Диагностика хламидиозов животных

23

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

«Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»

Курсовая работа на тему:

ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ

Витебск 2011

Содержание

Введение

Определение болезни

Этиология

Эпизоотологические данные

Клинические признаки

Патологоанатомические изменения

Лабораторная диагностика

Дифференциальная диагностика

Приложения

Список использованных источников

Введение

Хламидиоз животных регистрируют во многих странах мира. Болезнь наносит ощутимый экономический ущерб животноводству, который складывается из недополучения прироста живой массы, приплода, падежа и вынужденного убоя животных, а также затрат на проводимые мероприятия по профилактике и ликвидации болезни. К тому же возбудитель хламидиоза представляет большую опасность для здоровья человека.

Своевременная и достоверная диагностика - необходимое условие для успешной борьбы с любой инфекционной болезнью, в том числе и с хламидиозом животных.

В настоящих методических указаниях представлены наиболее современные и практически приемлемые методы диагностики хламидиоза животных. Нами дана характеристика хламидий, приведены эпизоотологические данные, клинические признаки болезни, патологоанатомические изменения, указаны правила отбора, упаковки, оформления и пересылки патматериала, подготовки его к исследованию, определены критерии, на основании которых диагноз считают установленным.

Определение болезни

Хламидиоз животных - контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся ринитом, бронхопневмонией, гастроэнтеритом, полиартритом, кератоконьюнктивитом, энцефаломиелитом, эндометритом, задержанием последа, маститом, абортами и рождением нежизнеспособного молодняка. У мужских особей наблюдаются орхиты, баланопоститы и эпидидимиты. Хламидиозом болеет и человек.

Этиология

Уникальность хламидиозной патологии состоит в том, что хламидии вызывают различные по патогенезу и клиническому проявлению болезни, но принадлежат они к одному роду - Chlamydia.

В соответствии с руководством Д. Берджи, 9-е изд., (1993) возбудитель хламидиоза отнесён к царству Procariotae, отделу Gracilicutes, группе 9 “Риккетсии и хламидии”, порядку Chlamydiales, семейству Chlamydiaceae, роду Chlamydophilia, в который входят следующие виды: Chl. psittaci, Chl. pneumoniae, Chl. pecorum, Chl. caviae, Chl. abortus, Chl. felis. Chl. psittaci (болеют люди и птицы, у животных наблюдаются аборты и другая патология); Chl. pecorum (вызывает у животных аборты, полиартриты, энцефаломиелиты, кератоконъюнктивиты, пневмонии, энтериты и маститы); Сhl. caviae (заболевание у животных); Сhl. felis (конъюнктивиты у кошек, в ряде случаев конъюнктивиты у человека); Сhl. abortus (вызывает спорадические аборты у женщин); Chl. pneumoniae (пневмонию и конъюнктивит человека).

В соответствии с классификацией Эйдельштейна И.А. (1999) в порядок Chlamydiales входит род Chlamydia, который включает виды: Chl. trachomatis, Chl. suis, Chl. muridarum. Chl. trachomatis - патогенны для человека, вызывают трахому, лимфогранулёму, цервицит, конъюнктивит; Chl. suis вызывает у животных конъюнктивит, энтерит, пневмонию; Chl. muridarum вызывает заболевание у грызунов.

Возбудитель неподвижен, спор и капсул не образует, грамотрицателен. В настоящее время разработано и предложено ряд методов окраски хламидий. Наиболее практически приемлемыми и употребляемыми являются методы окраски по Стампу, Маккиавелло, Романовкому-Гимзе.

Хламидии имеют уникальный цикл развития. Они могут существовать в виде ретикулярных телец, которые не превышают в диаметре 1,2 мкм, а средний диаметр наиболее многочисленных и опасных в плане заражения промежуточных телец хламидий составляют 0,3 - 0,4 мкм, то есть размеры их соизмеримы с крупными вирусами. Самые высоко инфекционные формы хламидий (элементарные тельца) - это мелкие сферические клетки диаметром 0,25 - 0,3 мкм. Элементарные тельца являются внеклеточной формой существования, а ретикулярные (инициальные) тельца - внутриклеточной формой имеющие структуру типичных грамотрицательных бактерий.

Несмотря на то, что хламидии отнесены к царству Procariotae, особенности биологических свойств (культивирование на 6-7 дневных куриных эмбрионах, культуре клеток) сближают их к вирусами. В своем составе они содержат, ДНК и РНК (чем существенно отличаются от вирусов), около 40% липидов, 35% белка, соляную и фолиевую кислоты, имеют несколько автономных ферментных систем. Размножаясь в цитоплазме живых клеток они образуют мембранно-ограниченные цитоплазматические включения, состоящие из микроколоний (1-12 мкм в диаметре), которые, распадаясь высвобождают сотни элементарных телец. Морфология хламидий зависит от цикла их развития, который слагается из следующих этапов:

1) адсорбция элементарных телец на оболочке клетки и их фагоцитоз;

2) трансформация элементарных телец в инициальные тельца;

3) деление ретикулярных телец с образованием промежуточных форм хламидий;

4) созревание промежуточных форм до элементарных телец.

