Анализ роли мотива ArgH52–GluH61 в связывании антигенов антителами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курсовая работа

по теме: Анализ роли мотива ArgH52-GluH61 в связывании антигенов антителами

Курсовую работу выполнил

ученик 10 «Н» класса СУНЦ МГУ

Петров Артем

под руководством

Колясникова О.В.

Аржаника В.К.

Москва, 2014

Введение

Иммунная система - одна из важнейших систем во всех организмах. Но только у позвоночных появляются антитела (иммуноглобулины) - белки, способные специфически распознавать антиген (чужеродный агент) и связываться с ним. Антитела являются основной составляющей специфического иммунитета. Изучение особенностей связывания антител и антигенов и выявление закономерностей в этой области является важнейшей частью разработки вакцин и улучшения уже существующих. В этой работе я сфокусировался на изучении особенностей связывания аминокислотной последовательности, находящейся в одной из канонических структур антитела. Результаты этой работы позволят понять механизмы связывания аминокислот, входящих в одну из канонических структур, с антигеном, а также, методы, описанные в этой работе, возможно, позволят повысить аффинность антител с данным аминокислотным мотивом.

антитело антиген вакцина аминокислотный

1. Общие сведения

Антитела (иммуноглобулины) - это разновидность белков, содержащихся в плазме крови и тканевых жидкостях позвоночных животных, способных специфично связываться с определенным антигеном. На данный момент у большинства животных обнаружено 5 типов антител: IgM, IgD, IgA, IgG, IgE. Антитела разных классов различаются по размеру, заряду белковой молекулы и аминокислотному составу. В моей курсовой работе я буду в основном обсуждать иммуноглобулины класса IgG, как наиболее типичных представителей антител. Молекула антитела этого класса содержит четыре полипептидные цепи- 2 тяжелые (heavy chains, HC) и 2 легкие (light chains, LC). В состав каждой из легких цепей входят 2 домена - один изменяющийся (вариабельный) и один постоянный (неизменяющийся, константный) (Рис.1). Структура каждого из доменов стабилизирована за счет внутренних дисульфидных связей. Дисульфидные связи скрепляют две тяжелые цепи между собой, а также тяжелые и легкие цепи. Каждая пара вариабельных доменов в соседних тяжелой и легкой цепях образуют вариабельный фрагмент (Fv- фрагмент). Однако уровень вариабельности внутри этих фрагментов распределен неравномерно (Рис.2). Самая высокая изменчивость наблюдается в так называемых «гипервариабельных» областях- hypervariable loops. В третичной структуре эти области имеют вид петель, и они же и являются регионами, определяющими комплементарность антитела к антигену, то есть именно они связывают антиген и определяют специфичность иммуноглобулина. Эти регионы называются CDR (Complementarity Determining Region). В одном вариабельном фрагменте выделяют 6 CDR, по три на тяжелую и легкую цепь соответственно. Однако в иммуноглобулине CDR не занимают всю N-концевую часть вариабельного фрагмента, они чередуются с относительно константными участками (каркасными участками, FR- Framework Regions), которые поддерживают третичную структуру вариабельных фрагментов и всего вариабельного домена.

Ген вариабельного домена тяжелой цепи представляет собой совокупность последовательностей ДНК, принадлежащих трем классам: V (variable), D (diversity) и J (joint). Ген вариабельного домена легкой цепи представлен лишь V и J фрагментами. Ген каждого CDR в каждом отдельно взятом иммуноглобулине появляется в результате рекомбинации фрагментов генов, принадлежащих этим классам, и именно поэтому сайт связывания каждого антитела индивидуален (Рис.3). Последующее за рекомбинацией созревание антител повышает их специфичность. Созревание антител проходит в два этапа - соматическая гипермутация и отбор наиболее удачных клонов антител. В процессе соматической гипермутации происходит генерация множества вариантов антител, которые возникают при точечных мутациях в генных сегментах, кодирующих вариабельные домены антител. Далее происходит процесс отбора наиболее удачно получившихся иммуноглобулинов через процесс презентации антигена T-лимфоцитами В-лимфоцитам. Если на мембране В-лимфоцита оказывается высокоаффинное антитело (антитело, способное прочно ассоциироваться с антигеном), то происходит активация В-лимфоцита, а если этого не происходит, то это означает, что антиген диссоциировал, и иммуноглобулин подвергается дальнейшим мутагенным преобразованиям. Полученные антитела называются зрелыми.

