Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ИВАНОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

МАТЕРИНСТВА И ДЕТСТВА имени В.Н. ГОРОДКОВА РОСЗДРАВА»

ОТЧЕТ

о научно-исследовательской работе по теме

«Патогенетические механизмы влияния гуминовых соединений на маточно-плацентарный кровоток беременных самок крыс на фоне развития и формирования органов иммунной и эндокринной систем их потомства»

Научный руководитель засл. деят. науки РФ, д.м.н.,

профессор Л.В. Посисеева

Ответственный исполнитель заведующая лабораторией

патоморфологии и электронной микроскопии

д.м.н., профессор Л.П. Перетятко

Иваново - 2006

РЕФЕРАТ

Ключевые слова: гуминовые соединения, маточно-плацентарное кровообращение, фетоплацентарная недостаточность, тимус, селезенка, надпочечники, потомство крыс.

Объект исследования: 16 беременных самок крыс линии Вистар, 98 плодов крыс, аналогичное количество последов и фрагментов маточных рогов с плацентарным ложем. На втором этапе эксперимента использовано 20 самок крыс, 196 плодов.

Цель работы: изучить патогенетические механизмы влияния гуминовых соединений на маточно-плацентарное кровообращение в условиях его экспериментального нарушения и на формирование органов иммунной и эндокринной систем потомства крыс.

Методы исследования:

макроскопическое изучение последов;

соматометрия плодов;

органометрия: линейные параметры, масса, объем, площадь материнской поверхности последа;

гистостереометрия (100-точечной сеткой по 6 линиям сканирования) последов, тимуса, селезенки и надпочечников плодов;

гистохимические методы: окрашивание соединительной ткани по методу ван-Гизона, PAS-реакция по Мак-Манусу, метод Браше и Фельген-Россенбека;

иммуногистохимическое исследование плаценты и плацентарного ложа с моноклональными антителами к сосудисто-эндотелиальному фактору роста и поликлональными - к фактору Виллебранда;

полутонкие срезы: окраска метиленовым синим и метилен-азур II-фуксином;

трансмиссионная электронная микроскопия.

Полученные результаты и их новизна: Впервые в эксперименте показана возможность коррекции плацентарной недостаточности, вызванной нарушениями маточно-плацентарного кровообращения, и профилактика гипотрофии плода гуминовыми соединениями. Выявлен основной патогенетический механизм действия гуминовых веществ - стимуляция адаптивных и компенсаторных процессов в плаценте, проявляющихся увеличением объемной доли материнского и плодового сосудистого русла, активацией параплацентарного транспорта и новообразованием сосудов в плацентарном ложе, связанным с повышением выработки васкуло-эндотелиального фактора роста. В работе впервые охарактеризованы развивающиеся при применении гуминовых соединений морфологические изменения в органах иммунной и эндокринной систем у плодов крыс. У потомства выявлено ускорение дифференцировки лимфоцитов в тимусе, активация гемопоэза и усиление митотической активности клеток в селезенке, увеличение удельной доли сосудов в надпочечниках. Впервые доказано, что гуминовые соединения в дозе 10 мг/кг веса не оказывают эмбриотоксического и тератогенного действия.

По результатам исследования защищена 1 и выполняется 1 кандидатская диссертация. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии ГОУ ВПО Саратовского государственного медицинского университета и кафедрах патологической анатомии ГОУ ВПО Красноярской государственной медицинской академии и ГОУ ВПО Ивановской государственной медицинской академии. Опубликовано 19 статей. Получены: серебряная медаль на VII Международном салоне промышленной собственности «Архимед-2004» в разделе медицина, грант РФФИ на проведение научных исследований «Механизмы коррекции маточно-плацентарного кровотока природными гуминовыми соединениями» (2005), бронзовая медаль на V Московском Международном салоне инноваций и инвестиций за разработку «Новые препараты из торфа» (2005).

Область применения: патологическая анатомия, гистология, экспериментальная биология.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ГК - гуминовые кислоты

ГМК - гиматомелановые кислоты

ИЛ1, 2 - интерлейкин

ИФН - интерферон

ФК - фульвокислоты

ФНО - фактор некроза опухоли

ХПН - хроническая плацентарная недостаточность

MDA - малоновый диальдегид

TNF - фактор некроза опухоли

МПК - маточно-плацентарное кровообращение

ОПН - острая плацентарная недостаточность

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

VEGF - васкуло-эндотелиальный фактор роста

vWF - фактор Виллебранда

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы плацентарной недостаточности, основной причиной которой являются нарушения маточно-плацентарного кровообращения (МПК), для современного акушерства, неонатологии и патологической анатомии в частности болезней анте- и перинатального периода заключена в таких исходах данной патологии как задержка внутриутробного развития, острая и хроническая гипоксия и анте-интранатальная гибель плода.

Практически все осложнения беременности сопровождаются плацентарной недостаточностью. Частота этой патологии при привычном невынашивании колеблется от 50 до 77% (Мамедалиева Н.М., 1993), при гестозах она составляет 30,6%, при экстрагенитальной патологии равняется 24-45% (Мурашко Л.Е., 1996; Радзинский В.Б., 1999; Савельева Г.М., 1991), у пациенток с вирусной и бактериальной инфекцией достигает 50-60% (Сухих Г.Т., 1997).

Решение одной из актуальных проблем медицины - безопасное материнство и детство - зависит, по мнению ряда исследователей (Орджоникидзе Н.В., 1994) от быстрого и активного внедрения в акушерство и перинатологию новых перспективных нетрадиционных методов профилактики и лечения перинатальной патологии. Основным аргументом при этом остается то, что применение лекарственных препаратов на фоне измененного иммунного статуса сопровождается не только развитием аллергических реакций у матери, но и оказывает эмбриотоксическое и тератогенное влияние на плод.

В последние годы большой научный интерес вызывает поиск природных ресурсов, содержащих биологически активные вещества. В медицине не меньший интерес представляет изучение патогенетических механизмов вновь полученных биологических активных веществ, позитивно влияющих на систему “мать-плацента-плод”. Апробация таких природных препаратов на беременных животных в рамках указанной системы позволяет в эксперименте изучить и обосновать новые механизмы, влияющие на рост и формирование органов у плодов в условиях плацентарной недостаточности, что позволит обосновать применение препаратов с целью профилактики целого ряда болезней перинатального периода и, следовательно, получения более здорового потомства. К таким новым веществам следует отнести гуминовые соединения, экстрагированные из торфа.

