Гістологічне дослідження печінки щурів, що вживали генномодифіковану сою, оброблену гербицидом «Roundup

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Гістологічне дослідження печінки щурів, що вживали генномодифіковану сою, оброблену гербицидом «Roundup»

І.В. Чорна

Г.В. Дроник

І.С. Давиденко

Проведено гістологічне дослідження печінки щурів двох поколінь, яким згодовували трансгенну сою, оброблену гербіцидом «Rounds». Виявлено що найбільше дистрофічні зміни спостерігаються у печінці щурів, які споживали генномодифіковану сою, оброблену гербіцидом та у щурів, які вживали гербіцид разом з питною водою. У наступному поколінні спостерігається підсилення дистрофічних змін у гепатоцитах щурів. Мікроскопічні зміни можуть вказувати на енергетичне навантаження та інтенсифікацію дезінтоксикаційних процесів цими клітинами.

Однією з найпоширеніших трансгенних рослин, яку широко використовують як у сільському господарстві, так і в харчовій промисловості являється генетично модифікована соя з новою ознакою «Roundup Ready». Ця трансгенна соя виявляє стійкість до гербіциду «Rounds» за рахунок внесення гену бактерії Agrobacterium tumefaciens. Трансгенна соя синтезує бактеріальну EPSPS, що замінює інгібований гербіцидом фермент у рослині. Тому генетично модифікована соя стійка до гліфосату і продовжує рости при обробці поля цим гербіцидом, тоді як бур'яни гинуть [10, 13, 14]. Широке використання трансгенної сої «Roundup Ready» та гербіциду «Roundup» залишає велику кількість пересторог у суспільстві щодо їх безпечності як для навколишнього середовища, так і для здоров'я тварин та людини [1, 2, 4]. Для того щоб оцінити безпечність вживання гліфосат-резистентної сої та гербіциду «Roundup» на здоров'я тварин, проводили патоморфологічні дослідження структури печінки двох поколінь щурів, бо саме печінка є основним детоксикаційним органом [5, 7, 11].

Метою досліджень було виявити та оцінити гістопатологічні зміни у печінці щурів під впливом гербіциду «Roundup» та трансгенної гліфосат-резистентої сої, обробленої цим гербіцидом.

Для досліджень використовували боби трансгенної сої сорту лінії GTS 403-2 («Monsanto Canada Inc.») [12]. Лінія сої GTS 40-3-2 стійка до дії гербіцидів, що містять гліфосат, завдяки вставці гліфосат-резистентної форми гену, ферменту 5-enolpyruvylshikimat-3-phosphate synthase (EPSPS). [6, 12]. Також у експериментальних дослідженнях було використано традиційну сою вітчизняного сорту Чернівецька 9, яку нам надала Буковинська дослідна станція агропромислового виробництва УААН. Зразки сої обох сортів (Чернівецька 9 та лінії GTS 40-3-2) перевірялись на наявність генетичної модифікації, що підтверджено Українською лабораторією якості і безпеки продукції АПК протоколом №1691-Н. У зразку №2 виявлені цільові послідовності промотора 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) та термінатора NOS (Т-NOS) T1 плазміди Agrobacterium tumifaciens. За результатами даних лабораторії соя сорту Чернівецька 9 за хімічним складом (вологість, масовою часткою білка, жирів, елементів) еквівалентна генетично модифікованому гліфосат-резистентному сорту сої лінії GTS 40-3-2. Виявлені за окремими показниками різниці знаходяться у межах біологічної норми.

Дослідження проводили на 4-місячних щурах лінії Вістар масою 180-200 г., які були поділені на п'ять груп, по 14 щурів у кожній групі: I - інтактні тварини (утримувалися на стандартному раціоні віварію); ІІ - тварини, яким 20-26% стандартного раціону замінено на традиційну сою (сорту Чернівецька 9) за поживною цінністю; ІІІ - щури, яким 20-26% у стандартного раціону замінено на генетично модифіковану сою (лінії GTS 40-3-2), не оброблену гербіцидом «Round^»; IV - щури, раціон яких містив 20-26% трансгенної сої, яка була оброблена гербіцидом; V - щури, які отримували разом з питною водою гербіцид (0,1 мкг/л або 0,003 мкг/кг маси тварини), що є допустимою концентрацією в межах вимог Європейського Союзу. Боби традиційної та трансгенної сої перед додаванням у корми проходили термічну обробку при 140°С протягом 2 год, для зниження уреазної активності та знешкодження антипоживних речовин.

В роботі дотримувалися нормативів поводження з лабораторними тваринами відповідно до Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, що використовуються для експериментальних чи інших наукових цілей (Страсбург, 1986) [8].

Після 42 днів утримання на відповідному раціоні, щурів спаровували та одержали через 22-25 днів наступне покоління. Кількість приплоду в I, II, III та IV групах коливалася близько 10 щуренят у гнізді. Кількість приплоду в V групі становила близько 8 щуренят у гнізді в перший день після народження. Через два місяці було відібрано по 24 щурів другого покоління кожної групи, які продовжували утримуватися на тому ж раціоні.

