Оксидативный стресс и система оксида азота при постнатальной адаптации и развитии заболеваний у сельскохозяйственных животных

RSNO, Моль/мл

2544±55,3

3046±139,2*

2490±172,4

2709±42,5 ^{Ў^}

Примечание: * - P_1-2 < 0,005; - P_1-3 < 0,05; ^Ў - Р_3-4 < 0,05, ^{^} - Р_2-4 < 0,05

Такое значительное увеличение продукции NO с одной стороны, необходимо для расслабления цервикального канала, с другой - обусловлено развитием физиологического стресса у коров перед родами.

У коров с послеродовым эндометритом в период стельности в 250-260 дней уровень оксида азота был ниже на 21,9%. При этом содержание S-нит-розотиолов статистически достоверно не отличалось от уровня, характерного для животных без акушерской патологии. Возможно, что достижение определенной концентрации оксида азота имеет физиологический смысл для нормального течения родового акта, сократительной функции матки и отделения последа, что и снижает вероятность развития эндометрита.

Резкое возрастание продукции NO выявлено при развитии послеродового эндометрита, в этиологии которого существенная роль принадлежит микробному фактору. В этом случае повышение уровня стабильных метаболитов оксида азота уже после отела в 2,9 раза, по сравнению с его уровнем у животных без патологии, возможно, является следствием его генерации в иммунокомпетентных клетках - макрофагах и нейтрофилах.

Таким образом, проведенные исследования позволяют считать, что состояние антиоксидантного статуса и системы оксида азота играют существенную роль, как в регуляции функционирования репродуктивной системы, так и в патогенезе послеродового эндометрита.

3.6.4 Интенсивность пероксидного окисления, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при субинволюции матки

Исследования проведены на 2-х группах коров, которые на основании акушерско-гинекологических исследований ретроспективно были разделены на клинически здоровых (n=39) и коров, с нарушением сократительной функции матки после отела (n=26).

Установлено, что до родов у оставшихся в последствии здоровыми и коров с послеродовой субинволюцией матки был сходный уровень содержания стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови.

В период клинического проявления острой субинволюции матки интенсивность продукции оксида азота возрастала. Уровень NOх в крови коров с острой субинволюцией матки на следующий день после родов превышал таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов на 48,4%, через 2 суток - в 2,5 раза, через 3 суток - в 2,3 раза (рис. 9).

Высокая интенсивность генерации оксида азота в организме больных животных, по-види-мому, обусловлена развитием воспалительного процесса в этот момент, сопровождающегося активацией свободнорадикаль-ного окисления, внутриклеточной кальциевой перегрузкой, что в свою очередь активирует NO-синтазы, отвечающие за синтез NO.

Изменения в динамике содержания S-нитрозотиолов были аналогичны в предродовой период, а после отела носили противоположный характер. Вероятно, более низкая концентрации RSNO после отела у животных с нарушением сократительной функции матки связана с нарушением механизмов регуляции системы оксида азота. Данные нарушения и проявление избыточного релаксирующего действия самого оксида азота на миометрий, могут являться одной из причин сбоя физиологического течения инволюционных процессов в матке.

Несколько иная динамика была выявлена при изучении процессов свободнорадикального окисления липидов и функционального состояния антиоксидантной системы. Если в предродовой период статистически достоверных различий между показателями интенсивности системы оксида азота у оставшихся здоровыми и заболевших животных не было выявлено, то для коров с субинволюцей матки за 10-14 дней до отела была характерна пониженная мощность глутатионового звена АОС (табл. 10).

Об этом свидетельствует более низкий уровень в крови у заболевших после отела коров глутатионредуктазы (на 38,2%) - фермента, поддерживающего общий пул восстановленного глутатиона в организме. Помимо этого, у заболевших коров в крови снижена активность ГПО на 39,8 %, что в целом свидетельствует о более низком уровне функционального состояния ферментативного звена антиоксидантной системы у коров, предрасположенных к субинволюции матки.

Таблица 10. Активность ферментов глутатионового звена системы антиоксидантной защиты в крови у здоровых и заболевших коров

Группа животных	За 10-14 дней до отела	Через 1-2 суток после отела
Глутатионпероксидаза, мМ восстановленного глутатиона/лЧмин
Здоровые	21,22,34	29,32,32
Заболевшие	14,12,17*	18,12,18*
Глутатионредуктаза, мкМ окисленного глутатиона/лЧмин
Здоровые	256,418,6	200,421,6
Заболевшие	158,015,9*	120,617,8*

Примечание: * - P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными

Следствием сниженного функционального состояния глутатионового звена антиоксидантной системы, контролирующей интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления, является и более высокое содержание в крови у заболевших коров первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов (табл. 11).

Таблица 11. Содержание продуктов ПОЛ в крови у здоровых и заболевших коров в разные периоды до и после отела

Группа животных	Периоды исследования
	За 10-14 дней до отела	Через 1-2 суток после отела
Конъюгированные диены
Здоровые	0,1240,016	0,1440,025
Заболевшие	0,1560,034	0,2660,035*
Малоновый диальдегид
Здоровые	0,560,051	0,980,055
Заболевшие	0,880,064*	2,290,109*
Основания Шиффа
Здоровые	0,160,012	0,270,029
Заболевшие	0,240,019*	0,790,062*

Примечание: *- P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными

За 10-14 дней до отела у коров, которые после родов имели нарушение инволюционных процессов, содержание малонового диальдегида было выше на 57,1%, чем у оставшихся впоследствии здоровыми животных

На второй день после родов у коров без субинволюции матки содержание в крови конъюгированных диенов превышает дородовый уровень на 16,1%, малонового диальдегида - на 75,0%. У заболевших после родов коров, уровень конъюгированных диенов возрастал на 70,5 %, а малонового диальдегида - в 2,3 раза.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ состояния систем АОЗ и процесса ПОЛ у коров с нормальным и патологическим течением послеродового периода свидетельствует о том, что у животных, у которых в дальнейшем развилась субинволюция матки, уже за 10-14 дней до отела отмечается тенденция к снижению потенциала ферментативного звена системы АОЗ и более интенсивному течению процессов пероксидации липидов. Это не позволяет адекватно контролировать и удерживать в физиологических пределах нарастающий при стрессе уровень активных форм кислорода, сдерживать чрезмерную активацию процессов ПОЛ, что приводит к неблагоприятным метаболическим изменениям.

