Показники перекисного окислення білків і ліпідів та антиоксидантного захисту як маркери ендогенної інтоксикації у хворих з синдромом обструктивного апное сну

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка НАМИ України» (дир. - акад. НАМН України, проф. Д.І. Заболотний)

Показники перекисного окислення білків і ліпідів та антиоксидантного захисту як маркери ендогенної інтоксикації у хворих з синдромом обструктивного апное сну

Ю.В. Мінін

Т.І. Кучеренко

Ю.Б. Бурлака

Ю.Г. Клись

Н.М. Ворошилова

С.В. Верьовка

Сон - це важлива і необхідна складова здоров'я людини. Можливі порушення дихальної функції під час сну можуть істотно знизити якість і тривалість життя пацієнта. Тому розлад дихання під час сну, зокрема, обструктивні порушення дихання, становить вагому медико-соціальну проблему. Синдром обструктивного апное сну (СОАС) характеризується хропінням, періодичним спаданням верхніх дихальних шляхів на рівні глотки, припиненням легеневої вентиляції при збережених дихальних зусиллях, зниженням рівня кисню крові, грубою фрагментацією сну і денною сонливістю [1]. При тяжких формах СОАС може відмічатися до 400-500 зупинок дихання за ніч тривалістю до хвилини і більше, що призводить до гострої та хронічної недостатності кисню під час сну. Це, в свою чергу, зумовлює ризик розвитку артеріальної гіпертонії, порушень ритму серця, інфаркту міокарда, інсульту і раптової смерті уві сні [2].

Одним з важливих патофізіологічних механізмів розвитку ендогенної інтоксикації (ЕІ) є активація процесів перекисного окиснення білків і ліпідів, ініційована вільними радикалами [2, 3]. Дисбаланс в системі прооксиданти-антиоксиданти призводить до «окисного стресу». Це, в свою чергу, сприяє підсиленню деструктивних процесів та може бути супутнім патогенетичним фактором ряду захворювань [3, 4].

Згідно даних літератури, окисний стрес може мати місце і при СОАС, тому урахування окисно-відновної ланки патогенезу та дослідження перекисного окиснення білків (ПОБ), ліпідів (ПОЛ) та стану антиоксидантної системи (АОС) при синдромі обструктивного апное сну з різним ступенем тяжкості є важливим для діагностики та лікування даної категорії хворих.

Метою роботи було дослідити інтенсивність перекисного окиснення білків та ліпідів, компоненти антиоксидантної системи та біохімічні показники ендогенної інтоксикації у хворих з синдромом обструктивного апное сну.

Матеріали та методи дослідження

Було обстежено 20 пацієнтів, які перебували на стаціонарному лікуванні в ДУ «Інституті отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка НАМН України». Всі пацієнти були проінформовані і надали письмову згоду на участь у дослідженні. У дослідженні брали участь 14 чоловіків і 6 жінок віком від 37 до 62 років, які мали характерні клінічні ознаки порушення дихання під час сну. Кожному пацієнту проводили стандартні антропометричні виміри, типове оториноларингологічне обстеження. Постановка діагнозу і визначення ступеню тяжкості порушення дихання під час сну здійснювалось за результатами кардіо-респіраторного моніторингу на базі «Київського центру медицини сну». Загальновизнаним критерієм ступеню тяжкості СОАС є кількість апное на годину - індекс апное (ІА). Існує думка про доцільність урахування не тільки кількості епізодів апное, але й гіпоапное, оскільки вони обумовлюють схожі ризики розвитку серцево- судинних та інших ускладнень [5].

Усі хворі були розподілені на 2 групи: 10 пацієнтів, які мали індекс апное сну до 30 епізодів зупинки дихання на годину (ІА<30), та 10 - більш ніж 30 епізодів зупинки дихання на годину (ІА>30). Контрольну групу склали 10 умовно здорових осіб.

Всім пацієнтам після проведення діагностичних процедур уночі проводився забір крові в ранкові години з ліктьової вени натщесерце. Об'єктом біохімічних досліджень була сироватка крові, яку отримували з цільної крові після інкубування при температурі 37 С у термостаті EN500 протягом 30 хв. з подальшим центрифугуванням при частоті обертання 4000 об/хв. протягом 20 хв. у центрифузі NF-200.

