Эффективность гетерологического деминерализованного костного матрикса для замещения критических костных дефектов свода черепа крыс

Размещено на http://www.allbest.ru/

4

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОГО ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КРИТИЧЕСКИХ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ СВОДА ЧЕРЕПА КРЫС

Веремеев А.В., Болгарин Р.Н., Нестеренко В.Г., Андреев-Андриевский А.А.

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, Россия

Общество с ограниченной ответственностью «Матрифлекс», г. Москва, Россия

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва, Россия

Резюме

Цель. Оценить эффективность гетерологического деминерализованного костного матрикса (ДКМ) для замещения костных дефектов в эксперименте на модели критического дефекта костей свода черепа крыс.

Материалы и методы. Для эксперимента использовали самцов крыс (n = 48) линии Sprague-Dawley возрастом от 4,5 до 6 месяцев. В ходе оперативного вмешательства создавали критический дефект костей свода черепа и замещали его костным аутотрансплантатом, гетерологическим ДКМ или препаратом-компаратором (Geistlich Bio-Oss®) либо оставляли незаполненным (отрицательный контроль). Через 4 или 12 недель выводили крыс из эксперимента и проводили исследование областей дефекта при помощи микроскопической оценки срезов тканей, окрашенных гематоксилином и эозином (доля минерализованной ткани от просвета дефекта) и микрокомпьютерной томографии (объем новообразованной костной ткани, минеральная плотность новообразованной ткани, толщина новообразованных костных элементов и распределение их диаметра).

Результаты. Замещение дефектной области костным аутотрансплантатом, как и ожидалось, показало наилучшие результаты. При применении гетерологического ДКМ и препарата-компаратора наблюдалась выраженное заполнение критического дефекта, при этом статистически значимых различий в показателях репарации костной ткани между разработанным оригинальным прототипом и медицинским изделием сравнения выявлено не было. Микрокомпьютерно-томографический и гистологический методы исследования продемонстрировали конкордантные результаты (эффекты имели сопоставимую степень выраженности).

Заключение. Гетерологический ДКМ эффективен для замещения критических костных дефектов свода черепа крыс.

Ключевые слова: деминерализованный костный матрикс, ксенотрансплантаты, аутотрансплантаты, остеогенез, критический дефект свода черепа.

Сведения об авторах

Веремеев Алексей Владимирович, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Матрифлекс» (125252, Россия, г. Москва, ул. Авиаконструктора Микояна, д. 12, корп. А, п. 1, эт. 2, оф. 1).

Болгарин Роман Николаевич, директор по развитию ООО «Матрифлекс» (125252, Россия, г. Москва, ул. Авиаконструктора Микояна, д. 12, корп. А, п. 1, эт. 2, оф. 1).

Нестеренко Владимир Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунологии ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва, Россия (123098, Россия, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

Андреев-Андриевский Александр Александрович, кандидат биологических наук, руководитель центра доклинических исследований ООО «НИИ митоинженерии МГУ» ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова» (119330, Россия, г. Москва, ул. Ленинские горы, д. 73А).

микроскопическая оценка ткань череп крыса

Abstract

ORIGINAL RESEARCH HETEROLOGOUS DEMINERALISED BONE MATRIX IS EFFICIENT FOR THE REPAIR OF CRITICAL-SIZED RAT CALVARIAL DEFECTS

Alexey V. Veremeev, Roman N. Bolgarin, Vladimir G. Nesterenko, Alexander A. Andreev-Andrievskiy

Matriflex LLC, Moscow, Russian Federation

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation

Aim. To evaluate the efficacy of heterologous demineralised bone matrix (DBM) for the replacement of bone defects using a critical-sized rat calvarial defect model.

Materials and Methods. For the experiments, we used 48 Sprague-Dawley rats (4.5 to 6 months of age). Critical-sized (8 mm diameter) calvarial defect was filled by the bone autograft, heterologous DBM, or comparator product (Geistlich Bio- Oss®) or remained unfilled (negative control). Upon 4 or 12 weeks, rats were euthanised with the subsequent investigation of the defect and adjacent tissues by means of hematoxylin and eosin staining (mineralized tissue area to the defect area ratio) and microcomputed tomography (volume, thickness, and mineral density of the repaired tissue).

Results. In our experimental setting, bone autograft was the most efficient in bone repair. Heterologous DBM and comparator product were equally efficient in filling the defect and did not show any statistically significant differences regarding any of the parameters. Microcomputed tomography and routine histological examination demonstrated concordant results.

Conclusion. Heterologous DBM is efficient for the repair of critical-sized rat calvarial defects.