Патогенные виды хламидий весьма аналогичны по морфологии, химической структуре, циклу развития, метаболизму и чувствительности к антибиотикам.

Из лабораторных животных к хламидиям чувствительны морские свинки, кролики, белые мыши. Хорошей биологической моделью являются обезьяны.

Хламидии сравнительно устойчивы во внешней среде, хорошо сохраняются при низких температурах. В воде не теряют жизнеспособности до 17 дней, в лиофилизированном состоянии - до 3 лет, в не пастеризованном молоке - 23 дня. Возбудитель инактивируется дезсредствами в обычных концентрациях (2-3% раствор натрия гидроокиси, 3% раствор фенола, 2-3% раствор формальдегида и др.). Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда (геомицин ретард, террамицин, хлортетрациклин, окситетрациклин и другие). Трудности лечения больных связаны с тем, что возбудитель является внутриклеточным облигатным паразитом и на определенных этапах инфекционного процесса становится недоступным для антибиотиков и других применяемых средств, поэтому курс лечения длительный и зачастую оказывается малоэффективным. Встречаются лекарственно-устойчивые L-формы возбудителя.

Эпизоотологические данные

Хламидиозом болеют животные всех возрастов независимо от породы и пола. Источником возбудителя болезни являются больные и переболевшие животные, которые в течение 7-12 месяцев являются хламидионосителями и выделяют возбудитель с истечением из глаз, носа, с фекалиями, со спермой (производители), с мочой, молоком, с абортированном плодом, с околоплодными водами и оболочками, обсеменяя при этом окружающую среду. Заражение животных происходит алиментарным, аэрогенным и половым путями. Хламидии легко преодолевают плацентарный барьер у беременных животных и инфицируют плоды (до 30%), в таком случае рождаются больные животные (чаще с поражением желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы и суставов).

Для хламидиоза характерна стационарность, которая объясняется длительным хламидионосительством, наличием резервуара возбудителя (мышевидные грызуны и многие дикие животные). Природная очаговость обусловлена тем, что хламидии циркулируют у рыб, растений, моллюсков вызывая различные патологические состояния.

Для хламидиоза характерна также сезонность. Наибольшее количество абортов приходится на зимне-весенний период. В летнее время количество заболевших животных резко снижается и заболевание переходит в латентную форму. Зимой и весной с наступлением холодов, особенно на фоне нарушений условий содержания животных, инфекция активизируется, болезнь проявляется клиническими признаками у различных возрастных групп животных, увеличивается количество абортов и мертворождений.

Заболеваемость и летальность среди поголовья животных зависит от формы проявления болезни. При респираторной форме болезни, заболеваемость составляет до 60%, летальность до 30%, при кишечной соответственно 25 - 50% и 20 - 30%. При энцефалитной форме летальность составляет 100%. Заболеваемость и летальность может увеличиваться, если хламидиоз осложняется бактериальными и вирусными инфекциями.

Несмотря на высокую инфекционность хламидий, болезнь у животных не всегда клинически проявляется. В большинстве случаев заражение приводит к инаппарантной, хронической инфекции и к длительному хламидионосительству. Выяснено, что хламидии, поражающие животных обладают тканевым тропизмом, но не обладают хозяиноспецифичностью.

Клинические признаки

хламидиоз животное инфекционный болезнь

Инкубационный период - от нескольких часов до 3 - 4 месяцев.

Различают: респираторную, артритную, кишечную, генитальную, энцефаломиелитную и кератоконъюнктивальную формы хламидиоза.

Хламидиоз может протекать: остро, подостро и хронически.

У производителей хламидиоз протекает хронически. При этом наблюдают полиартриты, хромоту, чаще на одну из тазовых конечностей, увеличение семенников (орхит), надсеменниковых лимфоузлов, уретриты, искривление шеи за счет пареза отдельных групп мышц, поражение желудочно-кишечного и респираторного трактов.

Основным клиническим признаком у маток являются аборты и мертворождения. Обычно аборты регистрируются у 30 - 50% первотелок и разовых свинок. Введение в хозяйство здоровых ранее не болевших животных и покрытие их больными производителями заканчивается абортами у большинства или у всех животных. У маток наблюдается мертворождение, а у других животных рождается нежизнеспособный молодняк. Они погибают в течение 1 - 2 недели.