Біохімічні показники ендогенної інтоксикації, а саме - вміст молекул середньої маси (МСМ), визначали в безбілковій фракції сироватки крові на спектрофометрі СФ-26 і виражали в умовних одиницях (у.о.), що дорівнюють оптичній густині розчину, який вимірюється при довжині хвилі 254 нм [6]. Визначення тирозинвміщуючих пептидів (ТВП) проводилось згідно методики В.Б. Гаврилова та співавторів [7] при довжині хвилі 280 нм.

Інтенсивність окислювальної модифікації білків плазми крові оцінювалась за методом R.L. Levin у модифікації A.Z. Reznick, який заснований на реакції взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4-дінітрофенілгідразином з утворенням 2,4-дінітрофенілгідразонів [8]. Оптична густина утворених дінітрофенілгідразонів визначалась спектрофотометрично при довжині хвиль 356 нм і 430 нм (альдегідні похідні нейтрального та основного характеру) та 370 і 530 нм (кетонні похідні нейтрального та основного характеру) [9]. Показники окислювальної модифікації білків виражали в нмоль дінітрофенілгідразонів на 1 мл плазми, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 22х103 моль-1см-1.

Оцінка інтенсивності перекисних процесів проводилась за методом М.С. Гончаренко, А.М. Латинової [10] за концентрацією в сироватці крові одного з кінцевих продуктів ПОЛ - малонового діальдегіду, що визначається в реакції з 2- тіобарбітуровою кислотою (ТБК). Оскільки, окрім МДА, ряд низькомолекулярних сполук також може утворювати забарвлені комплекси з ТБК, в кінцевому результаті реакції визначали суму ТБК-позитивних продуктів.

Активність каталази (К.Ф. 1.11.1.6) визначалась за методом М.А. Королюка та співавторів [11]. Метод заснований на здатності пероксиду водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс. Про активність системи АОС судили також за вмістом вільних тіолових груп (8И-груп), що визначались методом В.В. Соколовського та співавторів [12]. Метод заснований на здатності тіолових сполук при взаємодії з 5,5'-дітіо-біс (2-нітробензойної кислотою) утворювати забарвлене з'єднання - тіо-2-нітробензойної кислоту, водний розчин якого має максимум поглинання при X = 412 нм.

Статистична обробка результатів проводилась за допомогою пакету програм для статистичної обробки біометричних даних WinPEPI. Для оцінки різниці між показниками основної та контрольної груп були використані І-критерій Стьюдента, враховуючи рекомендації Є.В. Гублера [13] та Е.В. Мальцева [14]. Різницю вважали статистично достовірною при р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Відповідно до сучасних уявлень, одним з біохімічних маркерів інтоксикації та її найважливішим патохімічним критерієм є неелеміновані з організму кінцеві і проміжні продукти обміну - так звані молекули середньої маси (МСМ). Показник при спектрі поглинання 254 нм розглядається як інтегральний критерій метаболітів низької та середньої молекулярної маси від 500 до 5000 Д. В останні роки запропоновано новий високоінформативний тест в діагностиці інтоксикацій організму - це визначення ТВП, дослідження якого обумовлено превалюючою участю білків, до складу яких входить тирозин, та найбільшим їх накопиченням [15].

Нами було досліджено рівні МСМ та ТВП у сироватці крові хворих з СОАС різного ступеню тяжкості (табл. 1).

В результаті проведених досліджень було встановлено, що в сироватці крові хворих з СОАС, індекс апное яких був >30, рівень МСМ достовірно підвищився в 1,2 рази порівняно з контрольним показником. У групі хворих з СОАС з індексом апное <30 статистично значимої різниці даного показника не відмічено. Вміст ТВП достовірно збільшувався в сироватці крові обох досліджуваних групах в середньому в 1,3 рази порівняно з контролем. Так, представлені результати свідчать про більшу інформативність дослідження вмісту ТВП порівняно з інтегральним показником МСМ, які відображають стан ЕІ.

Гіпоксія, що виникає при СОАС, викликає зміни вільнорадикального гомеостазу, що проявляються накопиченням в організмі активних форм кисню та активацією процесів перекисного окиснення ліпідів та білків.

