Лабораторная диагностика инфекционного бронхита у птиц

Размещено на http://www.allbest.ru/

6

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лабораторная диагностика инфекционного бронхита

инфекционный профилактика курица бронхит

Инфекционный бронхит (ИБК) - вирусное контагиозное заболевание, поражающее кур, проявляется у молодняка - респираторным и уремическим синдромами, а у кур - поражением герминативных органов, что ведет к длительному снижению яйценоскости. Протекает в 3 формах: респираторной, нефрозо-нефритной, репродуктивной.

Свойства вируса

Order: Nidovirales, семейство коронавирусов (F. Coronaviridae), подсемейство Coronavirinae, род Gammacoronavirus.

· структура: размер -80 - 160 нм, форма - округлая, нуклеокапсид в виде бублика, тип симметрии - спиральный, суперкапсид, на котором булавовидные «выступы».

· геном: одноцепочечная РНК «+» нить, инфекционна.

· Устойчивость - слабая в щелочной среде, но резистентные к кислой (рН - 3). Т - 56⁰С - 10 мин., Т - - 30⁰С - 17 лет.

· Репродукция - происходит в цитоплазме, куда вирусы проникают посредством эндоцитоза. Репликация осуществляется через субгеномные РНК, которые нужны для трансляции белка М. «+» нить без транскрипции приступает к трансляции и образованию белка полипротеина, который затем нарезается с помощью ферментов - протеаз на маленькие участки для проявления их инфекционности. Сборка и выход вируса из клетки путем почкования.

· АГ вариабельность, родство: существует Аг и иммуногенная вариабельность штаммов - около 30 серотипов.

· ГА свойства: эритроциты птиц после обработки ферментами.

Клиническая картина

Инкубационный период продолжается от 1 до 5 дней. У больной птицы отмечается угнетение, внезапная потеря аппетита, одышка, хрипы, кашель, чихание, серозный конъюнктивит, ринит. Высокая заболеваемость, смертность достигает 25%. Заражение в возрасте до 2-х недель приводит к задержке роста яичника и яйцевода. При заражении взрослых кур происходит резкое падение яичной продуктивности на 35-50%, яйца с водянистым содержимым, нарушенной скорлупой. При инфантилизме яичника и яйцевода нарушается формирование яиц. Перенос возможен аэрогенно при контакте, трансовариально. Переболевшая птица остаётся носителем вируса до 50-100 дней после заражения. Наблюдается и латентное течение инфекции, которое осложняется за счёт возбудителей колибактериоза, респираторного микоплазмоза.

Отбор материала для исследования. Для исследований от больной птицы берут смывы с гортани и трахеи во время инкубационного периода или проявления ярких клинических признаков. От вынужденно убитых или только что павших птиц берут кусочки легких, почек, соскобы трахеи, гортани, бронхов, от взрослой птицы - почки и яйцеводы. В период острого течения болезни вирус может быть выделен из яиц. Испытуемый материал до исследования можно хранить при температуре -20-70⁰С в течение недели. Из образцов взятого материала готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса или изотоническом буферном растворе, центрифугируют 15 мин при 2-3 тыс. мин^-1. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина), выдерживают 1,5 2 ч при температуре 4⁰С и используют для заражения чувствительной системы (КЭ, культура клеток почек КЭ или фибробластов цыплят 10 - 25-дн возраста). Также отбирают парные сыворотки крови.

Непосредственно лабораторная диагностика.

Экспресс методы: РИФ (р-я иммунофлуоресценции), ИФА (иммуноферментный анализ), МГ (молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот), ПЦР (полимеразноцепная реакция).

Иммуноферментный анализ (ГХ ИФА):

Компоненты реакции:

· Препарат, содержащий клетки, инфицированные вирусом

· Ацетон для фиксации препарата

· Не меченная специфическая сыворотка

· АТ 2-го порядка - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат

· Субстрат - 3,3 - ДАБ - 4HCl

Ход постановки реакции:

· Препарат фиксируют охлажденным ацетоном и высушивают на воздухе

· Наносят специфическую к искомому вирусу сыворотку

· Инкубируют при 37⁰С 1-2 часа во влажной камере

· Промывают физиологическим раствором 5 мин и высушивают на воздухе

· Наносят антивидовой иммунопероксидазный конъюгат в рабочем разведении

· Инкубируют при 37⁰С 1-6 часов во влажной камере

· Тщательно промывают физиологическим раствором, споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе

· Наносят несколько капель раствора субстрата

· Инкубируют 5-10 мин

· Промывают физиологическим раствором и споласкивают дистиллированной водой

Учет реакции:

Производят с помощью светового микроскопа. Диаминобензидинтетро-хлорид под действием пироксидазы разлагается, образуя продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый. В препарате видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричневого цвета в местах образования комплекса АГ - АТ в клетке.

