Продукція цитокінів мононуклеарами периферичної крові хворих з гліомами головного мозку in vitro за умов впливу супернатанту прогеніторних нейроклітин щура

Размещено на http://www.allbest.ru/

Продукція цитокінів мононуклеарами периферичної крові хворих з гліомами головного мозку in vitro за умов впливу супернатанту прогеніторних нейроклітин щура

Л.Д. Любич

ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України», Київ

Резюме

За допомогою імуноферментного аналізу супернатантів мононуклеарів периферичної крові (МНПК) встановлено, що за умов впливу супернатанту прогеніторних нейроклітин (СНК) щура 12-16 доби гестації МНПК осіб групи порівняння зменшували продукцію TNF-a та збільшували синтез IL-1 (З, IL-10. За умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку зменшувався вміст TNF-a та IL-10. У хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності виявлено тенденцію до підвищення вмісту IFN-y у супернатантах МНПК після інкубації з СНК; у хворих з гліобластомами (4 ступінь злоякісності) спостерігалась тенденція до зниження продукції IFN-y МНПК.

Ключові слова: цитокіни, мононуклеари периферичної крові, гліоми головного мозку, супернатант прогеніторних нейроклітин.

Резюме

Продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови больных с глиомами головного мозга in vitro под влиянием супернатанта прогениторных нейроклеток крысы

Л.Д. Любич

ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины», Киев

С помощью иммуноферментного анализа супер¬натантов мононуклеаров периферической крови (МНПК) установлено, что под влиянием супернатанта прогениторных нейроклеток (СНК) крысы 12-16 суток гестации МНПК лиц группы сравнения снижали продукцию TNF-a и повышали синтез IL-1 /3, IL-10. Под влиянием СНК крысы в супернатантах МНПК больных с глиомами головного мозга снижалось содержание TNF-a и IL-10. У больных с глиомами 2 и 3 степени злокачественности выявлено тенденцию к повышению содержания IFN-y в супернатантах МНПК после инкубации с СНК; у больных с глиобластомами (4 степень злокачественности) наблю¬далась тенденция к снижению продукции IFN-y МНПК.

Ключевые слова: цитокины, мононуклеары периферической кро¬ви, глиомы головного мозга, супернатант прогениторных нейроклеток.

Summary

CYTOKINES' PRODUCTION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS OF PATIENTS WITH BRAIN GLIOMA IN VITRO UNDER THE INFLUENCE OF RAT PROGENITOR NEURAL CELLS SUPERNATANT

L.D. Lyubich

SI «Acad.A.P. Romodanov Institute of Neurosurgery NAMS of Ukraine», Kyiv

It is established by ELISA of peripheral blood mono¬nuclear cells (PBMC) supernatants that under the influence of rat progenitor neural cells supernatant (RPNS) gestation day 12-16 (Е12-16) PBMC of healthy individuals decreased the production of TNF-a and increased the synthesis of IL-1 ft, IL-10. Under the influence of RPNS in PBMC supernatants of patients with brain glioma the levels of TNF-a and IL-10 were considerably decreased. After the incubation with RPNS the level of IFN-yin PBMC supernatants of patients with brain glioma grade 2-3 demonstrated the tendency to increase; the PBMC of patients with glioblastoma (grade 4) revealed the tendency to decreased IFN-y production.

Key words: cytokines, peripheral blood mononuclear cells, brain glioma, progenitor neural cells supernatant.

Актуальною проблемою використання нейрогенних стовбурових та прогеніторних клітин для розробки новітніх технологій терапії уражень ЦНС залишається питання щодо їх протипухлинного та імуномодулюючого потенціалу. Одним із можливих механізмів реалізації протипухлинних властивостей нейрогенних стовбурових клітин, поряд з іншими, є індукція ефективних імунних реакцій проти внутрішньомозкових пухлин. Відомо, що при гліомах мозку виявляються зміни у всіх ланках імунітету [1]: відносна та абсолютна лімфопенія, знижений вміст CD4+, CD8+, CD16+ лімфоцитів, HLA-DR-клітин, гальмування проліферативної здатності лімфоцитів, зниження секреції ефекторних цитокінів. Поряд із зниженням кількості та функції CD4+,CD8+ клітин, підвищується кількість Т-регуляторних CD4+ CD25+FoxP3+ клітин: порівняно із здоровими донорами, у CD4+ та CD8+ T-клітин хворих з гліобластомами пригнічені гени, залучені у зв'язування T-клітинного рецептора, активацію та внутрішньоклітинну передачу сигналу, тоді як у Т-регуляторних клітинах цих хворих підвищується рівень транскриптів імуноінгібуючих медіаторів [2].