Животные, выжившие до месяца, растут и развиваются нормально. Однако после отъема, как правило, наблюдаются рецидивы заболевания. У них развивается бронхопневмония, поражается желудочно-кишечный тракт. Плохой аппетит, депрессия, сонливость, повышение температуры тела до 41 - 41,5С, поносы, сухой кашель, отставание в росте - таковы основные клинические признаки болезни. У некоторых животных развиваются артриты. Поражаются скакательные, карпальные, пальцевые суставы - они увеличены, болезненны. Многие животные страдают коньюнктивитом, нередко у них наблюдают поражение нижней части ушной раковины, развитие очаговых дерматитов, кольцевую гангрену хвоста и его отторжение. Зачастую на первое место выступают признаки поражения центральной нервной системы: дрожание кожи, волнообразное сокращение поверхностных мышц, парезы тазовых, реже грудных конечностей. Животные могут внезапно падать, визжать, совершать плавательные движения, но также, неожиданно поднимаются и кажутся здоровыми.

При респираторной форме наблюдается подъем температуры тела до 40 - 40,5С, серозное или серозно-слизистое истечение из носовой полости, слезотечение, кашель, учащение дыхания. На 3-5-й день болезни появляется редкий сухой кашель и в легких прослушиваются хрипы. В крови отмечается лейкопения с нейтропенией. Симптомы респираторного заболевания у животных вызванные хламидиями непостояны. Клиническое проявление болезни варьирует от латентного до тяжелой пневмонии с острым, подострым и хроническим течением. Как осложнение может быть выражен гепатит, нефрит, миокардит.

Наряду с поражением органов дыхания у некоторых животных может развиться артритная форма. При этом преимущественно поражаются скакательные суставы, реже воспалительный процесс распространяется на карпальные и пальцевые. Суставы увеличены, болезненны. При затянувшемся хроническом процессе возможно образование свищей из суставной капсулы.

Кишечная форма заболевания характеризуется повышением температуры тела до 41С, отсутствием аппетита, угнетением, учащением пульса и дыхания. Наиболее характерным признаком данной формы является расстройство деятельности желудочно-кишечного тракта. Затяжные поносы сопровождаются тенезмами, в жидких каловых массах много слизи с примесью крови. Больные животные заметно худеют, у них западают глаза, а у некоторых отмечается серозно-слизистые истечения из носа и кашель. Временами этот симптомокомплекс несколько смягчается, а затем снова усиливается.

Генитальная форма характеризуется абортами, преждевременным родами, рождением мертвых и больных животных. Аборты могут происходить на втором месяце беременности. Такие случаи проходят незамеченными и животные остаются яловыми. Аборты чаще наблюдают в последние недели беременности. Несмотря на своевременные роды, многие животные рождаются мертвыми. Потери молодняка могут достигать 70% от числа родившихся. У абортировавших животных наблюдаются маститы, эндометриты, задержание последа.

При энцефаломиелитной форме первый признак болезни - внезапное повышение температуры тела до 40,5 - 42С, постепенно исчезает аппетит, наступает истощение и физическая слабость, наблюдается слезотечение и кашель, затем может наступить выздоровление животных. Но в большинстве случаев развивается симптомы нервного заболевания. Движения животных становятся не координированными. Конечности в путовых суставах непроизвольно сгибаются, суставы иногда бывают отечны, мягки и болезненны. У некоторых животных отчетливо проявляется хромота, наблюдается истечения из носа, у других - диарея. Больные животные обладают повышенной чувствительностью и иногда упираются головой в твердые предметы. Физическая слабость сопровождается прострацией и глубоким угнетением. В некоторых случаях незадолго до смерти отмечаются судорожные сокращения шейных и затылочных мышц. Кроме того, отмечается статическая и динамическая атаксия, дрожание головы, судороги верхних век, глаз ушей и губ.

Кератоконъюнктивальная форма характеризуется односторонним конъюнктивитом и кератитом. При этом из пораженного глаза появляются истечения, веки опухают, возникает сильная светобоязнь. На поверхности отечной слизистой оболочки видна мелкая зернистость. Воспалительный процесс может распространяться и на роговицу, вызывая кератит, а иногда и изъязвления ее. Через 8-10 дней животные выздоравливают.

Многообразие клинического проявления хламидиоза свидетельствует о том, что возбудитель поражает весь организм. Интенсивность и сочетаемость клинических признаков болезни зависит от возраста животного, иммунобиологического состояния организма, влияния факторов внешней среды.