Окиснення протеїнів ряд авторів вважають більш достовірним маркером окисних порушень порівняно з окисненням ліпідів, оскільки утворення карбонільних похідних білків відбувається швидше, а час їх детоксикації сягає декількох годин і навіть днів [16-18]. Відомо, що окисна модифікація амінокислот супроводжується порушенням нативної конформації протеїнів з утворенням білкових агрегатів або фрагментацією білкових молекул.

В результаті реакції окиснення білків можуть утворюватися альдегідні та кетонні угруповання амінокислотних залишків, котрі при взаємодії з 2,4-ДНФГ утворюють альдегід- та кетондинітрофенілгідразони (аДНФГ та кДНФГ, відповідно) [19].

В результаті проведених досліджень виявлено істотні відмінності за рівнем продуктів перекисного окислення білків та ліпідів у сироватці крові хворих з СОАС різного ступеню тяжкості (табл. 2).

Таблиця 2

Примітки:

р - достовірність різниці між групою практично здорових осіб та відповідними показниками групи хворих;

рі - достовірність різниці між групами хворих з різним індексом апное.

Результати досліджень показників у осіб із СОАС, ІА яких був <30, свідчать про достовірне підвищення у плазмі крові вмісту альдегід-дінітрофенілгідразонів нейтрального (аДНФГн) та основного (аДНФГо) характеру в порівнянні з контрольною групою. У хворих із СОАС з ІА>30 вміст цих протеїнових похідних також достовірно (в 2 рази) перевищував рівень контролю. Згідно даних літератури, альдегідні похідні динітрофенілгідразонів є маркерами структурних порушень білків шляхом фрагментації [16].

Встановлено також достовірне збільшення рівня кетондінітрофенілгідразонів нейтрального характеру (кДНФГн) в обох групах хворих. У осіб з середнім ступенем тяжкості СОАС (ІА<30) він перевищував показник донорів у 1,3 рази, при тяжкому перебігу СОАС (ІА>30) - у 2,1 рази. Статистично достовірних змін вмісту кетопохідних основного характеру (кДНФГо) в обох групах виявлено не було. Кетофенілгідразони - пізні маркери окислювальної модифікації, їх рівень зростає у разі вираженої деструкції білкових молекул у плазмі крові, що може вказувати на зниження резервно-адаптаційних можливостей організму. Зростання кетонових похідних протеїнів в плазмі крові свідчить про процеси агрегації білкових молекул [16].

Як випливає з отриманих даних, вміст аДНФГо, аДНФГн та кДНФГн у хворих із СОАС з ІА >30 достовірно (у 1,6 рази) перевищував показники осіб, ІА котрих був <30. Тобто, інтенсивність процесів окислювальної модифікації протеїнів зростає із поглибленням СОАС.

Як видно з даних, представлених в табл. 2, рівень ТБК-позитивних продуктів у хворих з СОАС достовірно підвищувався, а саме: при середньому ступені тяжкості (ІА <30) - в 1,2 рази, а при значних респіраторних порушеннях (ІА>30) - в 1,8 рази. Різниця між цим показником у пацієнтів з різним ступенем тяжкості СОАС є також достовірною. Тобто, вміст цих продуктів збільшувався по мірі прогресування патологічного процесу.

Отримані нами дані свідчать про посилення процесів ПОБ та ПОЛ у сироватці крові хворих із СОАС.

Деструктивному впливу продуктів ПОБ та ПОЛ протидіє антиоксидантна система, що складається з ферментної та неферментної ланок. Активність ферментів антиоксидантного захисту, зокрема каталази, використовується як показник оцінки антирадикального захисту і резистентності організму. Тіолові групи є компонентами не- ферментативної ланки АОЗ організму, що існують у двох станах: відновленому (-8И) та окисленому (-8-8). Концентрація 8И-груп в декілька разів більше концентрації 8-8-груп, оскільки більшість тіолових сполук фізіологічно активні саме у відновленому стані [20]. Результати дослідження компонентів АОЗ в сироватці крові хворих з СОАС різного ступеню тяжкості наведено в табл. 3.

Примітки:

р - достовірність різниці між групою практично здорових осіб та відповідними показниками групи хворих;

рі - достовірність різниці між групами хворих з різним індексом апное.