Мета роботи - дослідити вплив супернатанту прогеніторних нейроклітин щура (СНК) на продукцію про- і антизапальних цитокінів мононуклеарами периферичної крові (МНПК) хворих з гліомами головного мозку.

Матеріали і методи дослідження

хворий головний мозок нейроклітина

Матеріалом слугували МНПК хворих з гліомами головного мозку (n=25) та МНПК осіб групи порівняння (умовно здорові особи без онкологічного захворювання (n=16). При гістологічній верифікації діагнозу у хворих діагностовано 5 гліом 2 ступеня злоякісності, 9 гліом 3 ступеня злоякісності, 11 гліобластом (4 ступінь злоякісності).

МНПК виділяли центрифугуванням у градієнті фікол- верографіну (d=1,077) при 1500 об/хв протягом 30 хв, потім двічі відмивали забуференим фізрозчином рН 7,2-7,4. Життєздатність клітин визначали за проникністю плазматичної мембрани для 0,2% трипанового синього (Merch, Німеччина) [3].

Отримання супернатанту прогеніторних нейроклітин щура (СНК). Для отримання СНК використовували суспензію, виготовлену з тканини мозку щура на 12-16-у добу гестації (Е12-16). Нативну тканину мозку у фізіологічному розчині звільняли від оболонок, переносили в середовище ПМЕМ («Sigma», Німеччина) і ресуспендували за допомогою шприца з товстою голкою. Життєздатність клітин у суспензії визначали у стандартному цитотоксичному тесті з 0,2% трипановим синім («Merch», Німеччина) [3]. До отриманої клітинної суспензії (з концентрацією клітин 6,0х106/мл) додавали конканавалін А (0,10 мг/мл) та інкубували 2 год в СО2-інкубаторі при температурі (37,0+0,5)оС, постійній вологості 95% та 5% СО2. Після інкубації клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відмивали у середовищі DMEM, до осаду клітин додавали свіже середовище DMEM, ресуспендували та інкубували в тих же умовах протягом 24 год. Після інкубації клітини повторно осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відбирали супернатант, визначали у ньому концентрацію білка, стандартизували до концентрації 0,1 мг/мл, аліквотизували і зберігали при (-20+0,5)оС.

Препарат СНК у кількості 0,10 мг/мл додавали до суспензії виділених МНПК та інкубували 2 год в СО2-інкубаторі при температурі (37,0+0,5)оС, постійній вологості 95% та 5% СО2. Після інкубації клітини осаджували центрифугуванням протягом 5 хв при 1500 об/хв, відмивали у середовищі DMEM, до осаду клітин додавали свіже середовище DMEM, ресуспендували та інкубували в тих же умовах протягом 24 год. Контролем слугували паралельні проби, які інкубували в тих же умовах, але без додавання СНК. Після інкубації клітини дослідних і контрольних суспензій осаджували центрифугуванням протягом 10 хв при 1500 об/хв, відбирали супернатанти та визначали у них рівень цитокінів.

Вміст цитокінів IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-1p, IL-4, IL-10 у супернатантах МНПК до і після інкубації з СНК визначали імуноферментним методом за допомогою наборів ООО «Протеїновий контур» (Санкт-Петербург, Росія).

Статистичну обробку даних проводили із використанням пакету статистичних програм «Statistica 5,0», достовірність різниці оцінювали із застосуванням t-критерію Стьюдента.

Результати та обговорення

Супернатанти МНПК осіб групи порівняння (умовно здорових осіб без онкологічного захворювання) містили досліджувані цитокіни у кількостях, що не перевищували фізіологічну норму, за виключенням TNF-a, середній вміст якого перевищував нормальний показник (0-2,5 пг/мл), вказуючи, очевидно, на наявність запального процесу, ймовірно вірусної етіології, у осіб групи порівняння (рис. 1).