2. Цель работы

В каждом антителе CDR полностью индивидуальны. Однако, несмотря на это, роль некоторых аминокислотных остатков на конкретных позициях в аминокислотной последовательности CDR строго фиксирована. В каждом CDR наблюдаются консервативные и неконсервативные аминокислотные мотивы. Консервативные мотивы - это аминокислотные последовательности, которые встречаются с достаточной регулярностью у разных антител в одних и тех же позициях. Неконсервативные мотивы - это последовательности аминокислот, которые не встречаются на фиксированных позициях у различных антител. Целью моей работы было изучение консервативного мотива, находящегося в CDR H2, начинающегося с 52 позиции, на которой стоит аминокислота аргинин, и заканчивающегося на 61 позиции, на которой стоит глутаминовая кислота (глутамат). Данный мотив входит в каноническую структуру H2-12-1. При физиологических значениях pH боковая цепь аминокислоты аргинина заряжена положительно (Рис.4), а глутаминовой кислоты - отрицательно (Рис.5). Данный консервативный мотив играет большую роль в связывании антигена антителом и имеет определенную функцию. Конформацией данного мотива является петля, начало и конец которой образуются аргинином Н52 и глутаматом Н61 (Рис.6).

3. Задачи работы

В качестве задач можно выделить несколько этапов работы. Первый этап - это сбор выборки антител, имеющих данный консервативный мотив. Этот этап был осуществлен с помощью общей базы данных рентгеновских структур антител. На втором этапе работы были проведены необходимые измерения, касающиеся параметров связывания. Были измерены расстояния от заряженных атомов боковых цепей аргинина Н52 и глутаминовой кислоты Н61 до отрицательно заряженного атома карбоксильной или фосфатной группы антигена, а также, между заряженными атомами боковых цепей аргинина Н52 и глутаминовой кислоты Н61. Также, был измерен угол, под которым располагались заряженные атомы (Рис.7). Третий этап работы был посвящен сбору статистической информации, то есть, с какой частотой встречается этот мотив среди всех рентгеновских структур антител, а также как часто он непосредственно участвует в связывании. Четвертый этап - это выяснение механизмов и параметров связывания. Пятый этап был посвящен сбору информации по остальным аминокислотным мотивам с заряженными аминокислотными остатками в позициях Н52 и Н61. Для их изучения были применены методы исследования, описанные выше, в ходе которых были выяснены некоторые возможности для повышения аффинности связывания антител с консервативным мотивом Arg H52 - GluH61.

4. Результаты

В базе данных ренгеновских структур антител, насчитывающей 1705 структур, встречаются 67 антител (18 индивидуальных структур), где есть консервативный мотив ArgH52 - GluH61. Следовательно, антитела с данным мотивом составляют порядка 4% всех антител, для которых имеются рентгенографические данные. Проанализировав структуры с мотивом, мной был сделан вывод, что в 66 из 67 случаев мотив ArgH52 - GluH61 участвует в связывании антигена. Далее был установлен механизм взаимодействия мотива и антигена. Как уже говорилось, началом и концом данной консервативной структуры являются положительно заряженный аргинин и отрицательно заряженная глутаминовая кислота соответственно. Если обратить внимание на координацию данного мотива относительно отрицательно заряженной при нейтральном значении рН функциональной группы в антигене, то можно заметить типичную для данного мотива картину связывания: положительно заряженный аргинин находится между двумя отрицательно заряженными карбоксильными группами антигена и глутаминовой кислоты соответственно (Рис.8). Проанализировав данную структуру, можно сделать вывод о механизме связывания: положительно заряженный атом азота в аргинине Н52 образует ионную пару с отрицательно заряженным атомом кислорода в функциональной группе антигена. Функция глутаминовой кислоты на позиции Н61 заключается в координации боковой цепи аргинина, имеющей большую степень свободы, в наиболее выгодной для связывания точке пространства.

