Влияние специфических антител на процесс элиминации вируса клещевого энцефалита

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВЛИЯНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ПРОЦЕСС ЭЛИМИНАЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Г.Н. Леонова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова»

Известно, что у лиц, вакцинированных против вируса клещевого энцефалита (КЭ), формируется разный уровень специфического иммунного ответа.

Цель работы: показать в динамике экспериментальной инфекции противовирусную активность специфических антител по отношению к вирусу клещевого энцефалита (КЭ).

Материалы и методы: эксперименты проведены in vitro (на модели клеточной культуры СПЭВ) и in vivo - на модели белых мышей 12-14 г. В работе был использован высоковирулентный штамм Dalґnegorsk (Dal) вируса КЭ и иммуноглобулин против КЭ производства «НПО «Микроген».

Результаты. Показана разная степень ингибирующего действия специфических антител против вируса клещевого энцефалита в титрах 1:100, 1:400 и 1:3200. Антитела с титром 1:400, обладая прямым противовирусным действием по отношению к эпидемически значимой дозе (3 lg ТЦД₅₀) вируса КЭ, могут быть эффективны только на ранних стадиях инфекционного процесса; антитела с титром 1:3200 защищают от вируса во все сроки наблюдения (3-72 часа).

Сделано заключение: у лиц, получивших курс специфической вакцинации, имеющих титр антител к вирусу КЭ 1:800 и выше, очередную ревакцинацию можно перенести на следующий год. В предэпидемический сезон этим лицам рекомендовано исследовать кровь на напряженность иммунитета к вирусу КЭ для решения вопроса о сроках ревакцинации.

Ключевые слова: клещевой энцефалит (КЭ), вирус клещевого энцефалита, антитела, противовирусное действие

G.N. Leonova

INFLUENCE OF SPECIFIC ANTIBODIES ON THE TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ELIMINATION PROCESS

Well known that persons vaccinated against tick-borne encephalitis (TBE) virus, formed by different levels of a specific immune response.

The aim of the study is to show the antiviral activity of specific antibodies against the TBE virus in experimental infection dynamics.

Materials and Methods: experiments were carried out in vitro in cell culture models (PK cell) and in vivo in the white mouse models of 12-14 g. A highly virulent Dal'negorsk (Dal) strain of TBE virus and TBE immunoglobulin produced by “NPO” Microgen” were used in the study.

Results: The inhibitory effect of different degree of specific antibodies on tick-borne encephalitis virus has been shown. Antibody titer of 1: 400, possessing a direct antiviral activity against epidemiologically meaningful dose (3 lg TCD₅₀) of TBE virus, has demonstrated to be effective only at the early stage of infection. Specific antibodies at a titer of 1: 3200 have found to possess a protective effect during the whole observation period (3-72 h). We concluded that in patients received specific vaccine courses having antibody titer of 1: 800 or higher, the next revaccination can be received in a year. It is recommended to these patients to examine blood samples for intensity of immunity to TBE virus during the pre-epidemic season to determine the revaccination period.

Keywords: tick-borne encephalitis virus, antibodies, antiviral activity

Введение

В Российской Федерации проблема клещевого энцефалита (КЭ) актуальна до настоящего времени. Самая надежная защита от этого заболевания остается специфическая вакцинопрофилактика, при которой у вакцинированных лиц формируется разный уровень специфического иммунного ответа. Этим можно объяснить единичные случаи КЭ даже при полном курсе вакцинации. У заболевших лиц, привитых разными вакцинами против КЭ, регистрируют не только лихорадочные формы, но и в редких случаях тяжелые формы инфекции с возможными летальными исходами [2-5]. При изучении вопросов эффективности вакцинопрофилактики врачей здравоохранения интересуют практические вопросы, какой титр антител может определить степень надежной защиты от заболевания, при каком уровне антител следует проводить ревакцинацию или перенести ее на другой срок.

Цель исследований - показать в динамике экспериментальной инфекции противовирусную активность специфических антител с разными титрами по отношению к высоковирулентному дальневосточному штамму вируса КЭ.

Материалы и методы

Эксперименты проведены in vitro (на модели клеточной культуры СПЭВ) и in vivo - на модели белых мышей 12-14 г. В работе был использован штамм Dalґnegorsk (Dal) вируса КЭ, который был выделен в 1973 году из мозга умершего больного очаговой формой КЭ. В экспериментах использован иммуноглобулин (ИГ) против КЭ производства «НПО «Микроген», титр в РТГА - 1:160 и в ИФА - 1:6400. В опытах использовали ИГ в разведениях (титры 1:100, 1:400 и 1:3200), 0,9 мл которых соединяли с 0,1 мл вируса КЭ (4,0 lg ТЦД₅₀), после чего рабочая доза вируса в опыте составляла 3,0 lg ТЦД₅₀. Смесь помещали на 2 часа в холодильник +4°С, затем этими пробами заражали монослой клеток СПЭВ выращенный на пробирках, после 1 часа контакта в термостате монослой зараженных клеток трижды промывали средой и заливали средой поддержки. Через 3, 24, 48 и 72 часа собирали культуральную жидкость и клетки СПЭВ, зараженные экспериментальными пробами.