Патологоанатомические изменения

Макро- и микроскопические изменения в органах и тканях при хламидиозе у различных возрастных групп имеют свои особенности. Возбудитель заболевания, проявляя тропизм к репродуктивной системе, у беременных преодолевает плацентарный барьер, вызывает заболевание плодов, вследствие часть их погибает в утробе матери или же рождаются живыми, но уже зараженными и больными.

У абортированных плодов и молодняка, погибшего в первые дни жизни, наблюдается цианоз кожи в области носа, подгрудка, лобных костей, копытец и слизистой оболочки преддверия ротовой полости и конъюнктивы. При вскрытии у них обнаруживается серозный отек кожи и подкожной клетчатки в области затылка, подчелюстного пространства, промежности, грудных и тазовых конечностей. В подкожной клетчатке в области лобной и затылочной костей, кроме отека, обнаруживают кровоизлияния. В грудной и брюшной полостях, перикардиальной сумке в большинстве случаев отмечается скопление транссудата соломенно-желтого цвета, иногда с красноватым оттенком, в легких, как у абортированных плодов, так и у павшего молодняка - венозное полнокровие, часто сочетающееся с отеком. Могут наблюдаться признаки интерстициальной (катаральной или катарально-гнойной бронхопневмонии) пневмонии. У абортированных плодов лёгкие находятся в состоянии фетально-тотального ателектаза.

В желудке и тонком отделе кишечника обнаруживается серозно-слизистый катар. Слизистая толстого отдела кишечника, в особенности ободочной кишки, чаще у плодов, в состоянии водянисто-студневидного отека. У отдельных плодов просвет толстых кишок заполнен красно-бурой массой студневидной консистенции. Печень в состоянии венозной гиперемии, под капсулой обнаруживаются белесовато-сероватые участки размером 11,5 см., не имеющие четко выраженных границ. В почках под капсулой видны точечные кровоизлияния, в мозговом слое на разрезе выражен венозный застой. Развивается зернистая, жировая дистрофия почек, печени и миокарда.

У 8 - 40-дневных животных или убитых вначале заболевания, наиболее сильно выраженные изменения обнаруживаются в сердце: на эпикарде, иногда на внутренней поверхности перикарда видны серо-желтые наложения фибрина. Одновременно может развиваться серозно-фибринозный перитонит.

У маток, убитых в первые сутки после родов или аборта, слизистая оболочка рогов матки отечна и гиперемирована, шейка матки и влагалище местами геморрагически инфильтрированы. Наблюдается катарально-гнойный эндометрит, цервицит и вагинит. В регионарных лимфоузлах серозный лимфаденит. На плаценте возможны кровоизлияния и некрозы.

У производителей наблюдается увеличение семенников и надсеменниковых лимфоузлов в 1,5 - 2 раза, семяпроводы геморрагически воспалены. В предстательной железе, слизистой уретры и возле головки полового члена - кровоизлияния.

При гистологическом исследовании материала, обнаруживают элементарные тельца и цитоплазматические включения в различных органах и тканях.

Лабораторная диагностика

Диагностика хламидиоза базируется на проведении комплексных исследований и наблюдений. При постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, клиническую, патологоанатомическую картину, результаты гистологических исследований. Решающее значение имеет лабораторная диагностика болезни.

Диагностика хламидиоза включает:

Микроскопический метод - обнаружение хламидий в исследуемом материале с помощью световой и люминесцентной микроскопии (флуорохромированием и иммунофлуоресценцией);

Метод выделения и культивирования хламидий на куриных эмбрионах, культуре клеток, в организме восприимчивых животных с последующей идентификацией возбудителя;

Серологический метод - выявление нарастания титра антител в парных пробах сыворотки больных или переболевших животных в: РСК (реакция связывания комплемента), РДСК (реакция длительного связывания комплемента), РНСК (реакция непрямого связывания комплемента), РНГА (реакция непрямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ);

Молекулярно-генетический метод идентификации хламидий - ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Диагностика микроскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами проводится согласно инструкциям по применению соответствующих диагностикумов и тест-систем.

Материал для исследования.

От больных и подозрительных по заболеванию животных берут фекалии, соскобы с конъюнктивы, гениталий, используя при этом стерильные инструменты, посуду или упаковочную тару. Исследуемый материал вносят в стерильные пробирки с физиологическим раствором в количестве 1 мл. Пробирки помещают в сосуд со льдом и направляют нарочным в лабораторию. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 24 часов.

От подозрительных по заболеванию и абортировавших животных берут кровь дважды: первый раз в период клинического проявления болезни, второй - спустя 14 - 21 день после первого взятия с целью получения сыворотки. Сыворотку крови получают по общепринятой методике, и в количестве 1 - 2 мл направляют в лабораторию, где её хранят при - 20С. Сыворотку, полученную от первого и второго взятия крови, исследуют одномоментно. Гемолизированная, проросшая сыворотка исследованию не подлежит.