Keywords: demineralised bone matrix, heterologous implants, autograft, bone repair, critical-sized rat calvarial defect,

Authors

Dr. Alexey V. Veremeev, MD, PhD, Chief Executive Officer, Matriflex LLC (125252, Aviakonstruktora Mikoyana Street, 12, A, 2nd Floor, Office 1, Moscow, Russian Federation).

Mr. Roman N. Bolgarin, Development Director, Matriflex LLC (125252, Aviakonstruktora Mikoyana Street, 12, A, 2nd Floor, Office 1, Moscow, Russian Federation).

Prof. Vladimir G. Nesterenko, MD, DSc, Professor, Head of the Immunology Department, Gamaleya National Research Epidemiology and Microbiology Centre (123098, Gamaleya Street, 18, Moscow, Russian Federation).

Dr. Alexander A. Andreev-Andrievskiy, PhD, Head of the Center for Preclinical Trials, Mitoengineering Research Institute LLC, Moscow State University (119330, Leninskie Gory Street, 73A, Moscow, Russian Federation).

Введение

Одним из приоритетных направлений современной травматологии и ортопедии является сокращение сроков реабилитации и улучшение отдаленных результатов, в том числе качества жизни после операций на элементах опорно-двигательной системы [1]. Проблема инвалидизации населения трудоспособного возраста по причине патологий данного рода и травм не теряет актуальности, несмотря на современные методы диагностики и лечения [25]. Для решения этой проблемы активно изучается возможность форсирования естественной регенерации костной ткани вместо использования металлических и керамических имплантатов [6-8].

Использование костных аутотрансплантатов при оперативном лечении дефектов костной ткани является эталоном в связи с абсолютной биосовместимостью для реципиента [9-11].

Однако применение аутотрансплантатов ограничено высокой травматичностью при их заборе, приводящей к снижению качества жизни пациента в послеоперационном периоде (главным образом вследствие развития хронической инфекции и перманентных болей в области изъятия аутокости) [10, 11]. Аллотрансплантаты, получаемые из донорского материала, обладают значительно меньшим остеокондуктив- ным и остеоиндуктивным потенциалом, а также несут высокий риск инфекционных и аутоиммунных осложнений [10, 11]. Современные научно-технические разработки в данной области ориентированы на создание аналогов костных материалов, содержащих прогениторные клеточные популяции и биоактивные факторы направленной дифференцировки, что способствует управляемой регенерации ткани [12-16].

Внеклеточный матрикс кости представляет собой нативный биоматериал, на 85-90% состоящий из коллагена I типа, а также содержащий другие типичные для внеклеточного матрикса в целом белки (коллаген III, V, IX, XII, XIV, XIX, XX и XXI типа, фибронектин, альбумин, фетуин-А, различные факторы роста) [17, 18]. Кроме того, при частичной деминерализации костный матрикс также содержит гидроксиапатит (Са10(РО4)6(ОН)2), вместе с коллагеном I типа определяющий структурные и функциональные характеристики костной ткани [17, 18]. Процесс выделения костного матрикса из ксеногенной костной ткани обладает высокой технологичностью [19, 20]; кроме того, за счет своей волокнисто-пористой структуры выделяемый кристаллический костный минерал является проницаемым для лекарственных средств, после имплантации успешно заселяется клетками и обладает высокой биосовместимостью, что делает его подходящей системой доставки лекарственных средств для таргетной терапии [21-23]. Еще одним важным достоинством костного матрикса при замещении костной ткани является его низкая иммуногенность, обусловленная естественной природой гидроксиапатита и высокой консервативностью белков экстрацел- люлярного матрикса в процессе эволюции [24]. Костный матрикс используется как в сегментарном виде для получения каркасов (матриксов, скаффолдов) [25], так и в виде микроразмерных или наноразмерных гранул для самостоятельного замещения костной ткани [26, 27] либо в составе композитных материалов как вспомогательный материал с целью увеличения остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств каркасов для замещения костных дефектов [28, 29].

Из всех источников предпочтительным является гетерологический (ксеногенный) костный матрикс, сохраняющий свою структуру и аморфную форму при различных способах обработки, в том числе включающих в себя методы глубокой очистки, децеллюляризации и деминерализации [28,29]. Поэтому гетерологический деминерализованный костный матрикс (ДКМ) не изменяет свои первоначальную структуру и свойства, что обеспечивает сравнимую с нативной тканью прочность, остеокондуктивность и остекоиндуктивность [25-27].

Ранее нашей группой был разработан протокол для получения гетерологического ДКМ с целью замещения дефектов костной ткани и последующего клинического внедрения.

Цель исследования

Оценка эффективности гетерологического ДКМ в эксперименте на модели критического дефекта костей свода черепа крыс.