Исходя из выше изложенного, целью настоящего исследования явилось изучение патогенетических механизмов влияния гуминовых соединений на нарушенное в эксперименте маточно-плацентарное кровообращение, а также на формирование органов иммунной и эндокринной систем потомства крыс.

Задачи:

1. В условиях эксперимента выявить патогенетические механизмы влияния гуминовых соединений на маточно-плацентарный кровоток.

2. Исследовать стимулятор неоангиогенеза (васкуло-эндотелиальный фактор роста (VEGF)) и активность фактора Виллебранда (vWF) в плаценте и плацентарном ложе при нарушении маточно-плацентарного кровообращения и его коррекции гуминовыми соединениями.

3. Установить структурные перестройки в органах иммунной и эндокринной системы потомства крыс под влиянием гуминовых веществ.

4. Оценить плодовитость крыс, получавших гуминовые соединения, а также эмбриотоксичность и тератогенную активность изучаемых соединений.

5. На основании полученных результатов обосновать возможности дальнейшего применения препарата в экспериментальной медицине, акушерстве и неонатологии.

плодовитость крыса тимус кровообращение

1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1.1. Аналитический обзор

В отечественном акушерстве (Савельева Г.М. с соавт., 1991) плацентарная недостаточность рассматривается как клинический синдром, отражающий патологическое состояние материнской и плодовой частей плаценты, сопровождающийся нарушением ее функций и приводящий к замедлению развития и роста плода. При этом оценка морфологических изменений в плаценте наряду с состоянием компенсаторно-приспособительных реакций на субклеточном, клеточном и тканевом уровнях позволяет дифференцировать стадии компенсации, субкомпенсации и декомпенсации (Федорова М.В., Калашникова Е.П., 1986).

Острая плацентарная недостаточность является результатом нарушений маточно-плацентарного и плацентарно-плодного кровообращения, приводящих к ургентной акушерской патологии. С морфологической позиции острая плацентарная недостаточность развивается при апоплексии, преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты, предлежании плаценты с кровотечением, крупноочаговой нодулярной ишемии, обширных острых геморрагических инфарктах и массивной тромбозе венозных синусов (Савельева Г.М., 1991; Серов В.Н., 1997; Милованов А.П., 1999).

Острым нарушениям кровообращения чаще всего предшествуют следующие структурные изменения со стороны плацентарного ложа матки: недостаточность децидуализации базального эндометрия, персистирующий эндометрит, поствоспалительный или посттравматический очаговый склероз стромы. Перечисленные морфологические изменения в свою очередь приводят к недостаточной цитотрофобластической инвазии с частичной гестационной перестройкой миометриальных сегментов маточно-плацентарных артерий, что сопровождается недостаточным притоком материнской крови в межворсинчатое пространство плаценты, ультраструктурными повреждениями микроворсинок синцитиотрофобласта (Корнилова Н.К., 2003) и суперкоагуляцией материнской крови, находящейся в межворсинчатом пространстве (Радзинский В.Е., 2003). Сопоставление темпов тромбообразования в маточно-плацентарных артериях и венах плацентарного ложа при преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты указывает на опережающий тромбоз венозных коллекторов, приводящий к блоку венозного оттока и быстрому формированию ретроплацентарной гематомы (Милованов А.П., 2006).

В патогенезе вторичной хронической плацентарной недостаточности, развивающейся на фоне сформировавшейся плаценты, выделяют следующие основные механизмы: недостаточность первой или второй волны инвазии вневорсинчатого трофобласта в стенки спиральных артерий, реологические нарушения, патологическую незрелость ворсин, нарушения перфузии ворсин, патологию плацентарного барьера, недостаточность эндокринной функции плаценты (Милованов А.П., Фокин Е.И., 1995).

Основываясь на гистологических изменениях в плаценте с учетом УЗИ критериев зрелости плаценты и доплерометрического идекса кровотока в маточных артериях и пуповине Милованов А.П. с соавторами (1999) выделяют следующие формы хронической плацентарной недостаточности: маточно-плацентарная, плацентарная, фетоплацентарная дисфункция. Наиболее выраженные нарушения маточно-плацентарного кровотока наблюдаются при маточно-плацентарной форме, составляющей 35% случаев ХПН. Характерным проявлением этой формы является неполная гестационная перестройка спиральных артерий с сохранением внутренней эластической мембраны, мышечной оболочки и развитием гиперпластического артериосклероза вплоть до полной облитерации. В результате неполной гестационной перестройки спиральных артерий происходит некроз микроворсинок синцитиотрофобласта, тромбоз межворсинчатого пространства, формирование обширных геморрагических и ишемических инфарктов.

В условиях эксперимента разработаны различные модели острых и хронических нарушений маточно-плацентарного кровообращения. Острая недостаточность моделируется путем полной окклюзии сосудов матки лабораторных животных в конце срока гестации (Попов В.А., Щепеткин В.А., 1985). При этом происходит гибель большей части потомства (80-90%), а в лабиринтной части плацент развиваются тяжелые циркуляторные расстройства в виде резкого полнокровия, стаза в плодовых капиллярах, расположенных преимущественно в центре долек и вокруг материнских лакун.

Модель хронических нарушений маточно-плацентарного кровотока достигается путем уменьшения кровоснабжения беременной матки с помощью лигатур, наложенных на часть преплацентарных сосудов в последнем триместре беременности (Гармашева Н.Л., Константинова Н.Н., 1978). Обнаружено, что уменьшение кровоснабжения матки в пределах 25-35% вызывает задержку развития плода. Менее значительные нарушения кровоснабжения матки приводят к недостоверному снижению массы тела плодов, а уменьшение кровоснабжения свыше 40-50% - к внутриутробной гибели плодов.