Из клеток в разные сроки наблюдения готовили слайды для подсчета процента зараженности клеток вирусом в непрямом методе иммунофлюоресценции (НМФА). Титр вируса в пробах надосадочной культуральной жидкости определяли путем нанесения 10-кратных разведений надосадочной жидкости этих проб на монослой клеток СПЭВ, выращенных на 96 луночных планшетах. Учет проводили по цитопатическому действию на 5-6 сутки после заражения.

Кроме того, культуральную жидкость на 3 сут после заражения пробами исследовали in vivo на модели неинбредных мышей весом 12-14 г. Мышей по 6 экз. заражали подкожно по 0,2 мл, срок наблюдения составил 21 сутки. Остаточный вирус в экспериментальных пробах определяли по проценту выживших животных и средней продолжительности жизни (СПЖ). Животных содержали в условиях вивария регламентируемых приказом Минздрава СССР №1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами Минздрава СССР №755 от 12.09.1977 г. и №701 от 27.07.1978 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с животными.

Все эксперименты повторяли трехкратно.

Результаты и обсуждение

Случаи заболевания КЭ могут возникнуть при укусе клеща с вирусом. Дозы вируса 2-3 и более log LD₅₀ принято считать эпидемически значимыми. В этой связи ранее мы определили минимальную концентрацию специфических антител (титр 1:400), способную нейтрализовать 3 lg ТЦД₅₀ вируса КЭ [5]. Для получения более убедительных результатов противовирусной активности ИГ в титрах 1:400 и 1: 3200 по отношению к разным титрам вируса от 1 до 8 lg ТЦД₅₀ были проведены эксперименты in vitro и in vivo.

Полученные результаты, представленные на рис. 1, убедили нас еще раз в том, что прямое ингибирующее действие ИГ с титром 1:400 in vitro определяется при дозе вируса 3 lg ТЦД₅₀ и in vivo - при дозе 4 lg ТЦД₅₀. ИГ в титр 1:3200 обладает ингибирующим действием при дозе вируса 4 lgТЦД₅₀ in vitro (рис. 1А) и при дозе 6 lgТЦД₅₀ in vivo (рис. 1В).

антитело вирус клещевой энцефалит

Рис. 1. Влияние антител класса IgG с титрами 1:400 и 1:3200 на разные дозы вируса КЭ (от 1 до 8 lg LD50). А - опыт на культуре клеток СПЭВ; В- опыт на белых мышах.

Полученные результаты ингибирующего действия ИГ непосредственно на вирус КЭ могут отражать лишь ситуацию взаимодействия вируса с антителами на ранних стадиях инфицирования пациентов после укуса клеща с вирусом. Как развивается процесс после взаимодействия вируса с антителами в более поздние сроки, помогают нам понять эксперименты по выявлению остаточного вируса в динамике наблюдения от 3-х до 72 часов после заражения культуры клеток СПЭВ пробами (ИГ + вирус КЭ).

Влияние ИГ на вирус было показано путем изучения внутриклеточного накопления антигена с помощью НМФА, а также внеклеточного определения титра вируса в культуральной среде клеток СПЭВ, зараженных пробами вируса с разными титрами ИГ (1:100, 1:400, 1:3200) в сравнении с показателями контроля вируса.

Рис. 2. Выявление антигена в клетках (А) и вируса в культуральной среде (В) клеток СПЭВ, зараженных штаммом Dal'negorsk вируса КЭ (3 lg ТЦД50) и пробами вируса с иммуноглобулином (1:100, 1:400, 1:3200), в динамике наблюдения (3, 24, 48 и 72 часа).

Как видно на рис. 2 под действием ИГ появление остаточного вируса было определено только спустя 48 часов после заражения клеток. Накопление антигена вируса КЭ происходило более активно при титре ИГ 1:100, замедленно - при титре 1:400, а при титре антител 1:3200 антиген не выявляли (рис. 2 А). В культуральной среде клеток СПЭВ (рис. 2 В) реплицированный вирус КЭ появляется при заражении пробами ИГ (1:100 и 1:400) также через 48 часа, а через 72 часа (проба 1:100) достигает контрольного уровня вируса 3 lg ТЦД50. Проба ИГ (1:3200) демонстрирует полноценное вирулицидное действие по отношению к высоковирулентному штамму Dal' вируса КЭ в дозе 3 lg ТЦД₅₀, во все сроки наблюдения ни антиген, ни вирус не были выявлены.

Полученные данные in vitro следовало подтвердить in vivo путем подкожного заражения белых мышей культуральной жидкостью опытных проб. Решение вопроса репликативной активности остаточного вируса после взаимодействия его с разными дозами ИГ целесообразно изучать в более поздние сроки наблюдения. Для этого были использованы культуральные жидкости, собранные спустя 72 часа после заражения клеток СПЭВ экспериментальными пробами.