Объекты исследования

Источником гранулированного нативного не- реконструированного ДКМ (диаметр 0,25-1 мм) были бедренные кости быка. ДКМ получали при помощи последовательных стадий очистки костной ткани: механическая очистка, дезинфекция, децеллюляризация, удаление липидов, удаление нуклеиновых кислот, деминерализация, фракционирование и газовая стерилизация. В качестве препарата-компаратора использовалось медицинское изделие Geistlich Bio-Oss® (Geistlich Pharma), являющееся нативным костным минералом в виде гранул аналогичного диаметра, который получают из костной ткани крупного рогатого скота путем многоступенчатой очистки по патентованной технологии с последующей стерилизацией Y-излучением.

Лабораторные животные

Эксперименты с лабораторными животными были выполнены на базе виварно-эксперимен- тального комплекса ООО «НИИ митоинжене- рии МГУ» в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, и одобрены локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института митоинженерии при МГУ (код этического утверждения 37/2019, утверждено 17 июня 2019 года).

В эксперимент было включено 48 самцов крыс линии Sprague-Dawley со зрелым костным скелетом (возрастом от 4,5 до 6 месяцев) на момент начала эксперимента. Лабораторные животные были получены из подразделения филиала Института биоорганической химии Российской академии наук - питомника лабораторных животных «Пущино». Животные были клинически здоровы и не были инфицированы патогенами из списка FELASA 2014, за исключением Helicobacter spp. и Gardia muris. Адаптационный период животных после прибытия из питомника составлял 7 суток.

В пилотном эксперименте животных содержали в полипропиленовых индивидуальных проветриваемых клетках в блоке передержки животных, в основном эксперименте - в клетках открытого типа в барьерной зоне вивар- но-экспериментального комплекса. В предоперационный период крысы содержались в клетках Т3 (Tecniplast, Италия) с площадью пола 780 см2 по две особи или в клетках Т4 (Tecniplast, Италия) с площадью пола 1500 см2 по четыре особи. На протяжении всего исследования животные имели неограниченный доступ к корму («Чара для содержания», Ассорти- мент-Агро, Россия) и стерильной обратноосмотической воде. В качестве подстила использовали деревянную щепу Lignocel (JRS, Россия). Все материалы, поступающие к животным, автоклавировали. На протяжении всего времени эксперимента поддерживали стандартные условия: циклы температуры (23 ± 3 ° C), относительной влажности (50 ± 20%) и 12 ч света / темноты (включение света в 09:00) и отслеживали состояние здоровья всех крыс ежедневно.

Все животные, участвующие в эксперименте, были индивидуально промаркированы путем перфорирования ушных раковин, также клетки маркировали карточками, где содержалась информация о заселяющих клетку особях и проводимых с ними манипуляциях. Особям пилотного эксперимента проводился мониторинг веса ежедневно в течение 7 дней после оперативного вмешательства, крысам основного эксперимента - ежедневно в течение 6 дней после оперативного вмешательства. Массу тела измеряли при помощи технических весов Pioneer PA2102 (Ohaus, США), с точностью ± 1 г. Распределение крыс по экспериментальным группам проводили путем рандомизации с использованием стандартного алгоритма GraphPad (GraphPad Prism).

Экспериментальная модель

В работе использовали экспериментальную модель дефекта костей свода черепа, которая состояла в хирургическом удалении теменных костей диаметром 8 мм [30]. Дефект такого размера у взрослых крыс является «критическим» и исключает самопроизвольную регенерацию костной ткани [30]. В пилотном эксперименте на 10 крысах была отработана методика выполнения хирургической операции по созданию критического дефекта костей свода черепа. Часть животных не подвергалась манипуляциям по заполнению дефекта. Другой группе крыс дефект заполняли аутотрансплантатом костной ткани (удаленным участком свода черепа). Состояние животных отслеживали на протяжении 7 дней после операции, обращая внимание на целостность швов и видимые признаки послеоперационных осложнений, после чего подвергали эвтаназии и оценивали морфологию дефектного участка. Основной эксперимент (по 6 крыс в группе) включал в себя оценку регенеративных свойств гетерологического ДКМ в сравнении с препаратом-компаратором Geistlich Bio-Oss® и двумя контрольными группами - без заполнения костного дефекта и с дефектом, заполненным удаленным участком свода черепа по аналогии с пилотным экспериментом (таблица 1).