3.6.5 Антиоксидантный статус и система оксида азота у коров с дисфункцией яичников

Установлено, что у коров с дисфункцией яичников происходит интенсификация процессов СРО, о чем свидетельствует повышение содержания в крови МДА на 44,0% по сравнению со здоровыми циклирующими животными (табл. 12).

Таблица 12. Показатели системы ПОЛ-АОЗ у коров в норме и при дисфункции яичников

Показатели системы ПОЛ-АОЗ	Группы животных
	Контроль	Бесплодные, дисфункция яичников
МДА, (мкМ/л)	1,00±0,277	1,44±0,058*
Каталаза, (мМ Н2О2/лмин)	25,9±1,80	32,2±0,84*
ГПО, (мМ G-SН/лмин)	9,4±0,32	12,0±0,64*
ГР, (мкМ G-SS-G/лмин)	293,1±12,6	324,1±8,24*
СОД, (усл.ед./мг Hb)	0,72±0,035	0,95±0,051*

Примечание: * - P < 0,05 по сравнению со здоровыми животными

Учитывая то, что пероксидное окисление липидов играет важную роль в липидном обмене организма, можно предположить, что значительное возрастание скорости течения СРО при бесплодии, может являться одной из причин угнетения синтеза стероидных гормонов, а, следовательно, нарушения стероидогенеза (Зенков Н.К. с соавт., 2001), характерного для данной патологии.

Высокое содержание МДА - промежуточного продукта ПОЛ - у бесплодных животных не связано с функциональной недостаточностью ферментативного звена антиоксидантной системы, о чем свидетельствует более высокий функциональный потенциал антиоксидантной системы у коров с дисфункцией яичников. Так, у них, по сравнению со здоровыми циклирующими животными, активность каталазы была выше на 24,3%, СОД - на 31,9%, ГПО - на 27,7%, ГР - на 10,6%.

Однако надо отметить наличие определенного дисбаланса в работе глутатионового звена системы АОЗ, поскольку, при повышении активности ГПО на 27,7%, активность ГР возрастала всего на 10,6%, а следовательно пул восстановленного глутатиона истощался.

У коров с дисфункцией яичников наблюдалось снижение суммарной концентрации NO₂^Ї+NO₃^Ї в сыворотке крови на 61,1% и содержания S-нитрозотиолов на 29,8% по сравнению с контрольными животными (рис. 10).

Дать однозначную оценку физиологическому эффекту снижения продукции оксида азота при дисфункции яичников у коров сложно. Однако, исходя из имеющихся данных о том, что оксид азота способен замедлять процесс старения яйцеклеток (Goud P.T. et al., 2008), можно предположить, что снижение уровня генерации оксида азота у бесплодных животных влечет за собой нарушение процесса ово- и фолликулогенеза и дисфункцию гонад. Кроме того, установлена взаимосвязь образования в организме NO с уровнем эстрогенов (Moreno A.S., Franci C.R., 2004) и прогестерона (Coughlan T. et al., 2005).

Таким образом, развитие ряда заболеваний сельскохозяйственных животных, таких как бронхопневмония, жировая дистрофия печени и патологии репродуктивной системы сопровождается изменением в интенсивности образования оксида азота. В этой связи можно полагать, что модулирующее воздействие на систему генерации оксида азота позволит направленно влиять на функциональное состояние организма и может послужить основой для разработки нового класса лекарственных препаратов.

3.7 Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность свободнорадикального окисления, состояние АОС и систему оксида азота в норме и при экспериментальных патологических состояниях

В опытах на самцах белых беспородных крыс по влиянию модуляции продукции оксида азота на состояние оксидантно-антиоксидантного равновесия и системы оксида азота в качестве блокаторов синтеза NO применяли аминогуанидин (AG) - селективный ингибитор индуцибельной формы NO-синтазы и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) - неселективный ингибитор NO-синтаз (Гильяно Н.Я. с соавт., 2007). В качестве индуктора синтеза NO использовали L-аргинин (L-Arg), являющегося естественным эндогенным источником образования оксида азота в организме (Wink D.A., Mitchell J.B., 1998) и соединение ФБ-26, являющееся одновременно и антиоксидантом, и донором оксида азота (Мищенко Д.В. с соавт, 2003).

3.7.1 Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота у здоровых животных

Установлено, что введение животным L-аргинина в дозе 400 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток приводит к увеличению суммарного содержания в плазме крови нитрата и нитрита на 43,5%, а применение ингибиторов NO-синтазы - к снижению более чем в 2 раза суммы NOх в крови у животных (табл. 13).

Таблица 13. Содержание суммы стабильных метаболитов оксида азота и нитрозотиолов в плазме крыс в условиях модуляции продукции оксида азота

Группа животных	NOx мкМ/л	RSNO, нМоль/л
1. Контроль	14,70,60	143660,5
2. L-аргинин	21,10,87*	218347,1*
3. L-NAME	7,00,18*^	134033,3^
4. Аминогуанидин	6,70,47*^	116545,6^

Примечание: *- P_1-2,3,4 <0,05-0,001 ^{^}- P_2-3,4 <0,05-0,001

В то же время введение животным L-NAME и AG - ингибиторов NO-синтаз в дозе 50 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток не вызвало существенного изменения в содержании S-нитрозотиолов по сравнению с животными контрольной группы. Это, возможно, связано с тем, что в плазме крови существует некий базовый уровень S-нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, и который даже в условиях ингибирования его продукции используется незначительно.

Генерация супероксиданиона в разных компартментах клетки при введении L-аргинина статистически не отличалась от интенсивности его образования у контрольных животных. В тоже время, применение блокаторов синтеза NO приводило к увеличению как спонтанной, так и стимулированной продукции супероксиданиона (табл. 14).