Изоляция вируса.

1. КЭ 9 - 11 дней, заражение в аллантоисную полость. Через 2 - 8 суток гибель; карликовость и мумификация зародыша, отёк ХАО и амниотической оболочки, изменение объема эмбриональных жидкостей, сморщивание желчного мешка; РГА.

2. органная культура трахеи 19-дневных эмбрионов или зараженных цыплят. Через 3 суток прекращение подвижности реснитчатого эпителия слизистой оболочки трахеи.

3. КК почек, легких или фибробластов куриных эмбрионов. Через 24 часа ЦПД: синцитии.

4. цыплята, зараженные интратрахеально. Через 1 - 2 суток признаки поражения дыхательных путей, возможна гибель, патологоанатомические изменения.

Идентификация вируса. РН (р-я нейтрализации), РЗГА (р-я задержки гемагглютинации), РДП (р-я диффузионной преципитации), РИФ (р-я имунофлюоресценции), РСК (р-я связывания комплемента), ИФА (иммуноферментный анализ), ЭМ, ИЭМ.

Ретроспективная диагностика. РН (р-я нейтрализации), РЗГА (р-я задержки гемагглютинации), РНГА (р-я непрямой гемагглютинации), РСК (р-я связывания комплемента), РДП (р-я диффузионной преципитации), ELISA

Дифференциальная диагностика. Инфекционный ларинготрахеит, Ньюкаслская болезнь, грипп, оспа, инфекционный ринотрахеит, респираторный микоплазмоз, гемофилёз.

Иммунизация. Специфическая профилактика основывается на применении инактивированной и живой вакцин. Существуют моно и поливалентные, ассоциированные вакцины.

Применение инактивированных вакцин. Достаточно эффективным оказались эмульгированные вакцины из концентрированного вируса. Введение инактивированной вакцины в 3 и 16-нед возрасте дало такой же эффект, как и прививка живыми вакцинами. Наиболее выраженный иммунный ответ у 100% цыплят получен при вакцинации в 3-нед возрасте живой вакциной из шт. Н120, а в 16-нед возрасте - инактивированной эмульсинвакциной. Рекомендовано при конструировании инактивированных вакцин против ИБ использовать несколько штаммов.

Применение живых вакцин. Штаммы, полностью утратившие вирулентность, практически неиммуногенны. Поэтому живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов, обладающих различной степенью остаточной вирулентности. Для первой прививки применяют более аттенуированные и менее иммуногенные штаммы, для второй более вирулентные. Живые вакцины применяют орально (с питьевой водой) или путем закапывания в нос. Введение живой вакцины в зоб цыплятам создавало устойчивость к заражению без образования циркулирующих АТ. Эти данные свидетельствуют о важной роли местного иммунитета при ИБ. Материнские АТ от иммунных кур-несушек передаются через яйцо цыплятам, которых они защищают в первые 2 - 4 нед жизни от ИБ. Период полужизни материнских АТ составляет немногим более 5 дн. Со второй недели жизни титр их начинает снижаться. Оптимальный возраст для вакцинации цыплят живыми вакцинами составляет 2-3 нед.

Сотрудниками ВНИВИП создана живая вакцина из аттенуированного штамма ВИБ. В неблагополучных пунктах иммунизируют всех цыплят в 10 - 15-дн возрасте 2-кратно через 14 - 15 дн. Ревакцинируют птиц в 100 - 120-дн возрасте.

При оценке различных программ вакцинации против ИБ в компании Питмен Моор сравнивали титры АТ в РЗГА и РН. Цыплят первый раз иммунизированных в возрасте различными живыми вакцинами, а повторно в 16-нед возрасте инактивированными адъювант вакцинами из шт. М41 или GV101. В итоге установлено, что уровень АТ у привитых цыплят был выше к вирусу М41 и ревакцинированных убитой вакциной из двух штаммов, имелись более высокие титры АТ к серотипам Массачусете и Д207. Аттенуированные вакцинные шт. Массачусете 33 и Н120 персистируют в трахее и легких с 3 до 13 дн после вакцинации.

Идентификацию вируса проводят при помощи РН, РДП, РЗГА, РСК, РНГА, РИФ и др. РН и РНГА - типоспецифические и используются при определении серологического типа вируса. РДП и РНГА идентифицируют вирус без выявления типовой принадлежности. РСК устанавливает штаммоспецифичность в пределах одного АГ типа.

Размещено на Allbest.ru