С целью достижения дозированного уменьшения кровоснабжения и контроля над динамикой патологического процесса П.А. Клименко с соавторами (1982) предложили новый способ моделирования недостаточности маточно-плацентарного кровообращения. Способ заключается во введении 20%-го раствора хлорида натрия в область расположения преплацентарных сосудов каждого плодовместилища под контролем состояния микроциркуляции и гемодинамики. Исследователи при создании данной модели достигали 30%-ного уменьшения кровоснабжения беременной матки. Указанными авторами в последующем разработана и предложена методика введения тромбопластина под контролем флоуметрии для создания регионарного тромбоза. Моделирование 30% недостаточности маточно-плацентарного кровотока авторы достигали при окклюзии 25-50% вен каждого плодовместилища. Морфологическими исследованиями выявляли в зоне тромбоза спазм, четкообразное расширение артериол и венул, отек ткани и большое количество переполненных, нефункционирующих капилляров.

Для моделирования гипотензивного синдрома беременных и возникающих при нем расстройств маточно-плацентарного кровообращения Бородин Ю.И. с соавторами (1987) предложил проводить лигирование каудальной полой вены до впадения в нее почечных вен.

Профилактика и лечение плацентарной недостаточности, по мнению Г.М. Савельевой с соавт. (1991) и В.И. Бычкова с соавт. (1999), должна носить комплексный характер. Считается, что при хронической плацентарной недостаточности для восстановления функций плаценты необходимо, в первую очередь, улучшить маточно-плацентарное кровообращение. Однако подобное воздействие целесообразно сочетать с терапией, направленной на нормализацию коагуляционных свойств крови, восстановление физиологического газообмена в системе “мать-плацента-плод”, улучшение метаболизма в плаценте и на регенерацию структуры и функций клеточных мембран.

С морфологической точки зрения положительное воздействие на систему “мать-плацента-плод” проявляется в формировании компенсаторных и адаптивных процессов в плаценте, обеспечивающих гармоничное внутриутробное развитие плода. На практике улучшение маточно-плацентарного кровотока достигается либо применением сосудорасширяющих средств, либо препаратов, расслабляющих матку. Из вазоактивных препаратов в акушерской практике получили широкое распространение 2-адреномиметики (Радзинский В.Е., 1998).

В 80-х годах для улучшения маточно-плацентарного кровообращения был предложен препарат вазоактивного действия - трентал (Клименко П.А., 1981; Савельева Г.М., 1983). Основанием к его использованию к клинике явилось положительное влияние препарата на гемодинамику и микроциркуляцию. Трентал оказывает сосудорасширяющее действие, уменьшает периферическое сопротивление сосудов, улучшает коллатеральное кровообращение и микроциркуляцию. Последнее связано с изменением реологических свойств крови, в первую очередь, со снижением ее вязкости, с увеличением эластичности и дезагрегацией эритроцитов.

Асымбековой Г.У. (1996) доказана эффективность и других антиагрегантов, таких как аспирин и курантил. Причем последний обладает свойством стимулировать рост новых сосудов в строме ворсин при аутоиммунном невынашивании (Милованов А.П., Сидельникова П.А. с соавт., 2000).

Протективным действием по отношению к эндотелию обладают также и n-3 полиненасыщенные жирные кислоты. Указанный эффект обусловлен нормализацией липидно-холестеринового обмена. Клинические исследования, проведенные С.В.Павлович (1997), указывают на достоверное снижение хронической плацентарной недостаточности до 11,6% и угрозы прерывания беременности в поздние сроки до 7,5% при использовании n-3 полиненасыщенных жирных кислот с профилактической целью у беременных высокого риска развития акушерской патологии.

Наряду с традиционными средствами, применяемыми для улучшения метаболизма в плаценте, такими как глюкоза, какорбоксилаза, аскорбиновая кислота, в последние годы в акушерской практике используется препарат актовегин (Игнатко И.В., 2003). Препарат содержит исключительно физиологические компоненты, обладающие высокой биологической активностью.

Кроме медекаментозных средств, в комплексном лечении и профилактике плацентарной недостаточности используется широкий спектр физических факторов, среди которых заслуживает внимания озонотерапия (Макаров О.В. с соавт., 2002). Под влиянием озона в межворсинчатом пространстве плаценты нормализуется микроциркуляция за счет гиперплазии терминальных ворсин и уменьшения удельного объема фибриноида (Андикян В.М. с соавт., 2000). Кроме того, существует ряд работ, доказывающих эффективность электромагнитного и низкоинтенсивного лазерного излучения в коррекции нарушений маточно-плацентарного кровообращения (Филиппов О.С., 2003; Пронина Т.А., 2000).

Гуминовые вещества представляют собой особый класс природных органических соединений, не существующих в живых организмах, но необходимых для существования и обеспечения непрерывной жизнедеятельности современных жизненных форм. Гуминовые кислоты составляют бульшую часть органического вещества почв, торфов, бурых углей и вод мирового океана, а также содержатся в подземных водах и донных отложениях (Косьянова З.Ф. с соавт., 2002).

Гуминовые соединения образуются в окружающей среде в результате превращения органических остатков. Превращению в гуминовые соединения подвергаются погибшие растения, начиная со мха и, заканчивая древесными породами. Сложный и длительный процесс получил название гумификации. Гумификация может осуществляться как вне живых организмов, так и с их участием, в первую очередь почвенных микроорганизмов. В лабораторных условиях гумификацию можно осуществить благодаря последовательности чисто химических реакций: окисления, восстановления, гидролиза, конденсации и многих других. В отличие от синтеза биополимеров в живой клетке, протекающего в соответствии с генетическим кодом, в процессе гумификации нет определенной установленной программы, поэтому в процессе могут синтезироваться любые по сложности соединения - как простые, так и более сложные, чем исходные биомолекулы. Образующиеся соединения вновь подвергаются реакциям синтеза или разложения. Процесс продолжается до достижения термодинамического равновесия, то есть состояния, при котором продукты реакций полностью стабильны. Таким образом, осуществляется отбор наиболее устойчивых продуктов трансформации органического материала. Благодаря единому принципу формирования, гуминовые соединения различного происхождения обладают сходным элементным составом, однотипным набором структурных фрагментов и функциональных групп, близкими химическими и физическими свойствами.