Таблица 14. Спонтанная, НАДН- и НАДФН-стимулированная продукция супероксид-анионрадикала в гомогенате печени крыс

Группа животных	Продукция O2, нмоль/гсек
	Спонтанная	Стимулированная
		НАДН	НАДФН
1. Контроль	0,51 0,013	6,49 0,082	7,18 0,098
2. L-аргинин	0,42 0,020	6,53 0,100	7,27 0,175
3. L-NAME	0,76 0,056*^	9,07 0,300*^	12,67 0,340*^
4. Аминогуанидин	0,61 0,045*^	8,02 0,521*^	12,09 0,284*^

Примечание: *- P_1-2,3,4 <0,05; ^{^}- P_2-3,4 <0,05

Введение здоровым животным L-аргинина, аминогуанидина и L-NAME не влияло на интенсивность процессов пероксидации липидов и окислительной модификации белков, так как статистически достоверных изменений в содержании диеновых конъюгатов, кетодиенов, малонового альдегида и карбонильных групп в белках не было установлено.

Полученные данные подтверждают концепцию о циклических превращениях для NO в организме млекопитающих (Реутов В.П. с соавт., 1998), благодаря чему обеспечивается не только его эффективная наработка, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества (ионы NO₂^Ї и NO₃^Ї), чем и может быть объяснено отсутствие биологического ответа при применении, как активаторов, так и ингибиторов NO-синтаз.

Введение животным эндогенного предшественника оксида азота L-аргинина повышало на 13,6 % активность СОД и на 22,1% - каталазы.

Активация синтеза оксида азота L-аргинином у здоровых животных повлияла на активность и ферментов глутатионового звена АОЗ. Так, активность глутатионпероксидазы статистически достоверно возрастала на 16,7%, а активность глутатионредуктазы - на 14,1 %. Применение же блокаторов синтеза оксида азота здоровым крысам не вызывало статистически достоверных изменений в активности ферментов АОЗ.

Таким образом, стимуляция продукции NO, с одной стороны не оказывает влияние на интенсивность процессов СРО, а с другой способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты. Механизм повышения активности ферментов АОЗ, может быть связан с влиянием NO на экспрессию генов, кодирующих данные ферменты (Dobashi K. et al., 1997; White A.C. et al., 1995).

3.7.2 Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при эмоционально-болевом стрессе

Исследование проведено на 4-х группах животных. Первая группа - интактные животные (n=8). Крысам 2-ой группы (n=10) вводили внутрибрюшинно 1 мл дистиллированной воды. Животным третьей группы (n=10) - внутрибрюшинно вводили однократно водный раствор L-аргинин в дозе 200 мг/кг, для которого в этой дозе установлено выраженное антистрессорное действие (Gupta V. et al., 2005). Крысам 4-ой (n=10) группы - однократно внутрибрюшинно раствор аминогуанидина в дозе 50 мг/кг. Через 6 часов животных 2, 3 и 4 группы иммобилизировали в течение 12 часов в положении на спине с фиксацией конечностей.

На основании проведенных исследований установлено, что введение L-аргинина и блокатора NO-синтаз - аминогуанидина при 12-ти часовой иммобилизации по-разному влияет на выраженность и проявление стресс-реакции.

Введение животным L-аргинина достаточно эффективно препятствует снижению массы тела крыс при эмоционально-болевом стрессе, уменьшает в 1,48 раза гипертрофию надпочечников, в 1,89 раза и 1,4 раза инволюцию селезёнки и тимуса, соответственно.

Иммобилизация крыс на фоне ингибирования NO-синтаз аминогуанидином приводит к усугублению проявлений триады Селье в стадии напряжения стресс-реакции: более выраженная гипертрофия надпочечников и инволюция органов тимико-лимфатической системы по сравнению, как с контрольными, так и с животными, которым вводили L-аргинин.

Применение L-аргинина перед стресс-воздействием способствует снижению интенсивности образования супероксиданиона в печени крыс: спонтанная продукция уменьшалась на 49,6%, НАДН-стимулированная - на 35,7%, НАДФН-стимулированная - на 17,4%, по сравнению с животными, которых иммобилизировали без применения каких-либо веществ. И, наоборот, ингибирование продукции NO аминогуанидином вызывало существенное повышение как спонтанной, так и стимулированной продукции O₂.

предварительное введение животным блокатора и донора оксида азота по-разному сказалось на характере изменений процессов пероксидного окисления биологических субстратов и ответной реакции антиоксидантной системы на стресс-воздействие. Так, введение L-аргинина вызывало статистически достоверное снижение на 20,4% содержания в крови МДА и на 45,1% окислительной модификации белков плазмы крови, по сравнению с аналогичными показателями у животных, подвергнутых иммобилизации без применения модуляторов. Блокада синтеза оксида азота, напротив, приводила к некоторому усилению свободнорадикального окисления липидов и белков при стрессе.

При изучении состояния некоторых показателей ферментативного звена АОС при развитии эмоционально-болевого стресса на фоне модуляции продукции оксида азота, установлено, что предварительное введение животным L-аргинина приводит к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты. Активность СОД возрастала на 23,4%, активность каталазы - на 28,3%, активность ферментов глутатионового звена: ГР и ГПО - на 27,3% и 36,2%, соответственно, по сравнению с данными показателями у иммобилизированных животных (табл. 15).

Таблица 15. Состояние ферментативного звена антиоксидантной системы при ЭБС при модуляции синтеза оксида азота

Группа животных	СОД	Каталаза	ГПО	ГР
1. Интактные	1,280,044	35,30,84	36,71,27	159,53,19
2. Иммобилизация	1,750,018*	42,71,95*	47,81,93*	181,94,83*
3. Иммобилизация + L-аргинин	2,160,045*^	54,81,13*^	65,12,40*^	231,54,61*^
4. Иммобилизация +АG	1,940,067*^?	44,11,31*?	49,32,57*?	176,55,56*?