У віці 12-ти місяців щурів двох поколінь було декапітовано та проводили відбір шматочків печінки для гістологічного дослідження. Печінку фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну більше 48 годин. Після фіксації матеріал зневоднювали у розчинах етилового спирту і ущільнювали парафіном при температурі 58°С. Парафінові гістологічні зрізи тканини печінки товщиною 5-7 мкм виготовляли санним мікротомом МС-2, після депарафінізації зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. Мікропрепарати вивчали у світловому мікроскопі за оптичного збільшення - 200 з використанням окуляра 10х та об'єктива 20х. Цифрові копії оптичного зображення (цифрові світлини) отримували за допомогою цифрового фотоапарата Olympus SP550UZ. Ці цифрові світлини аналізували за допомогою ліцензійної копії комп'ютерної програми ImageJ (версія 1.48v, вільна ліцензія, W. Rasband, National Institute of Health, USA, 2015) [9]. Вказана комп'ютерна програма серед інших можливостей дозволяє підраховувати відсоток клітин у різному стані шляхом маркування їх з нумерацією, в результаті чого отримують число клітин у певному стані в полі зору та загальне число клітин в полі зору, а з цих даних обраховують відсоток клітин у певному стані (наприклад, у стані оборотного набухання чи у стані некрозу). У кожної тварини оцінювали по 1000 гепатоцитів.

Результати дослідження та їх обговорення

Досліджування морфологічних змін печінки проводилися на двох поколіннях щурів лінії Вістар, яку одержали після спаровування щурів покоління F У дослідних групах найбільша смертність щурят (покоління F1) наступала у перші 5 діб життя. Протягом двох місяців смертність щуренят у I, II та ІІІ коливалася в межах фізіологічної норми (3,6-9,2%). У IV та V дослідних групах смертність становила 12% та 24%. Після народження щуренят самки (покоління F₀) продовжували утримуватися на тому ж раціоні та разом з питною водою одержувати гербіцид. Дослідження мікроструктури печінки щурів двох поколінь усіх експериментальних груп відзначали часточкову будову органу, де гепатоцити були переважно з базофільною цитоплазмою. При гістологічному дослідженні печінки щурів контрольної групи та щурів, які вживали традиційну сою (ІІ група), не виявлено патологічних змін, як у першому так (F₀) і у другому поколінні (Fj). У щурів III групи помітні слабко виражені зміни в гепа - тоцитах, зокрема, у цитоплазмі поодиноко виявляли невеличкі ліпідні краплі, така ж картина спостерігається і у другому поколінні.

Рис. 1. Мікрофотографія фрагменту печінки інтактного щура

Примітка: Забарвлення гематоксиліном і еозином. Об.20х. Ок.10х

Рис. 2. Мікрофотографія фрагменту печінки щура при вживанні традиційної (а) та трансгенної (6) сої

Рис. 3. Мікрофотографія фрагменту печінки щура при вживанні з питною водою гербіциду у поколіннях Е0 (а) та Е} (6)

Рис. 4. Мікрофотографія фрагменту печінки щура при вживанні генетично модифікованої сої, обробленої гербіцидом «Rounduр у поколіннях F0 (а) та FI (б)

Дослідження тканин печінки щурів IV та V груп вказує на пошкодження цього органу. При цьому у IV групі, тварини, які вживали генетично модифіковану сою, оброблену гербіцидом «Round^», спостерігаються більш виражені морфологічні зміни (оборотне набухання у вигляді зернистої та гідропічної дистрофії), ніж у щурів V групи. Це може свідчити про накопичення гербіциду у насінні сої та підсилення впливу двох факторів на організм тварини. У дру-гому поколінні у IV та V груп вплив трансгенної сої, обробленої гербіцидом та самого гербіциду підсилюється. Виявлено оборотне набухання гепатоцитів з поширеністю понад 50% у IV групі першого покоління та понад 60% у другому поколінні.

У щурів IV та V групи додатково до описаних змін були виявлені некротичні зміни в окремих гепатоцитах у вигляді зморщування клітинного ядра (ка - ріопікноз). Таким чином, вживання генетично модифікованої сої, обробленої гербіцидом «Rounduр» та гербіциду разом з питною водою (0,1 мкг/л) призводить до морфологічних змін у гепатоцитах і до некротичних змін окремих клітин, це в свою чергу веде до порушення у роботі печінки. Такі зміни можуть бути пов'язані не лише з оборотним набуханням у вигляді зернистої та гідропічної дистрофії, але й із змінами у будові окремих органел, як свідчать літературні джерела, це проявляється у вигляді гіперхромного деформованого або фрагментованого ядра з наявністю двох і більше ядерець. Гепатоцити, які розташовані біля некротичних клітин мають виражені ознаки внутрішньоклітинної регенерації та адаптації, що проявляється гіпертрофією та поліплоїдією [3, 5] Також при довготривалому вживанні трансгенної сої щурами у наступних поколіннях може спостерігатися зміни у мітохондріях більшості гепатоцитів (набубнявіння мітохондрій і руйнування крист) та збільшення числа первинних лізосом та мітохондрій у перинуклеарній зоні [5]. Крім того втрачається гетерогенність клітин печінки щурів, що добре було виражено на мікрофо - тографіях гістологічних зрізів контрольної групи. Все це може бути ознакою функціональної напруги та зменшення адаптаційних резервів печінки.