От абортировавших маток направляют в лабораторию кусочки плаценты, влагалищную слизь. Абортированные плоды можно отсылать целиком или же их паренхиматозные органы и желудок.

От павших или вынужденно убитых животных посылают кусочки паренхиматозных органов, семенников, головной мозг, пораженные суставы. Материал для исследования отбирают не позднее 2 часов после гибели, аборта или вынужденного убоя животных.

Пробы эякулята или сперму в количестве 1 мл доставляют в лабораторию в пробирках с сухим льдом или в контейнере с жидким азотом.

Доставку исследуемого материала в лабораторию осуществляют с соблюдением правил, исключающих распространение возбудителя болезни.

Микроскопический метод

Световая микроскопия. Из исследуемого материала готовят препараты-отпечатки или препараты-мазки. Препараты окрашивают по Стемпу, Маккиавелло, Романовскому-Гимзе, по Маккиавелло в модификации Здродовского, по модифицированному методу Гименеж (см. приложение 1). В препаратах хламидии, располагаются отдельно или скоплениями внутри и вне клеток. При окраске по Стемпу хламидии ярко-красные, цитоплазма клеток бледно-зеленая, ядра клеток окрашены в бледно-зеленый цвет несколько интенсивнее, чем цитоплазма. При окраске по Маккиавелло хламидии приобретают рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток - светло-синяя, ядра - темно-синие, а по Романовскому-Гимзе - возбудитель хламидиоза окрашивается в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма клеток фиолетово-голубая, ядра сине-фиолетовые.

Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 - 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 - 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 -- 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 -- 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, прикрепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют ярко-зеленым светом, их промежуточные формы -- от соломенно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших животных (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабатывают смесью в равных объемах, состоящей из флуоресцирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обрабатывают только меченой флуоресцирующей хламидийной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) --6,8 г NаС1, 0,63 г КН₂РО₄ и 1,48 г Nа₂НРО₄ последовательно растворяют в 1 л дистиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глицерина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем доводят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материала, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксируют ацетоном на холоде в течение 5--10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения неспецифической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1 : 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные антитела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Затем тщательно промывают ФСБР три раза по 5--10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую меченые ФИТЦ антитела против глобулинов того вида животного, с использованием которого получена первая иммунная сыворотка) сыворотку, выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, которое прикрепляют расплавленным парафином. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зеленым изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смысле, что каждый раз дополнительно необходимо определять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим альбумином, оранжевый, хламидийные структуры -- изумрудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки -- после обработки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидийной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации -- после инкубации со специфическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна давать заметного окрашивания хламидийного антигена;

третий -- нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммунной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый -- в контрольных препаратах, приготовленных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресцирующая хламидийная антисыворотка не должна окрашивать цитоплазму клеток.

Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл, стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% суспензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторакального заражения морских свинок. Наиболее приемлемым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перевиваемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят материалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

1) контроль монослоя в норме;

2) контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

3) контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Серологический метод

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших животных (нарастание титра в 2 и более раза). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах - показатель инфицированности животных.

Постановку РДСК осуществляют согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.04 1986 г. Для постановки РСК Российский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности выпускает «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

В Республике Беларусь разработаны «Методические указания по постановке реакции непрямого связывания комплемента при серологической диагностике хламидийных инфекций у животных» (Фомченко И.В., Максимович В.В., Тюликов С.И.).

В случае нарастания титра антител при исследовании в РНСК парных проб сывороток в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

Молекулярно-генетический метод.

Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в патологическом материале от животных.

Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.

ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.

Идентификация хламидий

Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминесцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.

Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:

1. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;

2. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;

3. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.

При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований:

- выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;

- световая микроскопия - от 30 минут до 2 часов;

- люминесцентная микроскопия - до 3 часов;

- выделение и идентификация хламидий - от 7 до 40 дней;

- выявление ДНК хламидий - от 4 часов до 2 суток.

Дифференциальная диагностика

Хламидиоз животных следует дифференцировать от: бруцеллеза, лептоспироза, болезни Ауески, листериоза, сальмонеллеза, пастереллёза, микотоксикозов, стрептококкоза, стафилакоккоза. У свиней дополнительно дифференцируют от: гемофилёзного полисерозита и актинобациллярной плевропневмонии, болезни Тешена, энтеровирусного гастроэнтерита, цирковирусной инфекции, респираторно-репродуктивного синдрома, классической чумы, парвовирусной инфекции.

Приложения

Приложение 1

Окраска по методу Романовского -- Гимза.