Примечание: *- P_1-2,3,4 < 0,05; ^{^} - P_2-3,4 <0,05; ^? - P _3-4 <0,05

Применение же блокатора NO-синтаз аминогуанидина не оказывало существенного влияния на характер изменений в ферментативном звене антиоксидантной системы при стрессе по сравнению с животными контрольной (иммобилизация) группы.

Таким образом, стимуляция образования оксида азота в организме животных повышает их устойчивость к действию стресс-факторов и установленные эффекты NO могут лежать в основе ограничения свободнорадикального окисления и активации адаптационных перестроек метаболизма при развитии стрессового состояния.

3.7.3 Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при токсическом повреждении печени

Исследование проведено на 5 группах животных. Первая группа - контрольные животные (n=10). У крыс 2-й группы (n=10) вызывали токсическое повреждение печени тетрахлорметаном (CCl₄). Крысам 3-ей группы (n=15) в течение 6 дней внутрибрюшинно вводили водный раствор L-аргинин в дозе 400 мг/кг. Животным 4-ой (n=15) и 5-ой (n=15) групп вводили метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) и аминогуанидин в одинаковой дозе 50 мг/кг. У крыс 3, 4 и 5 групп на фоне введения L-аргинина, L-NAME и AG на 5 и 6 дни вызывали токсическое повреждение печени введением CCl₄. Исследования проводили через сутки после второго введения тетрахлорметана.

Установлено, что токсическое поражение печени тетрахлорметаном на фоне введения L-аргинина сопровождалось увеличением продукции NO в 5,2 раза, по сравнению с животными контрольной группы, и в 3,8 раза по сравнению с животными, получавшими только L-аргинин. Применение блокаторов NO-синтаз - L-NAME и AG - приводило к снижению образования NO на 13,2% и 20,0% (P<0,05), соответственно, по сравнению с группой животных с CCl₄-интоксикацией.

Поддержание концентрации оксида азота на определенном уровне при токсическом повреждении печени, видимо, играет роль в ограничении чрезмерной активации процесса свободнорадикального окисления и его повреждающих эффектов, так как применение индуктора синтеза NO ? L-аргинина, снижало, а введение блокаторов NO-синтаз (AG и L-NAME) усугубляло проявление цитолитического синдрома в условиях CCl₄-интоксикации. Об этом свидетельствовало снижение активности в сыворотке крови АлАТ на 23% (P<0,05) при стимуляции продукции NO при токсическом повреждении печени по сравнению с данным показателем у крыс, которым вводили только CCl₄.

Установлено, что токсическое повреждение печени при введении L-аргинина сопровождается снижением интенсивности образования супероксиданиона в печени крыс: спонтанная продукция уменьшалась на 22,2%, НАДН-стимулированная - на 20,5%, НАДФН-стимулированная - на 21%, по сравнению с животными, которым вводили только ССl₄. Вполне вероятно, что гепатопротекторный эффект применения L-аргинина, описанный выше, связан именно со снижением продукции супероксиданионрадикала.

Ингибирование продукции NO при токсическом повреждении печени вызывало повышение как спонтанной, так и стимулированной продукции O₂, что привело к более ярко выраженному цитолизу клеток печени.

Интенсификация наработки NO понижала степень окислительной модификации белков на 21,6% (рис. 11) и содержание МДА на 16,9%. Наиболее ярко выраженный прооксидантный эффект имело введение аминогуанидина.

Применение L-аргинина не только ограничивает активацию свободнорадикального окисления биологических субстратов при токсическом повреждении печени, но и сохраняет эффективный контроль этого процесса со стороны антиоксидантной системы в отношении локализации более глубоких стадий окисления.

Предварительное введение животным L-аргинина вызывало увеличение активностей ферментов антиоксидантной защиты: активность СОД возрастала на 20,3%, активность каталазы - на 33,1%, активность ферментов глутатионового звена: ГР и ГПО - на 33% и 34%, соответственно, по сравнению с группой животных с ССl₄-интоксикацией.

Применение же L-NAME и аминогуанидина не оказывало существенного влияния на состояние ферментативного звена антиоксидантной системы при токсическом повреждении печени, по сравнению с животными, которым вводили только тетрахлорметан.

Таким образом, стимулирование продукции NO (введение L-аргинина) повышает резистентность клеток печеночной паренхимы к повреждающему действию тетрахлорметана. Подобный цитопротекторный эффект связан, вероятно, с тем, что NO способен инактивировать супероксиданион - один из наиболее важных агентов свободнорадикального окисления, который вызывает дезинтеграцию биомембран (Осипов А.Н. с соавт., 1990).

3.7.4 Влияние аргинина, аминогуанидина и L-NAME на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при ожоге

Исследования влияние модуляторов синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС и систему оксида азота при ожоге проведены на 4-х группах крыс по 10 животных в каждой. Первая группа - интактные животные. Животным второй группы перед нанесением ожоговой травмы ежедневно в течение 6 дней один раз в день внутрибрюшинно вводили 1 мл дистиллированной воды, крысам 3-ей группы - L-аргинин в дозе 400 мг/кг, 4-ой - аминогуанидин в дозе 50 мг/кг массы тела. Исследования проводили на 3-и сутки после нанесения ожога.

Крысам 2, 3 и 4 групп наносили два дозированных симметричных ожога площадью по 300 мм²

Введение животным перед нанесением ожоговой травмы L-аргинина и аминогуанидина по-разному сказалось на характере изменений скорости пероксидного окисления липидов и ответной реакции антиоксидантной системы на ожоговую травму.

Если у крыс контрольной группы содержание диеновых конъюгатов на 3-и сутки после нанесения ожоговой травмы было увеличено на 68,4%, то у крыс, которым перед нанесением ожога в течение 6 дней внутрибрюшинно вводили L-аргинин в дозе 400 мг/кг, уровень конъюгированных диенов в крови возрастал всего на 17,1%.