По строению гуминовые вещества являются высокомолекулярными, склонными к ассоциации полидисперсными, полифункциональными природными лигандами с интенсивной темно-бурой или красновато-бурой окраской. Классификация гуминовых веществ основана на способах их выделения из природного сырья:

растворимая в щелочах фракция получила название гумусовых кислот, нерастворимая - гумина;

при подкислении щелочной вытяжки до рН 1-2 в растворе остается фракция фульфокислот (ФК), при этом образуется гелеобразный осадок, состоящий из гуминовых и гиматомелановых кислот (соответственно, ГК и ГМК);

для отделения гуминовых кислот от гиматомелановых последние извлекают из сырого остатка (геля) этиловым спиртом.

Роль гуминовых соединений в биосфере поистине незаменима. Они выполняют ряд жизненно важных функций, обеспечивая устойчивость окружающей среды к интенсивному антропогенному воздействию и ее способность к самовосстановлению (Косьянова З.Ф. с соавт., 2002).

Гуминовые соединения способны связывать в малоподвижные или труднодиссоциирующие соединения токсичные и радиоактивные элементы, а также соединения, негативно влияющие на экологическую ситуацию в природе, в том числе они могут инкорпорировать некоторые пестициды, углеводороды и фенолы (Косьянова З.Ф. с соавт., 2002).

Обладая высокой физиологической активностью, гуминовые вещества стимулируют прорастание семян, дыхание растений, повышают устойчивость организмов к воздействию неблагоприятных факторов.

Благодаря уникальным возможностям гуминовых веществ интерес ученых к ним возрастает с каждым годом. Исследования, проводимые на протяжении последних десятилетий, способствовали тому, что на сегодняшний день гуматы и продукты их химической модификации находят обширное применение в самых различных областях жизни человека.

Все в большем объеме препараты на основе гуминовых соединений применяются в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста и средств защиты растений от грибковых патогенов, бактериальных и вирусных инфекций. Широко используются гуминовые соединения в сельском хозяйстве таких развитых стран, как США, Канада, страны Западной Европы.

Гуминовые вещества находят применение в животноводстве и птицеводстве как биологически активные добавки к кормам, оказывающие благотворное влияние на процесс роста и продуктивность животных и повышающие неспецифическую резистентность живых организмов (Косьянова З.Ф. с соавт., 2002).

Другим направлением широкого использования препаратов гуминовых веществ является экология. Обладая способностью связывать ионы тяжелых металлов, радионуклиды и органические экотоксиканты, а также значительной физиологической активностью, гуминовые препараты эффективно применяются в целях рекультивации загрязненных и деградированных почв и земель. Помимо всего, перечисленные свойства гуматов позволяют использовать их для очистки природных и сточных вод от различных органических и неорганических примесей, осуществлять детоксикацию бытовых и промышленных отходов, почв и грунтов, загрязненных нефтепродуктами, полициклическими ароматическими соединениями и пестицидами. Сложные экологические проблемы в стране решаются с помощью гуминовых соединений.

В последние полвека многие авторы внесли большой вклад в развитие представлений о гуминовых веществах, в том числе указывали на гуминовые кислоты как на первую стабильную форму органического вещества в условиях почв. Именно гуминовыми кислотами, являющимися основным компонентом гумусовых кислот, определяются все перечисленные выше функции гуминовых веществ.

При гидролизе гуминовых кислот происходит разрушение легко гидролизуемых связей, в результате чего в раствор переходят следующие соединения: аминокислоты, моносахариды, полисахариды и аминосахара.

В гидролизатах обычно обнаруживается от 17 до 22 аминокислот, все они относятся к альфа-типу (аминогруппы в углеродной цепи расположены в альфа-положении по отношению к карбоксильной группировке). Массовая доля аминокислот в гуминовых кислотах довольно высока и составляет 6-10%. Чаще всего встречаются аспарагиновая, глютаминовая кислоты, глицин, аланин. Значительная часть аминокислот, как установлено методами ферментативного гидролиза, образует пептидные связи.

В числе моносахаридов идентифицированы глюкоза (на долю которой приходится до 20%), галактоза, манноза, ксилоза и т.д. Всего они могут составлять до 25% массы гуминовых кислот. Моносахаридные звенья гуминовых кислот связаны между собой глюкозидными связями, образуя, таким образом, полисахаридные цепочки, среди которых большая часть приходится на целлобиозу. Полисахаридные цепочки соединены с основными цепями гуминовых кислот посредством сложноэфирных связей. Содержание аминосахаров в гуминовых кислотах невелико и составляет 1,5-1,9 % в расчете на глюкозамин.

В настоящее время всесторонне исследуется биологически активная пищевая добавка «Толпа» - препарат, изготовленный на основе торфа в Польше. В США, Канаде, странах западной Европы огромное значение придается изучению возможностей применения гуминовых соединений в медицине, поэтому ведется постоянное и интенсивное изучение их разнообразных свойств. Биологическое действие, оказываемое гуминовыми кислотами на живые организмы, связано с влиянием интактных молекул гуминовых веществ и высокомолекулярных остатков их внутриклеточного переваривания, локализующихся в клеточных мембранах или в основном веществе, непосредственно примыкающему к цитоплазматической мембране.

Исследователи, изучающие особенности влияния гуминовых кислот на живые организмы, выявили не только широкий физиологический спектр их действия, но и высокую биологическую активность соединений. Особо важным является то, что исследуемые препараты гуминовых кислот не обладают мутагенным (Севастьянова Н.В., 1998), генотоксическим (Bernacchi F. et al., 1996; Juszkiewicz T. et al., 1997), аллергогенным (Maslinski C. et al., 1993), канцерогенным (Koziorowska J. et al., 1996) действием.