Висновки

1. Вживання щурами традиційної та генетично модифікованої сої, не обробленої гербіцидом «Rounduр», не призводить до значних порушень у структурі печінки як у першому, так і у другому поколінні.

При введені гербіциду «Rounduр» у дозі 0,003 мкг/кг маси тварини, виявлені патоморфологічні зміни (оборотне набухання гепатоцитів та некротичні зміни в окремих гепатоцитах) у печінці щурів першого та другого покоління. У другому поколінні у більшої кількості гепатоцитів виявлені некротичні зміни увигляді зморщування клітинного ядра (каріопікноз), що може бути причиною тривалішої дії гербіциду та посилення його впливу у другому поколінні.

2. Довготривале згодовування щурам трансгенної сої, обробленої гербіцидом «Rounduр» призводить до оборотного набухання гепатоцитів як у першому, так і у другому поколінні. Слід відзначити, що у другому поколінні на 10% більше гепатоцитів з оборотним набухання, ніж у першому поколінні цієї ж групи. Також у окремих клітинах спостерігається явище каріопікнозу, як прояв некротичних змін цих клітин, при цьому цей процес більше виявлений у щурів другого покоління.

Список використаної літератури

дистрофічний трансгенний соя печінка

1. Власик Л.І. Особливості патоморфологічних змін у внутрішніх органах щурів у наслідок під гострого впливу срібних нанодекаедрів / Л.І. Власик, Н.Й. Андрійчук, І.С. Давиденко // Клінічна та експериментальна патологія. - 2014. - Т. XIII, №3 (49). - С. 33-36.

2. Вудамаска І.В. Оцінка якості та безпеки генетично модифікованих організмів / І.В. Вудамаска, Р.П. Параняк, Д.О. Янович // Біологія тварин. - 2007. - Т. 9, №1-2. - С. 23-29.

3. Кулик Я.М. Морфофункціональні зміни печінки, нирок та наднирників експериментальних тварин при довготривалому згодовуванні раундапостійкої генетично модифікованої сої / Я.М. Кулик, А.О. Гаврилюк, В.Т. Рауцкієне., О.В. Хіміч // Вісник морфології. - 2014. - Том 20, №1. - С. 149-153.

4. Саліха Н.О. Генетично модифіковані рослини та їх вплив на організм тварин / Н.О. Саліха, В.В. Снітінський // Біологія тварин. - 2010. - Т. 12, №2 - С. 61-74.

5. Самсонюк І.М. Ультраструктурна характеристика печінки щурів третього покоління за впливу генетично модифікованої та традиційної сої / І. М. Самсонюк, Г.І. Коцюмбас // Біологія тварин. - 2014. - Т. 16, №2 - С. 91-100.

6. Сичевський М.П. Тест-система для ідентифікації сої лінії GTS 40-3-2./ М. П Сичевський., Я.Ф. Жукова, М. І. Вакуленко // Товари і ринки. - 2016 - №2 - С. 99-108.

7. Brake D.G. A generational study of glyphosate-tolerant soybeans on mouse fetal, postnatal, pubertal and adult testicular development / D.G. Brake, D.P. Evenson // Chemical Toxicology. - 2004. - №23. - P. 45-46

8. European convention for the protection of vertebrate animals used forexperim. and other scientific purposes. Coun. of Europe, Strasbourg - 1986. - 53 p.

9. Ferreira T. ImageJ. User Guide / T. Ferreira, W. Rasband. - New York: National Institute of Health. - 2012. - 187 p.

10. James C. Global status of commercialized blotech GM croup: ISAAA Brief, Ithaha. - 2013. - №244. - P. 24-28.

11. Malatesta M. Hepatoma issue culture (HTC) cells as a model for investigating the effects of low concentrations of herbicide on cell structure and function / M. Malatesta, F. Perdoni, G. Santin // Tox^l in vitro. - 2008. - no. 22. - P. 58-60.

12. Padgette S.R. The composition of glyphosate-tolerant soybean seeds is equivalent to that of conventional soybeans / S.R. Padgette, N.B. Taylor, D.L. Nida, M.R. Bailey, J. MacDonald, L.R. Holden, R.L. Fuchs // J. Nutr. - 1996. - 126 (3), - P. 702-716.

13. Sahai S. Genetically Modified Crops: a resource guide for the Asia Pacific, Consumers International Asia Pacific office / S. Sahai - Kuala Lumpur - 2003. - 289 p.

Размещено на Allbest.ru