После сбора информации и анализа всех мотивов с заряженными аминокислотными остатками в позициях Н52 и Н61 структуры были разделены на несколько классов. В первый класс попали антитела с мотивом AspH52 - AspH61. Данный мотив не образует петли и периодически участвует в связывании. Второй класс мотивов - ArgH52 - AspH61. Данный мотив не участвует в связывании, но имеет конформацию петли. Но особый интерес для работы представляет третий класс мотивов - ArgH52 - LysH61. Данный мотив образует петлю, на концах которой стоят аминокислота аргинин в позиции H52, заряженная положительно при физиологических значениях pH и аминокислота лизин в позиции H61, также заряженная положительно (Рис.9). Данный мотив также участвует в связывании отрицательно заряженных групп в антигене, но делает это, по-видимому, гораздо эффективнее, чем мотив ArgH52 - GluH61. Два положительно заряженных остатка координируются так, что отрицательно заряженная карбоксильная группа находится между ними (Рис.10). Таким образом, отрицательный заряд распределяется между двумя положительно заряженными остатками, что приводит к понижению энергии связывания по сравнению с взаимодействием с одним положительно заряженным остатком, как в случае мотива ArgH52 - GluH61. Далее я начертил треугольник, образованный заряженными атомами азота в ArgH52, кислорода в GluH61 и кислорода в карбоксильной группе антигена. Такая же операция была проделана для мотива ArgH52 - LysH61. Начертив вектор напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров в треугольниках с мотивом ArgH52 - GluH61 и ArgH52 - LysH61, можно увидеть, что в первом случае вектор направлен в сторону от полости связывания, а последнем - в сторону антигена (Рис.11). Это может означать, что аффинность связывания выше в случае мотива ArgH52 - LysH61. При наличии мотива ArgH52 - GluH61, входящего в каноническую структуру H2-12-1, и, заменив глутаминовую кислоту в 61 позиции на лизин, существует возможность достижения некоторого повышения аффинности данных антител.

Выводы

1) Мотив ArgH52 - GluH61, входящий в каноническую структуру H2-12-1, встречается в 4% антител, для которых имеются рентгенографические данные;

2) В 66 из 67 антител данный мотив непосредственно участвует во взаимодействии с антигеном;

3) Функция аминокислоты аргинина в данном мотиве фиксирована: положительно заряженный атом азота в ее боковой цепи образует ионную пару с отрицательно заряженной группой антигена;

4) Функция глутаминовой кислоты также определена: отрицательно заряженная карбоксильная группа в составе ее боковой цепи координирует боковую цепь аргинина в наиболее выгодной для связывания точке пространства.

Список литературы

1) “Иммунология” А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл. Издательство “Мир”, 592 с.

2) “Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности” Е. П. Альтшулер, Д. В. Серебряная, А. Г. Катруха. Успехи биологической химии. т.50, с. 203-258, 2010.

3) “Interaction of antibodies with small aromatic ligands: the role of р-stacking” Vladimir Arzhanik, Oleg Koliasikov, Darjia Svistunova, Alexey M. Egorov. Journal of bioinformatics and computational biology, Vol. 8 №3, pages 471-483, 2010.

4) “Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography” Robert M. MacCallum, Andrew C. R. Martin and Janet M. Thornton. Journal of Molecular Biology, Vol.262, issue 5, pages 732-745, 1996.

5) “Identification of specificity-determining residues in antibodies” Eduardo A. Padlan, Chantal Abergel and Jennifer P. Tipper. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology, Vol.9, №1, pages 133-139, January 1995

6) “Antigen-antibody interface properties: Composition, residue interactions, and features of 53 non-redundant structures” Thiruvarangan Ramaraja, Thomas Angelb, Edward A. Dratzc, Algirdas J. Jesaitisd, and Brendan Mumey. Journal of Biochemistry and Biophysics. Vol.1824, issue 3, pages 520-532. March 2012.

7) “Use of amino acid composition to predict epitope residues of individual antibodies” Shinji Soga, Daisuke Kuroda, Hiroki Shirai, Masato Kobori and Noriaki Hirayama. Journal: Protein Engineering, Design and Selection, Vol.23 , Issue 6, pages 441-448, 2010.

8) “Crystal structure of the complex of a catalytic antibody Fab fragment with a transition state analog: Structural similarities in esterase-like catalytic antibodies” Jean-Baptiste Charbonnier, Elisabeth Carpenter, Benoit Gigant, Beiatrice Golinelli-Pimpaeau, Zelig Eshhar, Bernard S. Green and Marcel Knossow. Journal “PNAS” vol. 92 №. 25, pages 11721-11725. December 1995.

9) “A new clustering of CDR loop conformations” Benjamin North, Andreas Lehmann, Roland L. Dunbrack Jr. Journal of Molecular Biology. 406(2): pages 228-256. 2011 February 18.