Маточный раствор краски Романовского -- Гимза разбавляют фосфатно-буферным раствором (рН 7,2), для получения которого готовят: раствор А -- 9,5 г двузамещенного Na₂ HРО₄ растворяют в 1 л дистиллированной воды; раствор Б -- 9,2 г однозамещенного NaН₂РО₄ растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для приготовления буферного раствора с рН 7,2 смешивают 72 мл раствора А с 28 мл раствора Б и добавляют 900 мл дистиллированной воды. На каждый миллилитр буферного раствора вносят 2--4 капли маточного раствора краски. Фиксированные мазки окрашивают в специальных кюветах вертикально при комнатной температуре в течение 20--24 ч, промывают дистиллированной водой и дифференцируют около 10 с подкисленным эталоном (3--5 капель ледяной уксусной кислоты на 15--20 мл спирта), вновь промывают, высушивают и исследуют в световом микроскопе.

Элементарные тельца хламидий красно-фиолетовые, промежуточные формы - сине-фиолетового цвета.

Для выявления хламидий, расположенных внутри клеток, используют модифицированный метод Романовского -- Гимза. Фиксированные препараты-мазки покрывают маточным раствором красителя на 10 мин. Краску не сливают, добавляют 3--5 капель дистиллированной воды (рН 7,0) и окрашивают при комнатной температуре 16-- 18 ч. После промывки дистиллированной водой дифференцируют этанолом 45--60 с, вновь промывают дистиллированной водой и повторно дифференцируют этанолом 30 с. Промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе.

Элементарные тельца хламидий, расположенные в цитоплазме клеток, красно-фиолетового цвета, тельца-включения -- сине-фиолетовые.

Окраска по модифицированному методу Гименеж (Набли Б., Таризо М., 1967). Мазки готовят из стенок желточных мешков куриных эмбрионов, в которых культивировали хламидий, затем фиксируют над пламенем. Препараты окрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 5 мин, промывают водой, окрашивают 0,8%-ным водным раствором малахитового зеленого 30 с и промывают водой. Затем обесцвечивают 0,5%-ным раствором лимонной кислоты в течение 2 мин, промывают и повторно окрашивают малахитовым зеленым 30 с. Обесцвечивают 1%-ным раствором хлоралгидрата в течение 1 мин, промывают водой, высушивают. Элементарные тельца и тельца-включения хламидий - красного цвета, фон зеленый.

Окраска по модифицированному методу Стемпа. Препараты фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным дистиллированной водой 1:5 (рH - 7,4) в течение 15 минут. Маточный раствор готовят по прописи: 1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, 5 г карболовой кислоты (фенола)-- в 100 мл дистиллированной воды. Оба раствора смешивают, фильтруют через 4--5 слоев фильтровальной бумаги. Хранится продолжительное время. Перед употреблением нужное количество разводят 1:5.

Препараты промывают дистиллированной водой, дифференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты или 0,05%-ным раствором серной кислоты в течение 1 мин (модификация Гаффарова X. 3.), промывают водой, окрашивают 1%-ным раствором малахитовой зелени 30 с, снова промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

Элементарные тельца хламидий красные на сине-зеленом фоне. Инициальные тельца в одних случаях окрашиваются в красный, в других - в зеленоватый цвет. Метод рекомендуется для исследования патологическом материала, в частности плаценты.

Окраска по Маккиавелло. Готовят три раствора: раствор А - 250 мг фуксина основного растворяют в 100 мл бидистиллированной воды (хранится 10 дней при температуре 4°С); раствор В - 10 г лимонной кислоты растворяют в 100 мл бидистиллированной воды; раствор С - 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл бидистиллированной воды.

Техника окраски: мазки фиксируют над пламенем; раствор А фильтруют через фильтровальную бумагу и наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, на 5--10 мин; промывают дистиллированной водой; дифференцируют в растворе В, состоящем из 5 мл раствора В и 100 мл бидистиллированной воды, в течение 20--30 с; промывают водопроводной водой; докрашивают раствором С в течение 30 с; промывают водой, высушивают на воздухе. Хламидий окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патологического материала -- в светло-синий, ядра клеток -- в темно-синий цвет.

Окраска по Маккиавелло в модификации Здродовского. Готовят три раствора: раствор А (сохраняется в холодильнике в течение нескольких дней) - основной фуксин - 1 г, карболовая кислота - 5 г, этиловый спирт - 10 мл, дистиллированная вода - 100 мл; раствор Б - 0,5%-ный водный раствор метиленовой сини; раствор В - 0,5%-ный раствор лимонной или 0,15%-ный раствор уксусной кислоты.

