к ВЛКРС было установлено, что полученные моноспецифические антитела с помощью полимиризованного вирусного белка обладают специфичностью к антигену ВЛКРС. Между антигеном из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» производства Курской биофабрики и моноспецифическими антителами, полученными с помощью полимеризованных антигенов, отмечалось наличие одной полосы преципитации серо-белого цвета. В то время как между антигеном из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» производства Курской биофабрики и гипериммунной сывороткой из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» производства Курской биофабрики имело место несколько полос преципитации серо-белого цвета. При этом иммуносорбент можно использовать многократно.

Выделение IgG к ВЛКРС. Для создания высококачественного коагглютинирующего диагностикума необходимы иммуноглобулины класса G.

В результате проведенных экспериментов нами была разработана методика получения IgG к ВЛКРС с помощью стафилококкового реагента производства НИИ им. Л.Пастера (г.Санкт-Петербург).

Таким образом, оптимальным оказался следующий вариант. Моноспецифические антитела разводят пополам 0,2 М фосфатным буфером pH 8,0, смешивают с реагентом в соотношении 1:8, инкубируют 30 мин, центрифугируют, надосадок сливают, осадок трижды промывают 0,1 М фосфатным буфером pH 8,0. К осадку стафилококкового реагента приливают 0,1 М фосфатно-цитратный буфер pH 3,0 с 80 mM MgCl₂ в объеме, в 2 раза большем взятой сыворотки на 15 мин, перемешивают и центрифугируют. Отбирают надосадочную жидкость (IgG). Ее нейтрализуют 1 М K₂HPO₄, диализуют против физраствора, консервируют азидом натрия и хранят при t+4⁰С.

Приготовление коагглютинирующего диагностикума и использование его для индикации лимфоцитов, инфицированных ВЛКРС.

Для приготовления коагглютинирующего диагностикума использовали очищенный IgG к ВЛКРС и стафилококковый реагент производства НИИ им. Пастера (г. Санкт-Петербург) Осадок стафилококкового реагента разводили физраствором до 10 мл и добавляли 0,2 мл полученного IgG (концентрация по белку 2 мг/мл). Смесь оставляли при комнатной температуре на 1 час при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем центрифугировали, осадок трижды промывали физраствором и взвешивали его в 10 мл физраствора с содержанием 0,3 % фенола. Хранили полученный диагностикум при +4С в течение 4 месяцев. За период хранения потери активности не наблюдалось.

Для определения инфицированности лимфоцитов ВЛКРС использовали кровь, стабилизированную трилоном-Б, от коров РИД-отрицательных (200 проб), РИД-полжительных (310 проб) и гематологически положительных (113 проб). Из крови готовили мазки общепринятым методом, фиксировали охлажденным ацетоном в течение 10 минут. На мазки наносили несколько капель коагглютинирующего диагностикума, накрывали покровным стеклом, помещали в условия влажной камеры (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) и инкубировали в термостате при 37С в течение 30 минут. Мазки тщательно промывали физиологическим раствором, высушивали и окрашивали по Романовскому-Гимзе в течение 1 часа. Снова промывали, высушивали и просматривали под обычным световым микроскопом (X900).

Специфичность данной реакции контролировали путем постановки ее в следующих системах: а) стафилококковый диагностикум+вирусный антиген из “Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота” производства Курской биофабрики, б) стафилококковый диагностикум+ физиологический раствор. Наличие агглютинации в первом и отсутствие во втором случаях свидетельствует о ее специфичности.

В результате проведенных исследований установили, что лимфоциты, инфицированные ВЛКРС, адсорбируют на своей поверхности клетки золотистого стафилококка коагглютинирующего диагностикума. При этом клетки стафилококка располагались на поверхности лимфоцитов в виде “шариков“, покрывающих ту или иную площадь поверхности лимфоцита

При этом лимфоциты от РИД-положительных и гематологически положительных животных показывают 100%-ную совпадаемость результатов с РИД. В мазках крови от РИД-отрицательных животных дополнительно выявляется до 6,5 % коров, инфицированных ВЛКРС.

Подтверждение высокой чувствительности РКОА получили при повторном исследовании мазков периферической крови в РИД через 21 день после первого исследования. Положительно прореагировавшие животные в реакции коагглютинации в первый раз, орицательно - в РИД, при повторном исследовании прореагировали положительно как в РКОА, так и в РИД.

Получение флуоресцирующих Fab₂-фрагментов антител против ВЛКРС и использование их в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Получение Fab₂ -фрагментов антител. С этой целью очищенный препарат IgG диализовали против 0,1М ацетатного буфера с рН 4,3. Затем к нему добавляли кристаллический пепсин в соотношении глобулин-пепсин 50:1 и доводили рН до 4,3 1М раствором уксусной кислоты.