Таблица

Показатели активности вируса КЭ in vivo, поступившего в культуральную жидкость на третьи сутки после заражения клеток СПЭВ опытными пробами (вирус КЭ - 3 lg ТЦД50 + ИГ -1:100, 1:400, 1:3200)

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что на 3 сутки взаимодействия вируса в дозе 3 lg ТЦД₅₀ с иммуноглобулином в титрах 1:100 и 1:400 количество остаточного вируса восстановилось почти до контрольного уровня, вызывая в 100% гибель животных. И только ИГ с высоким титром (1:3200) способен полностью ингибировать эпидемически значимую дозу вируса (3 lg ТЦД₅₀), о чем свидетельствовали также данные по внутриклеточному накоплению специфического антигена (рис. 2 А) и внеклеточному накоплению реплицированного вируса клетками СПЭВ, зараженными экспериментальными пробами (рис.2 В).

Заключение

Таким образом, представленные результаты помогают понять причины разных исходов инфекции у лиц, вакцинированных против КЭ, после укуса клеща, зараженного вирусом. В литературе используют понятие о защитном титре антител, которое возникло в работах по оценке иммунологической активности вакцин. Считается, что если известен порог защитного уровня иммунологических показателей, то можно судить о профилактической эффективности вакцин при той или иной инфекции [1]. Понятие о защитном титре антител у лиц, вакцинированных против КЭ, в литературных источниках практически не встречается. Ранее на примере экспериментов по прямому противовирусному действию антител класса IgG на вирус КЭ мы определили минимальный защитный титр специфических антител равный 1:400 [4, 6]. Однако такой уровень специфических антител способен защитить только на ранних стадиях инфицированности лиц после укуса клеща, который содержит вирус КЭ с низкими титрами.

Показатели взаимодействия антител класса IgG в титре 1:3200 с эпидемически значимой дозой вируса КЭ (3 lg ТЦД₅₀) указывают на высокий уровень защитного действия специфических антител, способных полностью ингибировать вирус не только на ранних стадиях, но и в отдаленные сроки. Полученные данные можно использовать при решении вопросов лечения КЭ, а также при индивидуальном определении сроков ревакцинации против КЭ. Если в сыворотке крови уровень антител класса IgG составляет 1:400 и ниже, следует рекомендовать продолжить курс вакцинации. У лиц, получивших курс специфической вакцинации против вируса КЭ и имеющих титр антител 1:800 и выше, очередную ревакцинацию можно перенести на следующий год. В предэпидемический сезон у этих лиц первоначально рекомендуется исследовать кровь на напряженность иммунитета к вирусу КЭ с тем, чтобы принять правильное решение о сроках ревакцинации.

Литература

1. Брико Н.И. Критерии оценки эффективности вакцинации // Вакцинация, 2000; 5(11) http://medi.ru/doc/15b1101.htm.

2. Захарычева Т.А. Клещевой энцефалит в Хабаровском крае: вчера, сегодня, завтра. - Хабаровск, 2014. 248 с.

3. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит: актуальные аспекты. - М.: Изд. В.И.Балабанов, 2009; 168 с.

4. Леонова Г.Н., Беседнова Н.Н. Вакцины против клещевого энцефалита. Национальное руководство «Вакцины и вакцинация» / Под редакцией В.В.Зверева и Р.М. Хаитова. М., 2014. 400 с.

5. Погодина В.В., Левина Л.С., Скрынник С.М., Травина Н.С., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Кармышева В.Я., Герасимов С.Г., Маленко Г.В., Перминов Л.В., Попов М.А., Бочкова Н.Г. Клещевой энцефалит с молниеносным течением и летальным исходом у многократно вакцинированного пациента // Вопросы вирусологии. 2013; 2: 33-37.

6. Leonova G.N. Pavlenko E.V., Maystrovskaya O.S., Chausov E.V. Protective antibody titer for patients vaccinated against Tick-borne Encephalitis. Procedia in Vaccinology. 2011; 4: 84-91.

References

1. Briko N.I. Evaluation criteria of efficiency of vaccination. Vaccination, 2000; 5(11). http://medi.ru/doc/15b1101.htm (in Russia).

2. Zaharycheva TA Tick-borne encephalitis in the Khabarovsk Territory: yesterday, today and tomorrow. - Khabarovsk, 2014. 248.

3. Leonova G.N. Tick-borne encephalitis: actual aspects. M., 2009; 168.

4. Leonova G.N., Besednova N.N. Vaccines against tick-borne encephalitis. National guideline "Vaccines and vaccination" edited VV Zverev, RM Haitov. М., 2014. 400.

5. Pogodina V.V. Levina L.S. et al. Tick-borne encephalitis with Fulminant course and Lethal Outcome in Patients after Plural Vaccination. Vopr.virol. 2013; 2:33-37 (in Russia).

6. Leonova G.N. Pavlenko E.V., Maystrovskaya O.S., Chausov E.V. Protective antibody titer for patients vaccinated against Tick-borne Encephalitis. Procedia in Vaccinology, 2011: 4; 84-91.

Размещено на Allbest.ru