Введение животным перед нанесением ожоговой травмы аминогуанидина в некоторой степени даже способствовало интенсификации накопления в крови вторичных продуктов ПОЛ. Так, у крыс контрольной группы концентрация МДА в крови на 3-и сутки после нанесения ожога была выше, чем у интактных животных на 95,6 % , а у крыс, которым вводили AG - на 128,1 % и выше, чем у контрольных крыс, на 16,7% (P<0,05).

Соотношение МДА/ДК дает возможность судить о направленности интенсивности процессов свободнорадикального окисления и характеризовать функциональное состояние антиоксидантной системы.

Из данных представленных на рисунке 12 видно, что если введение аминогуанидина существенно не отражается на общей направленности процессов ПОЛ при ожоге, то применение L-аргинина не только ограничивает его активацию, но и сохраняет эффективный контроль этого процесса со стороны антиоксидантной системы, в отношении локализации более глубоких стадий окисления.

Существует прямая зависимость между изменением концентрации в плазме крови суммы NOх и НАДФН-стимулированной продукцией супероксиданиона в печени крыс при ожоговой травме (рис. 13). Коэффициент корреляции между уровнем NOх и НАДФН-стимулированной генерацией О₂ составляет +0,96 (P<0,001), а между уровнем NOх и НАДН-стимулированной генерацией О₂ - всего +0,27 (P0,05).

Оценивая скорость заживления ожоговой раны на фоне модуляции оксида азота (рис. 14), можно констатировать следующее: нанесение ожога III Aстепени при стимуляции продукции NO L-аргинином примерно на неделю ускоряет, а на фоне ингибирования продукции NO аминогуанидином - на неделю замедляет восстановление кожного покрова после ожога и заживление ожоговой раны. Эти различия начинают проявляться уже на 3-и сутки постожогового периода, но наиболее заметны они становятся в период с 7 по 14 сутки.

Таким образом, изменения в процессах пероксидного окисления липидов, состоянии антиоксидан-тной системы, суммарном содержании нитратов и нитритов (NOх) у крыс при ожоговой травме, вызываемые использованием модуляторов продукции NO, обуславливают различную скорость заживления ожоговой раны.

3.7.5 Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота при эмоционально-болевом стрессе

Установлено, что применение ФБ-26 в дозах 20 и 100 мг/кг предупреждает снижение массы тела крыс при иммобилизационном стрессе. Введение ФБ-26 в этих дозах препятствует развитию стрессорной гипертрофии надпочечников - достоверно предотвращает снижение их массы в 1,2 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с группой животных подвергнутых иммобилизации. Имеется также дозозависимое предупреждение язвообразования на слизистой желудка. Так, среди животных, получавших ФБ-26 дозе 20 мг/кг, поражения обнаружены у 50% крыс, в дозе 100 мг/кг - у 30%. Всё это свидетельствует о том, что соединение ФБ-26 обладает выраженной стресс-протекторной активностью, наиболее выраженной при введении его в дозе 100 мг/кг.

Применение ФБ-26 в указанных дозах крысам за 6 часов до иммобилизации в значительной мере предотвращает стрессовую активацию процессов ПОЛ, снижая степень избыточного накопления продуктов липопероксидации в организме. Уровень МДА в крови крыс, которым вводили ФБ-26 в дозе 20 мг/кг, был ниже на 17,2%, по сравнению с животными группы отрицательного контроля. Применение этого соединения в дозе 100 мг/кг стабилизировало интенсивность пероксидного окисления липидов на уровне, характерном для интактных животных (табл. 16).

Реакция со стороны глутатионового звена системы АОЗ на острое стресс-воздействие у крыс, получавших ФБ-26, принципиально схожа с реакцией этого звена системы АОЗ у животных 2-ой группы (иммобилизация). Однако степень выраженности этих изменений несколько меньше. Наблюдается даже некоторое понижение активности ГПО и ГР по сравнению с показателями, характерными для животных второй группы. Так, активность глутатионпероксидазы в группе с применением препарата в дозе 100 мг/кг снижается на 14,1%, а глутатионредуктазы - на 21,3%.

Таблица 16. Влияние ФБ-26 на систему ПОЛ-АОЗ в крови крыс при иммобилизации

МДА, мкМ/л	Каталаза, мМ Н2О2 /лмин	СОД, ед.акт./мг Hb	ГПО, мМ восст. глут./лмин	ГР, мкМ окисл. глут./лмин
1 группа (контроль)
1,65±0,16	38,4±2,34	0,76±0,034	40,6±3,55	219,2±1,51
2 группа (иммобилизация)
2,38±0,27*	46,7±2,45*	1,51±0,167*	46,1±3,17*	254,1±4,38*
3 группа (иммобилизация + ФБ-26, 20 мг/кг)
1,97±0,24*^	46,6±4,14*	1,47±0,145*	43,6±2,56	229,7±3,78
4 группа (иммобилизация + ФБ-26, 100 мг/кг)
1,60±0,17^	40,3±3,35^	1,06±0,081*^Ў	39,6±2,04*^	200,1±3,62*^

Примечание: *- P_1-2,3,4 < 0,05; ^{^} - P_2-3,4,<0,05; ^Ў - P _3-4 <0,05

Введение ФБ-26 в дозе 20 мг/кг не вызывало статистически достоверных изменений показателей, характеризующих активности СОД и каталазы. Повышение дозы ФБ-26 до 100 мг/кг приводило к снижению активности данных энзимов на 29,8 и 13,7%, соответственно, по сравнению с показателями у животных 2-ой группы

Можно было бы отнести установленные изменения к негативным, однако исследования, проведенные по изучению интенсивности образования супероксиданиона в печени подопытных животных, показали, что применение ФБ-26 в дозе 20 мг/кг ограничивало спонтанную продукцию супероксиданиона на 52,6%, а НАДН- и НАДФН-зависимую - на 64,6% и 62,5%, соответственно. Увеличение дозы ФБ-26 усилило его эффективность. Спонтанная продукция О₂ снижалась до 18,6%, а НАДФН-стимулированная до 19,6% от показателей, характеризующих данные процессы у иммобилизированных животных, которым вводили только физраствор. Это является доказательством достаточно выраженных антирадикальных свойств ФБ-26.