Гуминовые соединения используются в качестве средств, оказывающих антимикробное, противовоспалительное, противоопухолевое, противозудное действие, в ряде случаев, как средство, усиливающее регенерацию (Brzozowski T. et al., 1995; Maslinski C., 1995; Wu W.Z.,1999). В частности, применяемый в настоящее время препарат торфа - гуминат усиливает пролиферацию популяций фибробластов у млекопитающих, стимулирует противоопухолевую резистентность лабораторных животных, оказывает антитоксическое действие, ускоряет рост животных и птиц. Показано, что препарат обладает мембранотропным действием и позитивно влияет на обменные процессы в организме (Уразаев Д.Н. с соавт., 2000). Проведенные исследования доказывают, что гуминат способен моделировать действие экзогенного интерферона. Н.В.Севастьяновой (1998) в культуре клеток Т-лимфоцитов, обработанных циклофосфаном, обнаружен антимутагенный эффект гумизола. Предполагаемый механизм действия гуминовых соединений на регенерацию следующий. Гуминовые соединения стимулируют орнитидиновую декарбоксилазу, что сопровождается повышением содержания спермидина, гистамина и уровня ДНК и РНК (Maslinski C. et al., 1995). В эксперименте у крыс установлено нивелирующее действие гуминовых веществ по отношению к повреждающему действию этанола на слизистую желудка (Brzozowski T., 1995). Гуминовые вещества оказывают стимулирующее влияние на пролиферацию эпителия, ускоряя процесс заживления эндоцервикозов у женщин (Woyton J. et al., 1995) и восстанавливая поврежденную токсическими веществами паренхиму печени (Левитский Е.Ф. с соавт., 1998). Работами Жиляковой Т.П. с соавторами (2004) доказано позитивное влияние гуминового препарата «Торфотон» на регенерацию язвы желудка. На 5 общепринятых моделях экспериментальной язвы желудка показаны антистрессорное, антиульцерогенное, анальгезирующее и адаптогенное действие используемого препарата.

В последние годы широко обсуждаются полученные эффекты влияния гуминовых кислот на живые организмы, относящиеся к различным таксономическим группам. Большая часть позитивных результатов получена на экспериментальных моделях. Установлено уменьшение мутагенности бензапирена по отношению к штаммам Salmonella typhimurium в присутствии гуминовых кислот (Sauvant M.P. et al., 1999). Исследователи связывают выявленный факт с физической адсорбцией мутагена на коллоидных частицах гуминовых веществ.

Изучение в эксперименте на 15 штаммах грам-положительных и грам-отрицательных бактерий патогенеза действия гуминовых кислот показало, что кислоты обладают не только бактериостатическими, но и бактерицидными свойствами. У волонтеров обнаружена стимуляция фагоцитарной и бактерицидной активности гранулоцитов (Bay Z. et al., 1995). Механизмы действия гуминовых соединений связывают с ароматическим характером их структуры и в первую очередь с наличием карбоксильных групп.

Ряд работ посвящен изучению иммуномодулирующих свойств гуминовых веществ. Считается, что иммуномодулирующие свойства гуминовых кислот реализуются за счет стимуляции синтеза интерферона и TNF в крови (Inglot A.D. et al., 1999), повышения фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов (Jancowski A. et al., 1996), снижения антигензависимой выработки иммуноглобулина Е и гистамина. Показано, что гуминовые соединения оказывают дозозависимый эффект на такие иммунологические показатели, как количество Т-лимфоцитов, соотношение их основных субпопуляций (Madey J.A. et al., 1995), спонтанную и индуцированную ФГАЗ экспрессию рецепторов для ИЛ-2, а также на синтез моноцитами ИЛ-1 и ФНО. Гуминовые кислоты стимулируют синтез ИФН и ИФН периферическими лейкоцитами. Предполагают, что иммуностимулирующий механизм действия гуматов реализуется через ферменты аденилатциклазного комплекса (Уразаев Д.Н. с соавт., 2000). Стимулирующий эффект объясняется одновременной активацией аденилатциклазы и ингибированием фосфодиэстеразы, что сопровождается увеличением концентрации внутриклеточной цАМФ. В свою очередь цАМФ активирует 2, 5 - олигоаденилатсинтетазу. На основании полученных результатов авторы делают вывод об индукции гуминовыми кислотами интерфероноподобного эффекта в клетках.

Антиоксидантные свойства гуминовых соединений связаны с их способностью уменьшать выработку MDA (Piotrowska D. et al., 2000). При этом антиоксидантная активность гуминовых соединений приравнивается к таковой витамина Е.

В лабораторных исследованиях обнаружена комплексообразовательная способность гуминовых веществ по отношению к таким ионам тяжелых металлов как медь, кадмий, свинец. Комплексообразование осуществляется путем ингибирования ионов специфичными для металлов ферментами клеток (Glunn A.Y., 1996).

Установлено отсутствие влияния гуминовых кислот на факторы свертывания крови, на длительность кровотечения, время свертывания, тромбиновое и протромбиновое время, концентрацию фибриногена, количество тромбоцитов и их агрегацию (Buczko W. et al., 1995). Вместе с тем гуминовые соединения оказывают антианемическое действие, проявляющееся быстрым увеличением количества эритроцитов за счет стимуляции эритроидного ростка системы кроветворения и ускоренной дифференцировкой активированных эритробластов в эритроциты. Гуминовые кислоты нивелируют у подопытных животных нарушенный в эксперименте обмен веществ и кислотно-щелочное равновесие (Banaczkiewicz W. et al., 1996).

Демин В.В. с соавторами (2004) сформулировали гипотезу относительно патогенеза позитивного действия гуминовых веществ. Сущность гипотезы заключается в следующем. Гуминовые кислоты сорбируются на наружной поверхности цитоплазматических мембран клеток, образуя «ажурную сетку», свободно пропускающую в цитоплазму клетки элементы минерального происхождения и низкомолекулярные органические соединения. Одновременно они прочно связывают токсичные для клетки ионы тяжелых металлов и свободные радикалы, присутствующие во внешней среде. Подобное избирательное связывание токсических веществ снижает энергозатраты клетки на устранение негативного эффекта, вызванного проникновением ксенобиотиков во внутриклеточную среду. В итоге увеличивается устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Высвобождаемая при этом энергия направляется на интенсификацию процессов клеточного деления, реализуемых ускорением развития организма.