Иллюстрации

(Рис.1)- Схема общего строения иммуноглобулина, пунктиром обведен вариабельный фрагмент, тяжелые и легкие цепи (тяжелые цепи показаны голубым цветом, легкие - зеленым).

(Рис.2)- Распределение вариабельности в вариабельном домене, показаны CDR и их расположение. На первой картинке - схема (обозначены CDR в легкой и тяжелой цепях, антиген обозначен желтым, зеленым показаны легкие цепи, голубым - тяжелые), на второй - реальное расположение CDR в вариабельном фрагменте (красным обозначена реальная форма и расположение CDR в вариабельном домене тяжелой цепи).

(Рис.3)- Схема V(D)J рекомбинации генов при формировании тяжелой цепи (CDR H3 в частности). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. На первой стадии удаляются ненужные сегменты генов классов D и J. Далее идет рекомбинация сегментов этих классов, до образования единого DJ комплекса. На третьей стадии удаляются ненужные фрагменты гена класса V. Затем идет рекомбинация DJ и V фрагментов, образуя единый кодирующий участок- VDJ, который кодирует вариабельные домены. Также, в геноме антитела будет присутствовать ген C, кодирующий константные домены.

(Рис.4) - Остаток аминокислоты аргинина, атом азота, заряженный положительно при физиологических значениях pH в боковой цепи, показан “+” знаком.

(Рис.5) - Остаток глутаминовой кислоты, карбоксильная группа в боковой цепи, заряженная отрицательно при физиологических значениях pH, показана знаком “- ” .

(Рис.6) - Третичная структура аминокислотного мотива ArgH52 - GluH61, представляющая из себя петлю, началом и концом которой являются аргинин и глутаминовая кислота соответственно. Фиолетовым показан ArgH52, желтым - GluH61. Спиралью показана б-спираль, стрелкой - начало в-листа.

(Рис.7) - На картинке слева изображены расстояния между заряженными атомами кислорода глутаминовой кислоты (изображена желтым) и карбоксильной группы антигена (5,6 Ангстрем), а также положительно заряженным атомом азота аргинина (3,0 и 3,3 Ангстрем соответственно, показан фиолетовым). На картинке справа показан угол между этими атомами (127,8?).

(Рис.8) - Положительно заряженный аргинин (показан фиолетовым) находится между двумя отрицательно заряженными карбоксильными группами антигена и глутаминовой кислоты (показана желтым). Положительно заряженный атом азота в аргинине, показанный значком “+”, образует ионную пару с отрицательно заряженным атомом кислорода в карбоксильной группе антигена, показанным красным и значком “-” . Отрицательно заряженный атом кислорода в карбоксильной группе боковой цепи глутаминовой кислоты, показанный желтым и значком “-”, оказывает координирующее воздействие на боковую цепь аргинина.

(Рис.9) - На картинке слева показан положительно заряженный при физиологическом значении pH остаток аминокислоты лизина. Положительно заряженный атом азота в боковой цепи показан значком “+”. На картинке справа показана третичная структура мотива ArgH52 - LysH61, представляющая из себя петлю, началом и концом которой являются аргинин и лизин соответственно. Фиолетовым показан ArgH52, оранжевым - LysH61.Спиралью показана б-спираль, стрелками показаны начала в-листов.

(Рис.10) - Два положительно заряженных остатка аргинина, показанного фиолетовым, и лизина, показанного оранжевым, координируются так, что отрицательно заряженная карбоксильная группа находится между ними.

(Рис.11) - На картинке слева изображен вектор DK напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров (точка D) в случае мотива ArgH52 - GluH61. На этой картинке сверху изображена карбоксильная группа антигена, заряженная отрицательно, справа - атом азота в боковой цепи аргинина, заряженный положительно, а снизу - отрицательно заряженный атом кислорода боковой цепи глутаминовой кислоты. Ясно видно, что напряженность поля направлена в противоположную сторону от антигена. На картинке справа показан вектор DH напряженности электрического поля в точке пересечения серединных перпендикуляров (точка D) в случае мотива ArgH52 - LysH61. На данной картинке снизу изображена карбоксильная группа антигена, справа - положительно заряженный атом азота в боковой цепи аргинина, а слева - положительно заряженный атом азота в боковой цепи лизина. В этом случае наоборот, напряженность поля направлена в сторону антигена. Это показывает, что аффинность связывания во втором случае выше, чем в первом.

Размещено на Allbest.ru