Установлено также, что профилактическое применение ФБ-26 до иммобилизации активирует систему оксида азота (табл. 17).

Таблица 17.Влияние ФБ-26 на состояние NO-ергической стресс-лимитирующей системы у крыс при эмоционально-болевом стрессе

Группы животных	NOx, мкМ/л	RSNO, нМ/л
1. Интактные	44,6±3,73	1572,0±58,04
2. Контроль (иммобилизация)	93,5±8,37*	2240,0±73,8*
3. Иммобилизация + 20 мг/кг ФБ-26	160,2±5,45*^	2312,5±68,8*
4. Иммобилизация + 100 мг/кг ФБ-26	186,6±6,86*^	2450,0±125,8*

Примечание: *- P_1-2,3,4 < 0,05; ^{^} - P_2-3,4,<0,05

Установлено, что в дозах 20 мг/кг и 100 мг/кг применение ФБ-26 статистически достоверно повышает содержание стабильных метаболитов оксида азота в 1,7 и 2 раза, соответственно, по сравнению с их концентрацией в плазме крови животных 2-ой группы. При этом достоверных различий в содержании S-нитрозотиолов у крыс 2-ой, 3-ей и 4-ой групп не установлено, что с одной стороны свидетельствует о повышении концентрации NO за счет нитратной группировки изучаемого соединения, с другой - о сохранении пула нитрозотиолов, способных потенцировать эффекты оксида азота.

Таким образом, с учетом основных критериев оценки острой стресс-реакции (изменение общей массы тела, массы надпочечников, тимуса и селезенки, интенсивность язвообразования), установлено, что соединение ФБ-26 обладает выраженными стресс-протективными, антирадикальными и антиоксидантными свойствами. Его применение препятствует избыточной активации ПОЛ в ответ на стресс-воздействие, снижает негативные изменения в ферментативном звене антиоксидантной системы организма и активирует NO-ергическую стресс-лимитирующую систему оксида азота.

3.7.6 Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном

Установлено, что применение ФБ-26 оказывает достаточно выраженное гепатопротекторное действие, о чем свидетельствует снижение активности маркерных ферментов цитолиза клеток печени - аспартат- (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови. Наиболее эффективным было профилактическое применение ФБ-26 за 12 часов до первой инъекции тетрахлорметана, которое снижало активность АлАТ и АсАТ в 2,2 и 2,1 раза, соответственно, по сравнению с их активностью у животных с токсическим гепатитом, вызванным введением гепатотоксина. У животных, которым соединение вводили за 1 час до второй инъекции тетрахлорметана, динамика активности маркерных ферментов цитолиза была аналогичной, но менее выраженной.

Применение ФБ-26 (3-я и 4-я группы) при токсическом гепатите снижало образование супероксиданиона в печени (табл. 18).

Максимальное снижение интенсивности образования супероксид-аниона было характерно для животных 4-ой группы: спонтанная генерация О₂ уменьшалась на 27,7%, НАДН-стимулированная - на 37,1%, НАДФН-стимулированная - на 18,7%, по сравнению с животными, которым вводили только тетрахлорметан.

Ограничивающее влияние ФБ-26, оказываемое на интенсивность образования активных форм кислорода, по всей вероятности, и обусловило его корригирующее действие на интенсивность накопления в крови начальных и вторичных продуктов пероксидного окисления липидов.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что для ограничения процессов ПОЛ при токсическом повреждении печени более предпочтительно применение ФБ-26 за 1 час до повторной инъекции гепатотоксина (4-я группа), снижавшее уровень диеновых конъюгатов на 33,6%, кетодиенов - на 36,0% и малонового диальдегида на 37,2%, по сравнению с показателями у животных с CCl₄-интоксикацией.

Таблица 18. Влияние применения ФБ-26 на продукцию О₂ в печени крыс при токсическом повреждении печени

Группы животных	Продукция O2, нмоль/гсек
	Спонтанная	Стимулированная
		НАДН	НАДФН
1. Интактные	0,500,021	6,50,08	7,90,06
Токсическое повреждение печени
2. Контроль	0,830,024*	15,10,51*	22,50,10*
3. 100 мг/кг ФБ-26 за 12 часов	0,670,040*^	10,80,28*^	17,10,41*^
4. 100 мг/кг ФБ-26 за 1 час	0,600,032*^	9,50,52*^	18,30,72*^

Примечание: *-P_1-2,3,4 < 0,05; ^{^} - P_2-3,4 <0,05

Изучение состояния ферментативного звена АОС показало, что независимо от схемы введения ФБ-26, его применение повышало активность каталазы на 13,5-17,9%, и СОД - на 15,2-19,7 и практически не влияло на состояние глутатионового звена АОС в крови животных с токсическим повреждением печени. Следовательно, это соединение не только ограничивает пероксидацию липидов при токсическом повреждении печени, но и способствует сохранению эффективного контроля этих процессов со стороны антиоксидантной системы, предотвращая протекание более глубоких стадий свободнорадикального окисления.

Введение тетрахлорметана вызывало значительное увеличение продукции NO, о чем свидетельствовало более чем 3-кратное повышение содержания суммы NO₂^Ї+NO₃^Ї в плазме крови. Использование ФБ-26 при токсическом повреждении печени стимулировало дальнейшее накопление NO в биофазе.

Так, концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота возрастала в плазме крови животных 3-ей группы на 47,3%, 4-ой группы - на 68,8% (рис. 15). Максимальный уровень S-нитрозо-тиолов был зафиксирован у животных, получавших соединение за 12 часов до инъекции токсина, - их концентрация составила 3940 нМ/мл, хотя статистически достоверных различий между данными показателями, характеризующими накопление RSNO для животных 2-ой и 3-ей группы, отмечено не было.

Таким образом, проведенные исследования показали наличие гепатопротекторных свойств у ФБ-26. Механизм коррекции цитолитического синдрома при токсическом повреждении печени, по-видимому, обусловлен рядом факторов: во-первых, применение ФБ-26 достаточно эффективно снижает субклеточную продукцию супероксидного радикала, а во-вторых - стимулирует повышение концентрации NO, вовлеченного в ограничение повреждающих эффектов, как на центральном, так и на периферическом уровне.