Техника окраски. Препараты быстро фиксируют над пламенем и покрывают на 5 мин свежеприготовленной смесью: раствор А - 10-25 капель, бидистиллированной воды или фосфатный буфер (рН 7,4) - 10 мл; промывают дистиллированной водой; около 3 с дифференцируют в растворе В; промывают продолжительно дистиллированной водой; быстро окрашивают (10 с) раствором Б; промывают проточной водой, высушивают, исследуют с использованием иммерсионных систем. Хламидий рубиново-красного цвета на светло-голубом фоне. Метод дает хорошие результаты только при окрашивании свежих препаратов.

Приложение 2

Окраска акридиновым оранжевым для люминесцентной микроскопии. Готовят жидкость Корнуа - шесть объемов 96-100%-ного этилового спирта, три объема хлороформа, один объем ледяной уксусной кислоты. Фосфатно-цитратный буфер (рН 3,8): лимонная кислота - 10 г, Nа₂НРО₄-7Н₂О - 15 г, дистиллированная вода - 1 л. При наличии Nа₂НРО₄- 12Н₂О проводят перерасчет:

Nа₂НРО₄7Н₂О НЬ 268,157

Nа₂НР0₄12Н₂0 НЬ 358,157

15 г - 268,157 Х = 15 358,157/268,157 = 20,034

х - 358,157

Маточный раствор акридинового оранжевого: акридиновый оранжевый -- 0,1 г, фосфатно-цитратный буфер -- 100 мл (может храниться в холодильнике). Рабочий раствор акридинового оранжевого готовят в концентрации 1: 10 тыс. -- 1: 30 тыс. на основе указанного буфера.

Список использованных источников

1. Белоусов В.И. Средства специфической профилактики и диагностики хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза животных.//Автореф. дис. д-ра вет. наук. - М. - 1997. - 41с.

2. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней.//Справочное издание. “Урожай” - Киев. - 1991. - 193с.

3. Гласкович А.А., Вострикова В.Н. Диагностика хламидиозов сельскохозяйственных животных / Методич. рекоменд. - Витебск. - 1994. С.8 - 26.

4. Горовиц. Э.С., Тимашева О.А., Петров В.Ф., Карпунина Т.И. Диагностика хламидийных инфекций человека и животных.//Журн. микробиология, эпидемиология и иммунобиология. - М. - 1998. - №2. - С.72-75.

5. Евстифеев В.В. Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики при хламидиозе свиней: Автореф. дисс. канд. вет. наук/Всерос. н..-и. вет. ин-т. - Казань. - 1998.- 26с.

6. Караваев Ю.Д., Калугина И.А., Дьяконов Л.П., Белоусов В.И. Диагностика, профилактика и меры борьбы с хламидиозами животных//Ветеринария. - 1999. - №2. - С.28-30.

7. Конопаткин А.А. Хламидиозы животных.//Лекция. - М. - 1989. - 26с.

8. Кузьмич Р.Г., Фомченко И.В. Урогенитальный хламидиоз крупного рогатого скота в Республике Беларусь.//Уч. записки Межд. науч.конф. “Современные проблемы селекции ветеринарной генетики и защиты животных от болезней.”, посвященной 100-летию со дня рождения профессора О.А. Ивановой, 26-27 сентября 2001. т.37 - 2001. - Витебск. - С.87-89.

9. Максимович В.В., Синица Н.В., Фомченко И.В. Распространение хламидиоза в Республике Беларусь.//Уч. записки т.34: Матер. междунар. науч.- практ. конф. посвященной 70-летию клинических кафедр, 14-15 апреля. - Витебск. - 1998. - С.155-157.

10. Мананков В.В., Тихонов Н.Г., Рыбкина Р.А., Пашанина Т.П., Ротов К.А., Смелянский В.П., Мулик А.В., Васильев В.П. Хламидиозы и смешанные инфекции у сельскохозяйственных животных.// Актуальные пробл. ветеринарии. - Барнаул. - 1995. - С.93.

11. Небогатиков Г.В., Калашников С.В., Небогатикова В.Г. Хламидийное инфицирование половых органов и плаценты у коров//Актуал. пробл. и достижения в области репродукции и биотехнологии размножения животных. - Ставрополь. - 1998. - С.128-130.

12. Обухов И.Л. Методы диагностики орнитоза.//Птицеводство. - 1998. - №5. - С. 27-29.

13. Обухов И.Л. Перинатальные хламидийные болезни у кошек.//Сб. науч. тр. ВГНКИ. - 1996. т.59. - С.18-20.

14. Обухов И.Л., Панин А.Н., Груздев К.Н., Васильев Д.А. Орнитоз.//Учебное пособие. - Ульяновск. - 1998. - 54с..

15. Семёнов В.М., Козин В.М., Дмитраченко Т.И. Хламидиозы: руководство для врачей общей практики. - Витебск. - 2002. - 112с.