Як видно з представлених даних, у хворих з СОАС, ІА яких був <30, каталазна активність була на рівні контрольних значень. У пацієнтів зі значними респіраторними порушеннями (ІА>30) встановлено підвищення її активності в середньому у 1,5 рази порівняно як з групою контролю, так і з хворими на СОАС середнього ступеню тяжкості (ІА<30). Встановлене в ході нашого дослідження зростання каталазної активності в крові можна розглядати як пристосувальну реакцію організму у відповідь на посилення процесів ПОЛ.

В результаті проведених досліджень показано, що в сироватці крові хворих з обструктивним апное сну з індексом <30 вміст SH-груп достовірно зменшувався в 1,4 рази порівняно з контрольними показниками. У хворих з СОАС з ІА > 30 вміст SH- груп зменшувався на рівні тенденції.

Відомо, що СОАС супроводжується епізодами гіпоксії та реоксигенації, що викликає збільшення рівня активних форм вільних радикалів тим самим провокуючи окисний стрес [21]. Вважається, що рівень МСМ в першу чергу відображає ступінь патологічного білкового метаболізму [4, 22, 23]. У хворих на СОАС показник МСМ на ранніх стадіях захворювання виявився малоінформативним, оскільки зазнавав змін при тяжкому ступеню перебігу захворювання. Водночас вміст ТВП змінювався у хворих вже при ІА <30. Це свідчить про більшу інформативну цінність цього показника для виявлення ЕІ у хворих на СОАС. Існують дані про взаємозв'язок між концентрацією МСМ та посиленням вільно-радикальних процесів в організмі, що призводить до утворення продуктів ПОБ і ПОЛ [3, 22, 24].

Показане нами підвищення інтенсивності процесів окисної модифікації білків може викликати незворотні зміни фізико- хімічних властивостей протеїнових молекул, що призводить до втрати їх функцій та погіршення клінічної картини патологічних станів. Відомо, що цей показник є інтегративним параметром, що свідчить про накопичення в плазмі крові протеїнових похідних, та є маркером інтенсивності вільнорадикального окислення в клітинах. До найбільш важливих наслідків ОМБ належить інактивація ензимів, що призводить до порушення ферментативних процесів в організмі, функціонування іонних каналів і рецепторів клітин. Похідні ОМБ у подальшому стимулюють ПОЛ та окислювальне пошкодження ДНК, крім того, їм самим властива цитотоксична дія [22, 25, 26].

Встановлена нами активація процесів ПОЛ за рівнем ТБК-позитивних продуктів у хворих з СОАС узгоджується з гіпотезою Reimund, згідно якої під час сну відбувається видалення вільних радикалів, що акумулюються в організмі під час неспання [27]. Тому інсомнія може призводити до накопичення вільних радикалів в організмі. Результатом накопичення високотоксичних продуктів ПОЛ можуть стати зміни в метаболізмі білків, жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот і водно-електролітного обміну, що викликають тяжкі ураження тканин і знижують адаптаційні можливості організму [28].

Для контролю вільнорадикальних процесів та захисту від можливого пошкодження клітинних структур існує багатокомпонентна система АОЗ [29]. Відновлені тіоли є низькомолекулярними антиоксидантами, що виявляють антирадикальну та антиперекисну дію. Від їх концентрації залежить активність «тіолових» ферментів, що беруть участь в антиоксидантному захисті організму [30]. Каталаза є одним з ферментних антиоксидантів, що належить до первинного ланцюга внутрішньоклітинного захисту від активних форм кисню. Її активність в крові є одним з прогностичних тестів вираженості ЕІ організму людини.

Виявлене нами зниження рівня відновлених тіолів у хворих на СОАС може бути обумовлено більш активним їх використанням в якості антиоксидантів. Тому «тіолові» ферменти відіграють важливу роль в механізмах АОЗ на ранніх стадіях розвитку окисного стресу. При поглибленні тяжкості захворювання вміст SH-груп наближався до показника контролю. Встановлене в результаті проведених досліджень зростання активності каталази у хворих з СОАС з ІА >30, імовірно, компенсує зниження рівня відновлених тіолів у відповідь на розвиток оксидативного стресу [31], оскільки відомо, що антиоксиданти здатні пригнічувати, зменшувати та/або затримувати ефекти окислення білків, які виявляються в живих клітинах, ліпідах, вуглеводах і ДНК [21].

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про зростання інтенсивності процесів перекисного окиснення білків і ліпідів, зміну компонентів антиоксидантної системи та розвиток ендогенної інтоксикації у хворих з синдромом обструктивного апное сну.