3.7.7 Влияние соединения ФБ-26 на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота при ожоговой травме

Применение ФБ-26 способствовало снижению интенсивности свободнорадикального окисления липидов у животных при ожоговой травме. Наиболее значительные изменения установлены в содержании в крови диеновых конъюгатов и кетодиенов, концентрации которых составили 58,8% и 53,4%, соответственно, от таковых у животных группы отрицательного контроля. При этом концентрация более позднего продукта пероксидации - МДА была ниже на 34,2 %.

Ограничивающее действие ФБ-26 на образование первичных и вторичных продуктов ПОЛ сказалось и на степени индукции активности антиоксидантных ферментов в крови крыс при ожоге.

Применение ФБ-26 нормализовало состояние ферментативного звена антиоксидантной системы в крови животных с ожоговой травмой (рис. 16). Так, активность СОД была ниже в 1,6 раза, каталазы и глутатионпероксидазы - на 26,4% и 39,3%, соответственно. Активность глутатионредуктазы статистически не отличалась от таковой у интактных животных.

Введение животным до нанесения ожога ФБ-26 практически предотвращает спонтанное усиление генерации О₂ и его продукцию в ЭТЦ митохондрий. Причем надо отметить отсутствие статистически достоверных различий между показателями спонтанной продукции О₂ в печени крыс, не подвергавшихся никаким воздействиям, и животных, которым при ожоговой травме применяли изучаемое соединение.

Указанные различия в характере спонтанного образования О₂ при ожоге вполне согласуются с приведенными выше данными об изменениях в интенсивности накопления продуктов ПОЛ в крови животных и активности антиоксидантных ферментов при нанесении ожоговой травмы на фоне применения ФБ-26.

Соединение ФБ-26 способствовало увеличению содержания стабильных метаболитов оксида азота на 33%, а нитрозотиолов - на 26%, по сравнению с показателями, характерными для животных с ожоговой раной и не подвергавшихся какой-либо обработке (рис. 17).

Важно отметить тот факт, что повышение содержания NOх на фоне использования ФБ-26 не сопровождалось истощением пула нитрозотиолов, а, следовательно, сохраняется динамическое равновесие S-нитрозотиолов и NO, что имеет большое значение для реализации физиологических функций последнего (Stamler J.S. et al., 1992).

Изменения в интенсивности процессов ПОЛ, суммарном содержании NOх и состоянии антиоксидантной системы у крыс при ожоговой травме, нанесенной при введении изучаемого соединения, обусловили и различную скорость заживления ожоговой раны у подопытных животных.

Интенсивность репаративных процессов у крыс, которым применяли ФБ-26, была значительно выше. Так, на 3-и сутки площадь раневой поверхности у этих животных составила 79,1%, тогда как у крыс группы отрицательного контроля 93,6%. Если в целом оценить эффективность использования данного соединения, можно констатировать тот факт, что его применение сокращает заживление раны на 5-7 суток.

Оценивая эффективность соединения ФБ-26 для поддержания про- и антиоксидантного равновесия в условиях ожоговой травмы, следует отметить, что его применение до нанесения ожога способствовало снижению интенсивности ПОЛ и сохранению эффективного контроля ферментативного звена АОЗ над течением окисления по свободнорадикальному типу.

Выводы

1. Процессы свободнорадикального окисления липидов и белков, функциональное состояние системы антиоксидантной защиты и системы оксида азота имеют важное значение в осуществлении защитно-приспособительных реакций организма животных в период постнатальной адаптации, при действии стресс-факторов различной природы, развитии патологических состояний различной этиологии.

2. Для новорожденных телят, поросят и ягнят в первые дни жизни характерно высокое содержание в плазме крови стабильных метаболитов оксида азота (NO₂^Ї+NO₃^Ї) превышающее уровень у взрослых особей соответственно в 13,9, 14,4 и 12,9 раза.

Высокая концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота в моче и концентрация метгемоглобина в крови у новорожденных телят в первые сутки жизни в пределах физиологической нормы, высокое содержание NOx в амниотической жидкости у коров являются доказательством его интенсивного эндогенного образования еще во внутриутробный период развития.

3. Ранний постнатальный период развития клинически здоровых телят сопровождается явлениями окислительного стресса, которые выражаются в смещении оксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону интенсификации свободнорадикального окисления липидов и белков, причем, в первую очередь окислительной модификации подвергаются белки.

Наибольшая степень окислительной модификации белков сыворотки крови установлена сразу (через 0,5-1 час) после рождения и превышает в 1,7 раза уровень у взрослых животных и составляет от 1,20 до 1,30 нмоль карбонильных групп/мг белка. При этом содержание МДА достигает своего максимума 2,350,140 мкМ/л только к концу первых суток жизни.

4. У новорожденных телят с более выраженными явлениями оксидативного стресса затруднен пассивный перенос в кишечнике колостральных иммуноглобулинов, а всосавшиеся иммуноглобулины подвергаются окислительной модификации, что нарушает их функцию в обеспечении противоинфекционной защиты.

5. Интенсивность всасывания колостральных иммуноглобулинов зависит от баланса в системе оксид азота - S-нитрозотиолы (RSNO). Существует высокая степень корреляции (r = + 0,864, P < 0,001) между суммарным содержанием стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке через 0,5-1,0 час после рождения (до выпойки молозива) и общих иммуноглобулинов в сыворотке крови у телят через сутки после рождения.

6. Развитие респираторной патологии у телят сопровождается интенсификацией свободнорадикального окисления липидов. Чем глубже поражение дыхательной системы, тем выше скорость СРО: при трахеобронхите содержания МДА в крови повышается на 34%, а бронхопневмонии - в 2,1 раза.

Состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят с субклиническим трахеобронхитом является метаболически более предпочтительным, поскольку сохраняется эффективный контроль со стороны АОС: активность СОД и каталазы у телят с субклиническим трахеобронхитом была выше на 27,7% и 14,1%, соответственно, от таковой у животных, больных бронхопневмонией. Снижение содержания S-нитрозотиолов в сыворотке крови при субклиническом трахеобронхите происходит в 1,8 раза, при бронхопневмонии - 2,4 раза, что свидетельствует о нарушении адекватного функционирования системы оксида азота.

7. При жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота в тканях печени и крови животных происходит усиление процессов пероксидного окисления липидов и снижение уровня эндогенных антиоксидантов: в тканях печени содержание МДА возрастает на 76,6%, а в крови - в 2,7 раза, концентрация витамина Е уменьшается на 34,6% и 25,4%, соответственно. Патология печени вызывает более чем 3-кратное повышение содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO₂^Ї+NO₃^Ї) в плазме крови, что свидетельствует о значительном увеличении продукции NO.

8. Функциональная недостаточность систем антиоксидантной защиты и генерации оксида азота у коров в конце стельности является предрасполагающим фактором развития послеродового эндометрита. Клиническое проявление острого послеродового эндометрита происходит на фоне повышенной интенсивности пероксидного окисления липидов, увеличения концентрации стабильных метаболитов оксида азота и несбалансированных изменений в системе антиоксидантной защиты. Повышение активности ГР на 10,6%, по сравнению с ростом активности ГПО в 1,7, свидетельствует о низком функциональном потенциале глутатионового звена системы АОЗ и о невозможности адекватного пополнения пула восстановленного глутатиона.

9. До отела интенсивность образования оксида азота и содержание S-нитрозотиолов у коров с субинволюцией матки существенно не отличается от таковой у животных с нормальным течением послеродового периода. Клиническое проявление субинволюции матки сопровождалось истощением пула оксида азота, о чем свидетельствует повышение интенсивности его образования примерно в 1,5 раза и снижение содержания S-нитрозотиолов. Данные нарушения и проявление избыточного релаксирующего действия самого оксида азота на миометрий являются одной из причин сбоя физиологического течения инволюционных процессов в матке.

10. У коров с послеродовой субинволюцией матки за 10-14 дней до отела происходит снижение функционального потенциала системы антиоксидантной защиты, которое выражается в снижении активности СОД на 22,2%, ГПО - на 39,8%, а ГР - на 38,2% по сравнению с животными, оставшимися здоровыми, что не позволяет поддерживать на относительно стабильном и контролируемом уровне стрессорную активацию процессов ПОЛ в раннем послеродовом периоде.

11. У коров с дисфункцией яичников снижена концентрация стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови на 61,1% и содержание S-нитрозотиолов - на 29,8% по сравнению со здоровыми животными. Более интенсивное течение процессов пероксидного окисления липидов у бесплодных животных не связано с недостаточностью ферментативного звена антиоксидантной системы, о чем свидетельствует высокий функциональный потенциал антиоксидантной системы у коров с дисфункцией яичников. У таких коров активность каталазы выше на 24,3%, СОД - на 31,9%, ГПО - на 27,7%, ГР - на 10,6%, по сравнению со здоровыми циклирующими животными.

12. Стимуляция продукции оксида азота, с одной стороны не оказывает влияние на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов, а с другой способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты. Введение животным ингибиторов NO-синтаз приводит к снижению продукции оксида азота более чем в 2 раза, но не вызывает существенных изменений в содержания S-нитрозотиолов в плазме крови по сравнению с интактными животными. Это позволяет считать, что существует определенный базовый уровень S-нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, который даже в условиях ингибирования его генерации используется в незначительной степени.

13. Активация синтеза оксида азота L-аргинином повышает устойчивость животных к действию стресс-факторов при иммобилизационном стрессе, токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме. Эффект применения L-аргинина в отношение проявления оксидативного стресса обусловлен снижением интенсивности процессов пероксидации липидов и белков вследствие уменьшения образования супероксиданиона в митохондриальной электронтранспорной цепи.

Ингибирование синтеза оксида азота, напротив, смещает прооксидантное-антиоксидантное равновесие в сторону интенсификации свободнорадикального окисления биологических субстратов, из чего следует, что состояние системы генерации оксида азота может являться одним из важных механизмов поддержания оптимального баланса между про- и антиоксидантными процессами.

14. Применение животным перед стрессовой ситуацией различной этиологии и с различными механизмами патогенеза соединения ФБ-26, обладающего свойствами антиоксиданта и донора оксида азота, приводит к такому изменению состояния NO-ергической и антиоксидантной стресс-лимитирующих систем и интенсивности течения процессов свободнорадикального окисления, которое обеспечивает более оптимальное протекание адаптационных перестроек метаболизма и репаративных процессов при осуществлении стресс-реакции и снижение её отрицательных последствий для организма животных.

Практические предложения

1. Для определения интенсивности образования оксида азота в организме животных использовать Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови (М.: РАСХН, 2007).

2. Для оценки интенсивности генерации супероксиданиона в тканях использовать Методические рекомендации определения субклеточной локализации генерации супероксиданиона в тканях (М.: РАСХН, 2007).

3. Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов и состояния системы антиоксидантной защиты с учётом индивидуальных, видовых, физиологических, возрастных особенностей, клинического состояния животных использовать Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (М.: РАСХН, 2007).

4. В качестве теста для оценки интенсивности всасывания колостральных иммуноглобулинов использовать определение активности -глутамил-трансферазы в сыворотке крови у новорожденных телят в 1-2 сутки после рождения. Активность -глутамилтрансферазы в сыворотке крови новорожденных телят менее 3 мккат/л свидетельствует о недостаточности колострального иммунитета и риске развития неонатальных болезней инфекционной этиологии.

5. В основу фармакологического изучения новых лекарственных веществ, повышающих резистентность и продуктивное здоровье животных, включить оценку их действия на антиоксидантную систему и систему оксида азота.

6. Научные результаты работы использовать в учебном процессе студентов по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных и при проведении научно-исследовательских работ аспирантами и научными работниками в НИУ и ВУЗах биологического и зооветеринарного профиля.