Таблица 1. Схема основного эксперимента

Table 1. Experimental design

Животных наркотизировали путем внутри- брюшинного введения 15-20 мг/кг тилетами- на, 15-20 мг/кг золазепама и 3-6 мг/кг ксила- зина. Для доступа к операционному полю над сводом черепа сбривали шерсть и разрезали кожу по средней линии головы, потом разрезали соединительные ткани черепа и надкостницу и отслаивали их от черепа при помощи шпателя. При помощи трепана диаметром 8 мм и стоматологического привода при скорости вращения 1000 оборотов в минуту с непрерывным смачиванием физиологическим раствором (0,9% NaCl), производили насечку на теменных костях почти на толщину кости (до прозрачности). Выпиленный костный фрагмент удаляли при помощи элеватора, тем самым формируя дефект необходимого диаметра. Получившуюся дефектную область промывали физиологическим раствором и удаляли мелкие костные остатки по краям. В группе отрицательного контроля дефектную область оставляли незаполненной, в группе положительного контроля - заполняли удаленными костями свода черепа (реимплантация), в третьей группе - препаратом-компаратором (Geistlich Bio-Oss®), в четвертой - гетерологическим ДКМ (надкостницу сшивали рассасывающейся нитью Monociyl (Ethicon).

Кожу сшивали рассасывающейся нитью Т-сорб (Политехмед, Россия). После операционного вмешательства крысам вводили 10 мл/кг физиологического раствора подкожно каждые 1-1,5 часа и согревали при помощи электрогрелки до пробуждения. В первые двое суток после операции животным внутрибрюшинно вводили 10 мг/кг нефопама и 50 мг/кг ко-три- моксазола 2 раза в день.

Через 1 и 3 месяца после искусственного создания дефекта по 3 крысы из каждой группы производили вывод крыс из эксперимента путем их помещения в герметичную камеру с атмосферой, перенасыщенной углекислым газом (СО2). При помощи стоматологического бора эксплантировали кости свода черепа, содержащие область дефекта и окружающую неповрежденную ткань, и фиксировали их в забуфе- ренном фосфатом 4% растворе формалина (pH 7,2-7,6) на протяжении 48 часов. Хранение полученных биоптатов производили в 1% водном растворе формалина при 2-8°С.

Микротомографический и гистологический анализ эксплантированной костной ткани

Определение трехмерной структуры и минеральной плотности кости проводили при помощи микрокомпьютерной томографии (SkyScan 1172, Bruker) при разрешении ~ 8 мкм в вокселе. Томографирование исследуемых образцов проводили одновременно с калибровочными образцами диаметром 8 мм и минеральной плотностью гидроксиапатита 0,25 и 0,75 г/ см3. В ходе томографического исследования костной ткани образцы поддерживали в увлажненном состоянии. Для анализа микрокомпьютерных томограмм использовали программное обеспечение CTAn (Bruker), рассчитывая минеральную плотность новообразованной костной ткани, а также количественные характеристики ее трехмерной структуры (объем новообразованной костной ткани, толщину новообразованных костных элементов и распределение их диаметра). По завершении исследования образцы переносили обратно в раствор формалина до морфологического исследования структур костной и прилежащих мягких тканей.

Для гистологического исследования образцы декальцинировали до полного размягчения в электролитном растворе (ЭргоПродакшн, Россия) в течение 96 часов при комнатной температуре (22-25°C). Далее биоптаты подвергали дегидратации в семи сменах 99,7% изопрепа (БиоВитрум, Россия) по 5 часов в каждой смене. Пропитывали в двух сменах парафиновой среды Histomix (БиоВитрум, Россия), по два часа в каждой смене и заключали в парафин. Готовые парафиновые блоки подготавливали для резки на микротоме, для чего блок размечали так, чтобы можно было взять параллельные ступенчатые срезы из следующих областей: два - по касательным линиям, проведенным через точки на противоположных краях дефекта, один - через центр, пересекая дефект по его диаметру, и еще два - посередине между центральным и описанными краевыми срезами. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином (БиоВитрум, Россия) по стандартному протоколу. Морфологическое исследование выполняли при помощи светового микроскопа Axio Scope.Al (Carl Zeiss, Германия). Фотосъемку срезов осуществляли при помощи камеры AxioCam MRc 5 (Carl Zeiss) с программным обеспечением AxioVision 3.0 (Carl Zeiss).

Статистический анализ

Экспериментальные данные подвергались статистическому анализу в программе GraphPad Prism 6 (GraphPad Software). Данные представляли в виде среднего и стандартного отклонения от среднего. Анализ временных рядов осуществляли посредством двухфакторного дисперсионного анализа (факторы «группа» и «время»).

Межгрупповые различия оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа, попарные сравнения групп проводили с использованием критерия Тьюки для исключения систематической ошибки множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при вероятности отвергнуть верную нулевую гипотезу р < 0,05.

Результаты