Отримані нами дані добре узгоджуються з припущенням про взаємозв'язок інсомнії з розвитком окислювального стресу, що може обумовити порушення вуглеводного обміну [32], ожиріння [33] і серцево-судинні захворювання [34]. Тому вивчення всіх етапів розвитку синдрому обструктивного апное сну становить науковий та практичний інтерес для розробки рекомендацій, профілактичних і лікувальних заходів з метою підвищення якості життя хворих з СОАС.

Література

апное сон ендогенний інтоксикація

1. Smolyaninova Yu.V., Khromova Yu.A., Madaeva I.M., Kolesnikova L.I. [Diagnosis and treatment of patients with obstructive sleep apnea / hypopnea syndrome]. Acta Biomedica Scientifica. 2007; 1(53): 40-3. [Article in Russian].

2. Ryabov G.A., Azizov Yu.M., Pasechnik I.N., Krylov V.V., Tsvetkov D.S. [Oxidative stress and endogenous intoxication in patients with critical conditions] Alexander Saltanov Intensive Care Herald. 2004; (4): 4-7. [Article in Russian].

3. Malakhova M.Ya. [Endogenous intoxication as a reflection of compensatory adjustment of metabolic processes in the body]. Efferentnaya terapiya. 2000; (4): 3-14. [Article in Russian].

4. Kopytova T.V., Abalikhina E.P., Schelchkova N.A. [The value of lipid peroxidation in biological substrates for the assessment of metabolic processes in psoriasis]. Klin. Lab. Diagn. 2007; (11): 20-3. [Article in Russian].

5. Buzunov R.V., Legeyda I.V., Tsaryova E.V. Snoring and obstructive sleep apnea syndrome in adults and children: A Practical Guide for Physicians. Moscow; 2013. 1245 p. [In Russian].

6. Zhadenov I.I., Karyakina E.V., Belova S.V., Goryachev V.I. The method of determining endogenous intoxication. Patent RU 2193780 C1 G 01N33 / 68, G 01N33 / 48. Claims 04/26/2001, published on November 27, 2002. 7: 935-48. [In Russian].

7. Gavrilov V.B., Lobko N.F., Konev S.V. [Determination of tyrosine and tryptophan-containing peptides in blood plasma by absorption in the UV-region of the spectrum]. Klin. Lab. Diagn. 2004; 3: 12-6. [Article in Russian].

8. Reznick A.Z., Packer L. Oxidative damage to protein: spectrophotometric method for carbonil assay. Methods in Enzymology 1994; 233: 357-63. [Article in Russian].

9. Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Khodov D.A., Porotov I.G. Oxidative modification of human serum proteins, method of its determination. Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B, Biomedical chemistry. 1995; 41 (1): 24-6. [Article in Russian].

10. Goncharenko M.S., Latin A.M. Method for evaluating lipid peroxidation. Laborat. delo. 1985; (11): 60-1. [Article in Russian].

11. Korolyuk, M.A., Ivanova L.I., Mayorova I.G., Tokarev V.E. Method for the determination of catalase activity. Laborat. delo. 1988; 1: 16-9. [Article in Russian].

12. Sokolovsky V.V., Kuzmina V.S., Moskadynova G.A., Petrova N.N. Spectrophotometric determination of thiols in blood serum. Klin. Lab. Diagn. 1997; (11): 20-1. [Article in Russian].

13. Gubler E.V. Computational methods of analysis and recognition of pathological processes. Lviv: Medicine; 1978. 296 p. [In Russian].

14. Maltsev E.V. Methodology of scientific creativity in medicine: Practical aspects. Odessa: Astroprint; 2006. 120 p. [In Russian].

15. Kozhamberdin K.E., Muravleva L.E., Omarova I.M. Effect of fluoropyrimidines in combination with cisplatin on the level of tyrosine and tryptophancontaining peptides. Meditsina i ekologiya. 2007; (3): 70-4. [Article in Russian].

16. Muravleva L.E., Molotov-Luchansky V.B., Klyuev A.D., Bakenova R.A., Kultanov B.Z., Tankibaeva O.N. Oxidative modification of proteins: problems and prospects of research. Fundamentalnyie issledovaniya. 2010; (1): 74-8. [Article in Russian].