За умов впливу СНК щура вміст TNF-a в супернатантах МНПК осіб групи порівняння достовірно зменшувався (р<0,05) (рис. 1). Крім того, під впливом препарату СНК в супернатантах МНПК осіб групи порівняння достовірно зростав вміст IL-1p (р<0,0028) та IL-10 (р<0,05). Значущого впливу СНК щура на продукцію IFN-a, IFN-y та IL-4 не виявлено (рис. 1).

Таким чином, можна припустити, що препарат СНК щура запускає сигнальні каскади у МНПК осіб групи порівняння, спрямовані на обмеження запального процесу, зменшуючи продукцію TNF-a, збільшуючи синтез IL-ip та активізуючи імуносупресивну функцію (збільшуючи продукцію IL-10).

Супернатанти МНПК хворих з гліомами головного мозку подібно до супернатантів МНПК осіб групи порівняння містили підвищену кількість TNF-a, порівняно з фізіологічною нормою, але достовірно нижчу за середній вміст TNF-a у супернатантах групи порівняння (р<0,05) (рис. 2). Це узгоджується з відомими даними [1], згідно з якими у хворих на гліоми головного мозку в сироватці крові спостерігається збільшений вміст прозапального цитокіна TNF-a, що відображає розвиток запальних реакцій у вигляді перифокального набряку у відповідь на ріст пухлини. Інші досліджувані цитокіни виявлені у кількостях, що не перевищували фізіологічну норму.

Рис. 1. Вміст цитокінів у супернатантах МНПК групи порівняння за умов впливу СНК щура, пг/мл

За умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку достовірно зменшувався вміст TNF-a (р<0,008) (рис. 2), що узгоджується з даними [1], за якими у хворих на гліоми порушується продукція TNF-a у відповідь на стимуляцію мітогеном (ліпополісахаридом).

В той же час, за умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку достовірно зменшувався вміст IL- 10 (р<0,05) (рис. 2). IL-10 відноситься до протизапальних, пропухлинних і супресивних цитокінів, оскільки відома можливість його імуносупресивного впливу на формування локального імунітету (через продукцію його CD4+CD25+T-лімфоцитами, що інфільтрують пухлину, та безпосередньо клітинами пухлини), а також стимулюючий вплив IL-10 на ріст пухлини [4]. Зменшення продукції IL-10, на наш погляд, можна розцінити як позитивний вплив СНК, спрямований на обмеження імуноінгібуючої функції імунокомпетентних регуляторних клітин.

Значущого впливу СНК щура на продукцію IFN-a та IL-4 не виявлено (рис. 2).

Рис. 2. Вміст цитокінів у супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку за умов впливу СНК щура, пг/мл

Вплив СНК на продукцію IFN-y МНПК хворих з гліомами головного мозку виявився неоднозначним і залежав від ступеня злоякісності пухлини. У хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності виявлено тенденцію до підвищення вмісту IFN-y у супернатантах МНПК після інкубації з СНК, тоді як у хворих з гліобластомами (4 ступінь злоякісності), навпаки, спостерігалась тенденція до зниження продукції IFN-y МНПК (рис. 3). Згідно з даними [1], у хворих на гліоми порушується стимульована ФГА продукція IFN-y клітинами периферичної крові і виявлено прямий зв'язок між ступенем злоякісності гліальної пухлини та порушенням стимульованої мітогеном цитокінсинтезуючої здатності імунокомпетентних клітин периферичної крові: при гліомах 3 та 4 ступеня анаплазії порівняно із пухлинами 1-2 ступеня злоякісності вірогідно пригнічується продукція IFN-y активованими імунокомпетентними клітинами крові, яка не відновлюється після видалення пухлини. Можна припустити, що виявлена СНК-індукована стимуляція продукції IFN-y МНПК хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності обумовлена переключенням імунокомпетентних клітин на Thl-відповідь; тоді як у МНПК хворих з гліобластомами цього не відбувається через пригніченння у лімфоцитах генів, залучених у активацію та внутрішньоклітинну передачу сигналу [2]. Збільшення продукції IFN-y МНПК хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності, на наш погляд, можна розцінити як позитивний вплив СНК, оскільки IFN-y підвищує експресію антигенів МНС І класу та ICAM-1 на клітинах гліом, в результаті чого клітини пухлини стають чутливішими до лізису цитотоксичними лімфоцитами.