16. Толстов В.П. Иммунодиагностика хламидиоза крупного рогатого скота.//Пробл. сел. хоз-ва Сибири. - Омск. - 1996. - С.10-12.

17. Фомченко И.В. Некоторые эпизоотологические данные хламидиоза крупного рогатого скота. /Уч. записки т.34: Матер. междунар. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию клинических кафедр, 14-15 апреля. - Витебск. - 1998. - С.176-178.

18. Фомченко И.В. Реакция непрямого связывания комплемента в диагностике хламидиоза сельскохозяйственных животных.//Аграрная наука на рубеже XXI века: Материалы Общего собрания Академии аграрных наук Республики Беларусь, 16 ноября 2000 г. - Минск, 2000. - С.254.

19. Фомченко И.В. Хламидиоз крупного рогатого скота.//Молодежь, наука, аграрное образование и производство: Сб. тр. молод. учен. и препод. с.-х. учеб. и науч.-исслед. заведений/ Вит. академия вет. медицины. - Витебск, 1999. - С.222-223.

20. Фомченко И.В. Сравнительная эффективность РНСК и РДСК в диагностике хламидиоза крупного рогатого скота.//Материалы учредительной конф. Межд. Ассоциации Паразитоценологов, Витебск, 23-24 сентября 1999г. - Витебск,1999. - С.108-109.

21. Фомченко И.В., Степанов Г.В., Багрецов В.Ф. Хламидиоз крупного рогатого скота// Ветеринарная медицина Беларуси. - 2002 - №2. - С.18-20.

22. Хазипов Н.З., Равилов А.З., Хамадеев Р.Х. Хламидиозы сельскохозяйственных животных. - М.:Колос. - 1984. - 223с..

23. Хамадеев Р.Х., Равилов А.З. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и патогенность их для человека.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - М. - 1997. - №1. - С.99-101.

24. Хусаинов Ф.М., Хамадеев Р.Х., Евстифеев В.В., Равилов А.З. Сравнительная оценка серологических методов РСК, РНГА и ИФА при диагностике хламидиозной инфекции крупного рогатого скота и свиней.//Всерос. науч. конф. “Инфекц. болезни молодняка с.-х. животных.”: Тез. док. - М. - 1996. - С.12-

25. Ятишин А., Бортничук В.А., Павленко Н.С. Патологоанатомические и гистологические изменения при хламидиозе животных.//Вет. медицина Украины. - 1996. - №3. - С.18-19.

26. Anderson I.E., Herring A.J., Jones G.E., Low J.C., Greig A. Development and evaluation of an indirect ELISA to detect antibodies to abortion strains of Chlamydia psittaci in sheep sera.//Veter. Microbiol. Vol. 43. - 1995. - №1. - P.1-12.

27. Bachmaier K., Neu N., M. de la Maza, Pal S., Hessel A., and J. M. Penninger. Chlamydia infections and heart disease linked through antigenic mimicry.//Sci. - 1999. - P.1335-1339.

28. Bockholdt A. Epidemiologische Querschnittsstudie zum Chlamydia psittaci bei weiblichen Kalbern.//Inaug.-Diss. - Hanover. - 1994. - 87s.

29. Gerbermann H. Chlamydiose beim Rind und ihre Bedeutung im Fruchtbarkeitsgeschehen.//Wiener tierarztliche Monatsschrift. Jg.78. - Wien. - 1991. - H.1. - S. 13-19.

30. Hafez H.M., Sting R. Uber das Vorkommen von Chlamydien-Infektionen beim Mastgeflugel.//Tierarztl. Umsch. Jg. 52. - 1997. - №5. - S.281-285.

31. Heinen E. Untersuchungen zur Etilogie von Fruchtbarkeitsstorungen und Atemwegserkrankungen beim Schwein unter besonderer Berucksichtigung von Paramyxoviren und Chlamydien.//Inaug.-Diss. - Giessen. - 1994. - 118s..

32. Kaleta E.F. Aktuelle Fragen der Diagnose und Becampfung der Psittakose.//Tierarztl. Umsch. Jg. 52. - 1997. - №1. - S.36-44.

33. Schiller I., Koesters R., Weilenmann R., Kaltenboeck B, Pospischil A. Polymerase chain reaction (PCR) detection of porcine Chlamydia trachomatis and ruminant Chlamydia psittaci serovar DNA in formalin-fixed intestinal specimens from swine.//J. Veter. Med. Ser. B, Vol. 44. - 1997. - №3. - P.185-191.

34. Shewen P. Chlamydial infection in animals.//Can Vet. J. Vol.21. - 1980. - P.2-11.

Размещено на Allbest.ru