17. Dubinina E.E., Pustogina A.B. Oxidative modification of proteins, its role in pathological conditions. Ukr Biochem J. 2008; 80 (6): 18. [Article in Russian].

18. Ilyicheva A.S., Fomina M.A. The state of oxidative carbonylation of muscle tissue proteins with severe hyperhomocysteinemia. I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2015; (1): 45-51. [Article in Russian].

19. Lavi E.L., Lavie P. Molecular mechanisms of cardiovascular disease in OSAHS: the oxidative stress link. Eur Respir J. 2009 Jun; 33(6):1467-84. doi: 10.1183/09031936.00086608.

20. Stepovaya E.A., Shakhristova E.V., Ryazantseva N.V. Oxidative modification of proteins and glutathione system during modulation of the redox status of epithelial cells of the mammary gland. Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B, Biomedical chemistry. 2016; 62 (1): 64-8. [Article in Russian].

21. Turan ^ Demir C Investigation of Lipid Peroxidation and Antioxidant Enzyme Activity in Sleep Apnea Patients. Natural Science and Discovery. 2016; 2 (2): 36-40.

22. Kopytova T.V., Dmitrieva O.N., Khimkina L.N., Panteleeva G.A. Oxidative modification of proteins and oligopeptides in patients with chronic dermatoses with the syndrome of endogenous intoxication. Fundamentalnyie issledovaniya. 2009; (6): 25-9. [Article in Russian].

23. Dubinina E.E. Oxygen metabolism products in the functional activity of cells. St. Petersburg: Med. Press; 2006. 397 p. [In Russian].

24. Astashova T.A., Astashov V.V., Morozov S.V. Chromato-mass spectrophotometric analysis of lipid peroxidation products in organs and tissues under the conditions of the toxicosis model. Problems of biological, medical, and pharmaceutical chemistry. 1998; (4): 52-5. [Article in Russian].

25. Dubinina O.Yu. Oxidative stress and oxidative modification of proteins. Medical and clinical chemistry. 2001; 3 (2): 5-11. [Article in Ukrainian].

26. Gubsky Yu.I, Belenichev I.F., Levitsky E.L., Kovalenko S.I., Pavlov S.V., Gancheva O.V., et al. Toxicological effects of oxidative modification of proteins in various pathological conditions. Modern problems of toxicology. 2005; 8 (3): 20-7. [Article in Russian].

27. Reimund E. The free radical flux theory of sleep. Med Hypotheses. 1994 Oct;43(4):231-3.

28. Kolesnikova L.I., Madaeva I.M., Semenova N.V., Solodova E.I. Assessment of oxidative stress in women with postmenopausal sleep disorders using an integral indicator. Klin. Lab. Diagn. 2014; 12: 29-32. [Article in Russian].

29. Menshchikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Bondar I.A., Trufakin V.A. Oxidative stress: pathological states and diseases. Novosibirsk: ARTA; 2008. 284 p. [In Russian].

30. Shevelkova A.A., Vyushina A.V. Oxidative modification of proteins and the content of thiols in the blood during physiological pregnancy. Journal of Obstetrics and Women's Diseases. 2012; LXI (4): 109-12. [Article in Russian].

31. Bezruchko N.V., Rubtsov G.K., Ganyaeva N.B., Kozlova G.A., Sadovnikova D.G. Catalase of biological environment of the human body and its clinical and biochemical value in the assessment of endotoxicosis. Tomsk State Pedagogical University Bulletin. 2012; 7 (122): 94-8. [Article in Russian].

32. Leibenluft E., Schmidt P.J., Turner E.H., Danaceau M.A., Ashman S.B., Wehr T.A., et al. Effects of leu- prolide-induced hypogonadism and testosterone replacement on sleep, melatonin, and prolactin secretion in men. J Clin Endocrinol Metab. 1997 Oct;82(10):3203-7. doi: 10.1210/jcem.82.10.4270.

33. Janson C, Lindberg E, Gislason T, Elmasry A, Boman G. Insomnia in men a 10 year prospective population based study. Sleep. 2001 Jun 15;24(4):425-30. doi: 10.1093/sleep/24.4.425.

34. Mallon L., Broman J.E., Hetta J. Sleep complaints predict coronary artery disease mortality in males: a 12-year follow up study of a middle aged Swedish population. JIntern Med. 2002 Mar; 251(3):207-16.

Размещено на Allbest.ru