Необходимо учитывать, что эффект, оказываемый гуминовыми веществами, во многом определяется их макро- и микроэлементным составом, способом получения и характером торфяников. Изучаемый авторами препарат, содержащий в своей основе гуминовые соединения, получен путем водного экстрагирования из торфов Верхне-Волжского региона в лаборатории, возглавляемой д.т.н., профессором Ю.А. Калинниковым (Институт химии растворов РАН). Препарат представляет собой раствор без вкуса и запаха, темно-бурой окраски, содержащий гуминовые соединения и следующий набор микроэлементов: Fe, Na, Mg, K, Mn, Cu.

По данным элементного анализа содержание основных элементов в сухом препарате гумусовых кислот составляет: С - 45.2 %, Н - 4.9 %, О - 34.3 %, N - 6.1%, S - 0.5%.

По данным атомно-абсорбционной спектроскопии содержание микроэлементов в мкг/мл: Fe - 1.9, Na - 0.3, Mg - 0.06, Mn - 0.01, Zn - 0.02.

Содержание основных кислородсодержащих функциональных групп в гумусовых кислотах (в мэкв/г): общая кислотность - 9.5, карбоксильные - 5.3, фенольные гидроксилы - 4.2, карбонильные - 17.6, хинонные - 1.35

Таким образом, препарат является принципиально новым, поэтому актуальность изучения его влияния на живые организмы не вызывает сомнения.

1.2. Методы исследования

В эксперименте использованы 16 лабораторных беременных крыс линии Вистар, 98 плодов и их последов, полученных от самок.

У всех самок создавали модель недостаточности МПК по методу Н.Л. Гармашевой и Н.Н. Константиновой (1978). На 15 день беременности у крыс лигировали 1/3 пучка преплацентарных артерий у каждого плодовместилища левого рога матки. Преплацентарные артерии и плоды правого маточного рога оставались интактными. Экспериментальное нарушение маточно-плацентарного кровообращения (МПК) у животных проводили под этаминал-натриевым наркозом в дозе 40 мг/кг.

От самок (n=8), получавших на протяжении всей беременности чистую воду в стандартных поилках, получено 30 плодов и последов из интактного правого маточного рога, составивших группу контроля (1 группа). Плоды (30) и последы (30) из левого маточного рога с лигированными преплацентарными артериями составили группу сравнения (2 группа) с экспериментально нарушенным маточно-плацентарным кровообращением.

От крыс (n=8), получавших per os гуминовые соединения, с водой в стандартных поилках, в дозе 10 мг/кг массы тела в течение всей беременности, из маточного рога с лигированными преплацентарными артериями получено 38 плодов и последов, которые составили основную группу с коррекцией нарушений маточно-плацентарного кровообращения гуминовыми соединениями (3 группа). Во всех трех группах кроме плодов и последов изучались сегменты маточных рогов и плацентарное ложе.

На втором этапе эксперимента с целью изучения морфологических изменений в тимусе, селезенке и надпочечниках потомства использовано 20 крыс линии Вистар и 196 плодов. Согласно цели исследования, экспериментальные животные были разделены на 2 группы: 1 группа - интактные беременные крысы, контроль (n=10); 2 группа - самки, получавшие гуминовые соединения (n=10). От самок из группы контроля получено 92 плода, от самок из опытной - 104 плода.

На 21 день беременности, за день до предполагаемых родов, проводили эвтаназию животных с помощью этаминал-натрия в дозе 60 мг/кг, затем осуществляли аутопсию самок и плодов.

Для оценки выраженности токсического действия гуминовых соединений рассчитывали следующие показатели:

· преимплантационную гибель - количество желтых тел в яичниках, относительно числа мест имплантации яйцеклеток в матке;

· постимплантационную гибель - количество участков резорбции яйцеклеток в матке, относительно общего числа мест имплантации;

· плодовитость крыс, вес крысят и наличие видимых уродств.

Проведено комплексное морфологическое исследование последов, тимусов, селезенок и надпочечников плодов на органном, тканевом и клеточном уровнях, включающее следующие методы:

макроскопическое изучение последов;

соматометрия плодов;

органометрия: линейные параметры органов, масса, объем, площадь материнской поверхности последов;

обзорная гистология (окраска гематоксилином и эозином);

гистостереометрия (100- точечной сеткой по 6 линиям сканирования и с помощью автоматизированной программы Видео-ТесТ Мастер «Морфология 4.0»);

гистохимические методы (окраска по методу ван-Гизона, Браше, Фельгена, PAS-реакция по Мак-Манусу);

иммуногистохимическое исследование плаценты и плацентарного ложа с выявлением васкуло-эндотелиального фактора роста и фактора Виллебранда;

полутонкие срезы (окраска метиленовым синим и метил-азур II фуксином);

трансмиссионная электронная микроскопия.

Статистическая обработка полученных результатов исследования выполнена с помощью программного обеспечения «Excel». Предварительно определяли тип распределения вариационного ряда. При нормальном распределении вычисляли средние арифметические значения, ошибки средних арифметических. Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании t-критерия Стьюдента.

1.3 Патоморфология последов крыс в условиях нарушенного маточно-плацентарного кровообращения

Плаценты при нарушении маточно-плацентарного кровообращения в эксперименте губчатой консистенции, розово-красного цвета в 86,7% случаев овальной формы. Конфигурация органа в 13,3% неправильная - многоугольная. Материнская поверхность органов темно-красная с мелкоточечными кровоизлияниями. В отличие от нее плодовая поверхность цианотичная, в 40% случаев с плотным белесоватым ободком по периферии. Пупочный канатик в большинстве случаев с парацентральным прикреплением. Сосуды пуповины резко полнокровны, умеренно извиты. Внеплацентарные оболочки бледно-серые, полупрозрачные с полнокровными сосудами.

Органометрические параметры плаценты и длина пуповины достоверно снижены по сравнению с группой контроля (табл. 1).