Смесь оставляли на водяной бане при 37⁰С на 14 часов, затем охлаждали во льду. Осадок, который может образоваться во время реакции, удаляли центрифугированием и доводили рН до 8,0 с помощью 1М раствора NaOH (при этом значении рН пепсин инактивируется). После такой обработки молекула IgG расщепляется на Fab₂-фрагмент и Fc-фрагмент в области шарнирного участка.

Fc-фрагмент (цитофильный) удаляли из раствора с помощью стафилококкового реагента производства НИИ им. Л.Пастера (г. Санкт-Петербург), который обладает способностью связывать Fc-фрагмент с помощью протеина А. Стафилококковый реагент готовили, придерживаясь рекомендаций изготовителя, т.е. флакон, содержащий стафилококковый реагент, растворяли в 2 мл дистиллированной воды и оставляли на 2 часа до полной регидратации. После этого проводили трехкратное отмывание золотистого стафилококка 0,1 М фосфатным буфером pH 8,0 на центрифуге. После последнего центрифугирования к осадку стафилококка добавляли фрагментированный IgG в различных соотношениях. При этом был найден оптимальный вариант. Им оказалось соотношение реагент: фрагментированный IgG = 8:1.

После этого взвесь тщательно встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 2-3 часа. За это время происходило связывание Fc-фрагментов IgG со стафилококковым реагентом. Если даже ферментолиз происходил не полностью и оставались целые молекулы IgG, то они все равно связывались со стафилококком и удалялись из раствора.

В дальнейшем смесь центрифугировали, осадок оставляли, а надосадочная жидкость - это и есть Fab₂-фрагменты антител. Специфичность Fab₂-фрагментов проверяли в РИД с антигеном из «Набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота» производства Курской биофабрики. Их консервировали азидом натрия и хранили при t 4⁰С в течение четырех месяцев.

Метка Fab₂-фрагментов ФИТЦ. Метку Fab₂-фрагментов проводили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Для этого в растворе белка определяли его концентрацию и охлаждали во льду, доводили рН до 9,0 с помощью 0,1М Na₂CO₃. Необходимую навеску ФИТЦ (10 мкг на 1 мг белка) готовили непосредственно перед опытом, растворяли ее в минимальном количестве 0,1М раствора Na₂CO₃ и добавляли к раствору белка, осторожно перемешивая. Все это ставили на ледяную баню. В реакционной смеси поддерживали рН ближе к 9,0, при необходимости добавляя 0,05 М раствор карбоната натрия. Если рН смеси не изменялось в течение 15 мин, сосуд закрывали пробкой и оставляли во льду при легком помешивании на 18 часов в защищенном от света месте. После окончания реакции смесь центрифугировали, чтобы удалить образующийся иногда осадок. Затем проводили диализ против физраствора для удаления несвязавшегося красителя, определяли рабочий титр флуоресцирующей сыворотки и использовали для обнаружения антигенов ВЛКРС на лимфоцитах периферической крови.

Использование флуоресцирующих Fab₂-фрагментов в определении антигенов ВЛКРС.

С этой целью использовали 623 пробы крови от РИД-позитивных, РИД-негативных и гематологически больных животных. Кровь получали с использованием трилона-Б, готовили мазки, фиксировали охлажденным ацетоном в течение 10 минут. Затем на мазки наносили по 2-3 капли флуоресцирующих Fab₂-фрагментов, покрывали покровным стеклом и помещали в условия влажной камеры (чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) при t-37⁰C на 30 минут. Мазки тщательно промывали физиологическим раствором, высушивали на воздухе и просматривали под люминесцентным микроскопом.

В результате проведенных исследований установлено, что в мазках крови от гематологически больных и РИД-позитивных животных на лимфоцитах отчетливо определяются гранулы вирусного антигена. При этом их расположение на поверхности лимфоцитов самое разное. В одних случаях они определяются на всей поверхности лимфоцита, в других - в одном каком-то месте. Интенсивность флуоресценции в положительных препаратах довольно высокая (+++ или ++++). Лимфоциты, не содержащие антигены ВЛКРС, практически не светились, т.е. отсутствовала наведенная неспецифическая иммунофлуоресценция.

В препаратах крови от гематологически положительных животных (113 проб) была отмечена 100% совпадаемость результатов. При этом процент инфицированности лимфоцитов колебался в широких пределах (50-80%). В мазках крови от РИД-позитивных (310 проб) животных был получен аналогичный результат совпадаемости (100%), но процент инфицированности лимфоцитов ниже (30-50%). В группе РИД-негативных животных (200 проб) определили 16 положительных проб. Однако процент инфицированности лимфоцитов был еще ниже (4-10%).

Подтверждение высокой чувствительности флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG получено при повторном исследовании мазков периферической крови в РИД через 21 день после первого исследования. Положительно прореагировавшие животные с помощью МИФ на основе флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG в первый раз, орицательно - в РИД, при повторном исследовании прореагировали положительно как в МИФ, так и в РИД.