Рис. 3. Вміст IFN-y у супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку за умов впливу СНК щура, пг/мл

Таким чином, гуморальні фактори нейроклітин фетального мозку щура впливають на функційні показники імунокомпетентних клітин, демонструючи здатність змінювати експресію цитокінів на протеїновому рівні (TNF-a, IL-1p, IL-10). На нашу думку, це зумовлено здатністю фетальних нейроклітин до продукції біологічно активних молекул. Зокрема, відомо, що мультипотентні прогеніторні нейроклітини ссавців (людини, щурів, мишей) експресують як прозапальні, так і супресорні цитокіни (IL-1a, IL-ip, IL-6, TGF-pi, TGF-P2, TNF-a) [5,6]. Крім того, у активну діючу фракцію СНК можуть входити також інші молекули з протипухлинною цитотоксичною дією, зокрема, фактор інгібування лейкемії (LIF) [7], а механізм дії секретованих прогеніторними нейроклітинами молекул може залучати регуляторний LIF/JAK/STAT сигнальний шлях [7] та інші, оскільки відомо, що між нейрогенними стовбуровими клітинами та нейроімунною сіткою існує двонаправлене перехресне «спілкування» (обмін сигналами та молекулами), яке контролює самовідновлення та диференціацію нейрогенних стовбурових клітин [8]. Багатогранність біологічних ефектів цитокінів та їх ключова роль у підтримці імунологічного гомеостазу дає змогу зрозуміти, чому порушення балансу у системі цитокінів є важливим механізмом розвитку багатьох патологічних процесів, у тому числі пухлинних.

Можливість за допомогою впливу СНК знижувати рівень продукції МНПК хворих з гліомами IL-10 - цитокіна, що бере участь в одному з механізмів, за допомогою якого пухлина пригнічує дію імунної системи, на наш погляд, можна розцінювати як таку, що може знайти своє подальше практичне застосування.

Висновки

1. За умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК осіб групи порівняння достовірно зменшувався вміст TNF-a та достовірно зростав вміст IL-1p, IL-10.

2. За умов впливу СНК щура в супернатантах МНПК хворих з гліомами головного мозку достовірно зменшувався вміст TNF-a та IL-10.

3. У хворих з гліомами 2 і 3 ступеня злоякісності виявлено тенденцію до підвищення вмісту IFN-y у супернатантах МНПК після інкубації з СНК; у хворих з гліобластомами (4 ступінь злоякісності) спостерігалась тенденція до зниження продукції IFN-y МНПК.

Література

1. Лисяный Н.И. Иммунология и иммунотерапия злокачествен¬ных глиом головного мозга / Н.И. Лисяный. - К.: «Интерсервис», 2011.

- 239 с.

2. Profiling of CD4+, CD8+, and CD4+CD25+CD45RO+FoxP3+ T cells in patients with malignant glioma reveals differential expression of the immunologic transcriptome compared with T cells from healthy volunteers /

C. A. Learn, P.E. Fecci, R.J. Schmittling [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2006. -12(24). - P. 7306-7315.

3. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы / В.П. Божкова, Л.А. Брежестовский, В.М. Буравлев [и др.]. - М.: Наука, 1988. - 318 с.

4. Гранов А.М. Канцерогенез и иммунобиология опухоли. Фундаментальные и клинические аспекты / А.М. Гранов,

O. Е. Молчанинов // Вопросы онкологии. - 2008. -Т. 54, № 4. - С. 401-409.

5. Expression of cytokines by multipotent neural progenitor cells /

H. J. Klassen, K.L. Imfeld, I.I. Kirov [et al.] // Cytokine. -2003. -22(3-4). -

P. 101-106.

6. Instructive cross-talk between neural progenitor cells and gliomas /

K. Staflin, M. Lindvall, T. Zuchner, C. Lundberg // J. Neurosci. Res. - 2007.

- Vol. 85(10). -P. 2147-2159.

7. Neural stem cells secrete factors that promote auditory cell proliferation via a leukemia inhibitory factor signaling pathway / H.C. Chen, H.I. Ma, H.K. Sytwu [et al.] // J. Neurosci Res. - 2010. - 88(15). - P. 3308¬3318.

8. Molina-Holgado E. Mending the broken brain: neuro immune interactions in neurogenesis / E.Molina-Holgado, F.Molina-Holgado //

J.Neurochem. - 2010. - 114(5). - P.1277-1290.

Размещено на Allbest.ru