При гистологическом исследовании в базальной части плацент крыс, преимущественно в краевых отделах, выявлен тромбоз материнских сосудов с количественным преобладанием париетальных тромбов и единичными обтурирующими. Локализация тромбов объясняется тем фактом, что в эксперименте проводили лигирование преимущественно латеральной части пучка. Периваскулярно обнаруживаются инфильтраты из полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Базофильные клетки базального отдела плаценты с очаговой альтерацией в виде пикноза ядер и вакуолизацией цитоплазмы. Единичные гликогеновые клетки или их очаговые скопления, особенно в периваскулярных зонах, чаще с резко вакуолизированной цитоплазмой, реже в состоянии некробиоза, некроза и явлениями кариорексиса и лизиса. Цитоплазма клеток дает отрицательную PAS-реакцию. Кроме того, в базальном отделе значительно увеличены периваскулярные и перицеллюлярные отложения фибриноида. Участки фибриноидного некроза в местах перехода в децидуальную ткань значительно расширены. В краевых отделах лабиринтной части плаценты субхориально встречаются зоны ишемии ткани, представленные пустыми и спавшимися материнскими лакунами. Площади материнских лакун достоверно снижена по сравнению с контролем (р<0,001; табл. 2). Напротив, материнские синусы центральных отделов дилятированы, полнокровны с явлениями стаза и сладжирования эритроцитов в них. Площадь плодовых капилляров достоверно уменьшена во всех отделах (р<0,001; табл. 2). В капиллярах наблюдается стаз эритроцитов. Среди трофобласта лабиринтного отдела, разделяющего материнский и плодовый кровоток, встречаются клетки с вакуолизированными ядрами.

Гистостереометрическое исследование выявило достоверное снижение удельного объема материнского (материнские синусы, сосуды базального отдела) и плодового сосудистого русла за счет увеличения доли фибриноида и таких патологических очагов как тромбозы материнских артерий, сладжирование эритроцитов, периваскулярное воспаление, альтерационные изменения структур последа (табл. 3).

Структурные компоненты амниотической оболочки, как эпителий, так и строма, в состоянии альтерации, которая завершается расширением полосы фибриноидного некроза и разрушением апикальной части клеток амниотического эпителия. В последних обнаружены мелкие PAS-положительные гранулы.

Среди артерий плацентарного ложа матки в соотношении 1:3 встречаются сосуды с неполной гестационной перестройкой стенки. Последняя истончена и представлена пучками гладкомышечных и коллагеновых волокон. Такие артерии имеют узкий щелевидный просвет. Число сосудов плацентарного ложа на единицу площади составляет 5,0±0,31 мм 2.

При иммуногистохимическом исследовании выявлено, что фактор Виллебранда локализуется в эндотелии материнских сосудов, периваскулярных базофильных клетках базального отдела, а также в клетках трофобласта лабиринтного отдела плаценты. При этом количество позитивных клеток составляет 80-100%, а средний гистохимический коэффициент достоверно превышает контрольные значения (табл. 4). В плацентарном ложе имеется тенденция к увеличению фактора Виллебранда в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторго русла по сравнению с контрольной группой.

Позитивная реакция с васкуло-эндотелиальным фактором роста наблюдается лишь в 30-40% базофильных клеток плаценты и таком же количестве децидуальных клеток плацентарного ложа. Выраженность реакции достоверно ниже контрольных значений (табл. 5).

Следовательно, развивающиеся при нарушении маточно-плацентар-ного кровообращения в эксперименте расстройства кровообращения в виде тромбозов артерий базального отдела, ишемии краевых отделов лабиринта и деструкции структурных компонентов последа с увеличением доли фибриноида, некробиозом-некрозом клеток базального и лабиринтного отделов являются морфологическим субстратом плацентарной недостаточности. Адаптивные процессы, проявляющиеся гиперемией материнских синусоидов центральных отделов плацент, являются неэффективными вследствие развивающихся стазов и сладжирования эритроцитов. Повышение уровня фактора Виллебранда, являющегося индикатором повреждения эндотелия, и уменьшение васкуло-эндотелиального фактора роста свидетельствуют об эндотелиальной дисфункции и нарушениях ангиогенеза в плацентах и плацентарном ложе. Следствием сформированной плацентарной недостаточности является отставание плода в своем развитии от срока гестации, что подтверждается достоверным снижением его соматометрических показателей по сравнению с контролем (табл. 6).

1.4 Структурные перестройки в последах при коррекции гуминовыми соединениями экспериментальных нарушений маточно-плацентарного кровообращения

В группе с коррекцией экспериментального нарушения маточно-плацентарного кровообращения природными гуминовыми соединениями, получено 38 плодов и последов. Плаценты округлой (64,2%) и овальной (15,8%) формы, губчатой консистенции, темно-красного цвета. Пупочный канатик с центральным и парацентральным прикреплением, сосуды умеренно полнокровны. Масса, объем плацент, а также длина пупочного кантика достоверно выше показателей 2 группы (табл. 1)

При гистологическом исследовании в плацентах диагностированы реакции адаптации с участием систем материнского и плодового кровообращения, проявляющиеся дилятацией и полнокровием сосудов базальной части плаценты, материнских лакун и плодовых капилляров лабиринтного отдела. В краевых отделах последов площадь структур, обеспечивающих материнский кровоток, достоверно меньше, чем в группе контроля (р<0,05), что является следствием лигирования латеральной части пучка преплацентарных артерий.

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что в плацентах при применении гуминовых соединений по сравнению с группой, в которой не осуществлялась коррекция нарушений кровообращения преобладают приспособительные реакции как в центральных, так и в краевых отделах плацент с достоверным увеличением площади материнских синусоидов и плодовых капилляров (р<0,001). При этом в центральных отделах степень дилятации сосудов достоверно превышает контрольные значения (р<0,001%; табл. 2). Закономерен и тот факт, что указанные процессы отражаются и на значениях удельного объема материнского и плодового кровеносного русла (табл. 3).

Реологические нарушения плацентарного кровообращения, представленные очаговыми стазами в плодовых капиллярах, менее выражены, чем во 2 группе.

Достоверно уменьшена удельная доля фибриноида и патологических очагов, представленных дистрофически и некробиотически измененными базофильными клетками и очагами периваскулярной лейкоцитарной инфильтрации. В гликогеновых клетках, расположенных в лабиринте и базальном отделе, выявляется большое количество PAS-положительного материала. Клетки трофобласта богаты ДНК и РНК.