Экономическая эффективность применения РКОА и МИФ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Проводимые расчеты показали, что экономический эффект при применении РКОА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составляет 787 370 руб на 100 голов (463$ США), экономическая эффективность составляет 4,3 рубля на один рубль затрат или. А экономический эффект при применении МИФ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составляет 465 560 руб на 100 голов (274$ США), экономическая эффективность составляет 2,5 рубля на один рубль затрат или.

Заключение

вирус лейкоз антитело скот

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что лейкоз крупного рогатого скота распространен во всех областях Республики Беларусь. В промышленном скотоводстве процент инфицированности крупного рогатого скота по Республике Беларусь составляет 0,69%, в частном секторе -2,25%, что в 3,3 раза выше чем в государственном.

Ранняя диагностика остается актуальной в настоящее время. Существующие методы диагностики ВЛКРС не позволяют выявить вирус в начальный период инфицирования из-за низкого титра антител или их отсутствия, поэтому разработка методов иммунологической диагностики, позволяющих выявить возбудителя с момента инфицирования, позволит оздоравливать стада животных, особенно на последнем этапе оздоровления, предотвращать закупку инфицированных животных.

В связи с этим нами проведены исследования, в результате которых были разработаны диагностикумы для идентификации ВЛКРС на раннем этапе инфицирования, еще до появления антител. Основной целью этих исследований было определение возможности использования реакции коагглютинации и применение флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG к ВЛКРС для индикации антигена в лимфоцитах периферической крови животных, зараженных ВЛКРС. Основными задачами исследования было: во-первых, получить моноспецифические антитела; во-вторых, изготовить коагглютинирующий диагностикум и использовать его в диагностике лейкоза крупного рогатого скота; в-третьих, изготовить флуоресцирующие Fab₂-фрагменты IgG к ВЛКРС и использовать их в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

В ходе эксперимента все задачи были выполнены и получен положительный результат.

Реакция коагглютинации эффективнее применяемой в ветеринарных лабораториях Республики Беларусь для диагностики лейкоза крупного рогатого скота РИД на 6,5%. Экономическая эффективность использования РКОА для диагностики ВЛКРС у крупного рогатого скота составляет 4,3 рубля на один рубль затрат.

Метод иммунофлуоресценции с использованием флуоресцирующих Fab₂-фрагментов IgG эффективнее применяемой в ветеринарных лабораториях Республики Беларусь для диагностики лейкоза крупного рогатого скота РИД на 8%. Экономическая эффективность использования МИФ для диагностики ВЛКРС у крупного рогатого скота составляет 2,5 рубля на один рубль затрат.

Выводы

1. В условиях промышленного скотоводства Республики Беларусь процент инфицированности крупного рогатого скота лейкозом составляет 0,69%, в частном секторе -2,25%. В результате проведения ветеринарно-санитарных мероприятий процент инфицированности снизился в 2001 году по сравнению с 2000 годом на 0,1%, но для полной ликвидации инфекции необходимы методы диагностики, способные выявлять животных-вирусоносителей на ранней стадии инфицирования, с момента внедрения вируса в организм.

2. Полученный нами на основе антигена ВЛКРС иммуносорбент, позволяет из полевых положительных сывороток к вирусу лейкоза крупного рогатого скота выделять моноспецифические антитела.

3. Разработанный нами метод получения IgG из моноспецифической сыворотки с помощью стафилококкового реагента позволил в дальнейшем получить иммуноглобулиновые препараты для специфической диагностики ВЛКРС.

4. Приготовленный на основе стафилококкового реагента и выделенных IgG против ВЛКРС коагглютинируюший диагностикум позволяет выявлять антигены ВЛКРС на инфицированных лимфоцитах периферической крови.

5. Сконструированный нами Fab₂- флуоресцирующий диагностикум для индикации антигенов ВЛКРС на лимфоцитах периферической крови инфицированного крупного рогатого скота позволяет существенно увеличить разрешающую способность иммунофлуоресцентного анализа, так как не вызывает неспецифическую флуоресценцию и не требует контрастирования препаратов.

6. Коагглютинирующий диагностикум позволяет дополнительно выявлять 6 % животных инфицированных ВЛКРС, по сравнению с РИД. Экономический эффект при применении метода коагглютинации в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составил 787 370 руб. на 100 голов (463$ США), экономическая эффективность составила 4,3 рубля на один рубль затрат. Fab₂- флуоресцирующий диагностикум позволяет дополнительно выявлять 8 %, по сравнению с РИД. Экономический эффект при применении МИФ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота составил 465 560 руб. на 100 голов (274$ США), экономическая эффективность составила 2,5 рубля на один рубль затрат.

Практические предложения

1. «Методические рекомендации по иммунологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденные Начальником управления ветеринарии комитета по сельскому хозяйству и продовольствию Витебского облисполкома (Витебск, 1998 г.).

2. «Методические рекомендации по получению и применению коагглютинирующего и Fab2-флуоресцирующего диагностикумов для индикации антигенов в лимфоцитах периферической крови», утвержденные Республиканской ветеринарной лабораторией (Минск, 2002 г.).

Список используемой литературы