Сосуды амниотической оболочки умеренно полнокровны. В клетках амниотического эпителия выявляются средние и крупные PAS-положительные амилазочувствительные гранулы, что свидетельствует об активизации параплацентарного транспорта и энергетического обмена под влиянием гуминовых соединений.

В плацентарном ложе маточного рога обнаружены преплацентарные артерии с признаками полноценной гестационной трансформации. Стенка артерий полностью замещена фибриноидом и содержит клетки внутрисосудистого цитотрофобласта. Кроме перечисленного, дополнительно формируется коллатеральное кровообращение с образованием мелкокалиберных артериальных сосудов с узким просветом. Число артерий плацентарного ложа на единицу площади составляет 6,56±0,31 мм-2, что достоверно выше показателей контрольной и 2 группы (р<0,05 и р<0,001, соответственно) и связано, по нашему мнению, с ангиопролиферативным эффектом гуминовых соединений.

Фактор Виллебранда достоверно снижен в эндотелиальных и трофобластических клетках плаценты и плацентарного ложа матки по сравнению с группой, где коррекция нарушений кровообращения не проводилась. Однако значения среднего гистохимического коэффициента данной реакции превышают контрольные показатели (табл. 4).

В базальном отделе плаценты под влиянием гуминовых соединений повышается синтез васкуло-эндотелиального фактора роста в базофильных клетках периваскулярных зон. При этом количество положительно окрашенных клеток достигает 75-100%. В плацентарном ложе матки уровень продукции данного фактора в эндотелиальных, децидуальных и гладкомышечных клетках имеет аналогичную тенденцию. Значения среднего гистохимического коэффициента реакции с васкуло-эндотелиальным фактором роста в плаценте и плацентарном ложе достоверно превышают показатели 2 и контрольной групп (табл. 5). Иммунногистохимическая реакция наиболее выражена в зонах роста новых сосудов плацентарного ложа.

Таким образом, гуминовые соединения, применяемые для коррекции экспериментального нарушения маточно-плацентарного кровобращения, стимулируют формирование адаптивных реакций. К последним относятся дилятация и гиперемия сосудов материнского и плодового звена плацентарного кровообращения, активация энергетических процессов и параплацентарного обмена, а также ангиопротективное и стимулирующее действие с формированием коллатерального кровообращения, связанные с повышением продукции васкуло-эндотелиального фактора роста. Гуминовые вещества, влияя на продукцию фактора Виллебранда, нормализуют реологические свойства крови. Адаптивные процессы уменьшают повреждение плацентарных структур и нивелируют созданную в эксперименте плацентарную недостаточность. Плоды в данной группе соответствуют сроку гестации, без признаков задержки внутриутробного развития, более того их соматометрические показатели достоверно превышали значения 2 группы (р<0,001; табл. 6).

1.5 Морфологические изменения в тимусе, селезенке и надпочечниках потомства крыс

Тимус плодов от самок крыс, получавших во время беременности гуминовые соединения из торфа, представлен двумя долями округлой или овальной формы, с поверхности и на разрезе белесовато-серого цвета, эластичными по консистенции. Доли со всех сторон окружены соединительной тканью. Средняя масса органа достоверно больше показателя контрольной группы (1 гр. - 7,30,2; 2 гр. - 7,9±0,2 мг; р<0,05).

Орган с поверхности покрыт тонкой соединительнотканной капсулой. Среди матрикса кроме соединительнотканных клеток встречаются функционально активные единичные бластные формы, пролимфоциты, эозинофилы, зрелые лимфоциты и эпителиальные клетки.

Тимус имеет дольчатое строение. От тимусов плодов контрольной группы органы отличаются увеличением размера долек. Наряду с мелкими и средними в вилочковых железах до 30-40% паренхимы составляют крупные дольки с формирующимися как у взрослых крыс неполными септами. Как соединительная ткань, так и паренхима органа хорошо кровоснабжаются, что подтверждается увеличением числа полнокровных сосудов.

В дольках тимуса субкапсулярно расположены крупные ретикулоэпителиальные клетки с большими несколько вытянутыми овоидными по форме эухроматичными ядрами и базофильной цитоплазмой. Реже клетки лежат изолированно, чаще формируют группы из пяти-шести. Структура и функциональная активность клеток в группах различна. Среди высокофункциональных ретикулоэпителиальных клеток с крупными эухроматичными ядрами и субмембранной конденсацией хроматина встречаются 2-3 клетки с пикнозом или рексисом ядер и цитоплазмы.

В субкапсулярных отделах преобладают юные тимоциты, обнаруживаются немногочисленные бласты и пролимфоциты. Лимфоциты содержат в цитоплазме большое количество органелл, в частности полирибосом и митохондрий. Среди клеточных популяций паренхимы в толще коркового вещества расположены более крупные по размерам ядер ретикулоэпителиальные клетки второго типа. Ядра клеток вариабельные по форме - округлые, бобовидные, вытянутые, но независимо от формы эухроматичные, содержат одно эксцентрично расположенное ядрышко.

Увеличивается число зон формирования мозгового вещества в тимусах. В указанных зонах локализуются достаточно разнообразные по форме ядер и функциональному состоянию клетки ретикулоэпителия. Наряду с одиночным расположением клетки формируют мелкие группы (из 3-4), реже из большого числа клеток (14-20). В мелких группах целостность ядер и клеток не нарушена. Ретикулоэпителиальные клетки в центре клеточных ассоциаций имеют форму «перстневидных» за счет участков разрежения и вакуолизации цитоплазмы.

Формообразование телец Гассаля в тимусе находится на начальных этапах. Тимические тельца формируются в зонах группового скопления ретикулоэпителиальных клеток. В пограничной зоне между корковым и мозговым веществом и в формирующемся мозговом веществе визуализируется большое количество капилляров.

Относительная площадь коркового вещества тимуса плодов увеличена, по сравнению с контролем (1 гр. - 74,440,78%, 2 гр. - 78,240,75%, р<0,01). Как в корковом, так и мозговом веществе тимусов плодов данной группы увеличено процентное содержание малых и средних тимоцитов и достоверно уменьшено количество больших лимфоцитов и бластных форм клеток (табл. 7). Кроме того, в мозговом веществе достоверно увеличено количество телец Гассаля (р<0,01).