Связь атеросклеротического поражения стенки сонных артерий с полиморфизмом некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются ведущей причиной смерти населения в большинстве стран, в том числе в России. В связи с этим проблема раннего выявления, профилактики, лечения атеросклероза и его клинических проявлений, как основной причины ССЗ особенно актуальна (Оганов Р.Г., 2003). Артериальная стенка крупных и средних сосудов является главной мишенью атеросклероза, начальные атеросклеротические изменения появляются преимущественно в интимо-медиальной оболочке артерий (Вихерт А. и соавт., 1981; Stary H. et al., 1992). Изменения комплекса «интима-медия», успешно оцениваемые при ультразвуковом сканировании, также являются предиктором кардио- и цереброваскулярных событий (Bots М. et al., 2000; O'Leary D. et al., 1999; Рябиков А., 2006). На современном этапе кардиологии активно изучается полиморфизм генов-кандидатов CCЗ как один из потенциальных факторов риска развития атеросклеротического процесса и, как следствие, ССЗ, вносящих высокий вклад в общую смертность. В контексте настоящей работы интересным является изучение генов матричных металлопротеиназ (Terashima М. et al., 1999; Morgan A.R. et al., 2003), играющих важную роль в патогенезе атеросклероза путем повреждения компонентов внеклеточного матрикса (Watanabe N., 2004; Соловьева Н.И., 1998). Учитывая, что оксид азота является важным атеропротективным фактором, а дефекты в его генерации связаны с повышенным риском развития ССЗ, также представляет интерес изучение полиморфизмов Glu298Asp и 4а/4b гена эндотелиальной NO-синтазы (Wang X.L. et al., 1996; Hingorani A.D. et al., 1999). Полиморфизм e2/e3/е4 гена аполипопротеина Е имеет важное значение в возникновении гиперлипопротеинемии и развитии атеросклероза (Tiret L. et al., 1994; Xhignesse M. et al., 1991). Большинство работ обнаруживало связь каротидного атеросклероза и толщины интимы-медии с аллелем е4 гена аполипопротеина Е (Cattin L. et al., 1997; Wohlin M. et al., 2007), но имеются и неоднозначные оценки данной ассоциации, в том числе, в гендерном и расовом аспектах. Наследственный дефицит фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) связывают с гомоцистеина, который способствует формированию атероматозной бляшки, ускоряя пролиферацию гладкомышечных клеток (Wilcken D. et al., 1996; Hennekens Ch. et al., 1998), в связи с чем представляет интерес анализ ассоциаций С677Т полиморфизма гена MTHFR с маркерами атеросклероза. Носительство делеционного генотипа I/D полиморфизма гена альфа2В-адренорецептора ассоциируется с артериальной гипертензией, риском острой коронарной недостаточности (Heinonen Р. et al., 2002) и внезапной смерти (Snapir А. et al., 2003). Таким образом, изучение ассоциаций указанных генетических полиморфизмов со структурными изменениями артериальной стенки представляется актуальным.

Цель исследования. Изучение ассоциаций атеросклеротического поражения стенки сонных артерий по данным ультразвукового исследования с полиморфизмом ряда генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в семейной выборке из сибирской популяции.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту атеросклеротических изменений стенки сонных артерий (наличие бляшек и утолщение интимы-медии) в семейной выборке мужчин и женщин 18-60 лет г. Новосибирска.

2. Проанализировать распределение генотипов и аллелей ряда генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний: матричной металлопротеиназы-3 (ММР3, 5А/6А) и металлопротеиназы-9 (MMP9, С1562Т), эндотелиальной NO-синтазы (eNOS, 4а/4b, Glu298Asp), аполипопротеина Е (APOE, e2/e3/е4), б2B-адренорецептора (ADRA2B, I/D), метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR, С677Т) в зависимости от наличия каротидного атеросклероза в той же выборке.

3. Изучить ассоциации атеросклеротических изменений артериальной стенки с вышеуказанными полиморфизмами генов eNOS, ММР3, ММР9, АРОE, ADRA2B, MTHFR с учетом взаимодействия с известными факторами риска ССЗ у мужчин и женщин 18-60 лет.

Новизна исследования:

1. Впервые на российском уровне в мультивариантном анализе оценена связь атеросклероза сонных артерий по данным ультразвукового исследования с полиморфизмом комплекса генов-кандидатов ССЗ (eNOS, ММР3, ММР9, APOE, ADRA2B, MTHFR) и обнаружен ряд независимых и контекст-зависимых ассоциаций.

2. В частности, для отечественной выборки впервые выявлена ассоциация каротидного атеросклероза с носительством 5А5А генотипа ММР3 у мужчин; ассоциация каротидного атеросклероза с носительством Glu298/Glu298 генотипа гена eNOS при наличии ишемической болезни сердца у мужчин; подтверждена контекст-зависимая ассоциация каротидного атеросклероза с носительством аллеля е4 гена APOE у мужчин; получена отрицательная связь с носительством аллеля D гена ADRA2B у женщин.

3. В рамках генетического анализа впервые обнаружена связь увеличения толщины комплекса «интима-медия» с носительством аллеля 4а гена eNOS, аллелей е2 и е4 гена APOE у женщин.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В обследованной выборке семей каротидный атеросклероз ассоциируется с носительством гомозиготного генотипа 5А5А гена ММР3 у мужчин.

2. Увеличение интимо-медиального комплекса сонных артерий связано с носительством аллеля 4а гена eNOS у женщин, каротидный атеросклероз связан с носительством гомозиготного генотипа Glu298/Glu298 гена eNOS у мужчин с ишемической болезнью сердца.

3. Утолщение интимы-медии сонных артерий ассоциируется с носительством аллелей e2 и e4 гена APOE у женщин; атеросклероз каротидных артерий ассоциируется c носительством аллеля e4 гена APOE у мужчин-курильщиков.

4. Носительство делеционного аллеля I/D полиморфизма гена ADRA2B имеет отрицательную связь с атеросклеротическим поражением сонных артерий у женщин в обследованной семейной выборке.

Практическая значимость работы.

Данные о характере структурных изменений артериальной стенки в индивидуальном профиле кардиоваскулярного риска позволяют выделять целевые группы профилактического вмешательства по результатам ультразвукового исследования и могут быть использованы в амбулаторных и стационарных лечебно-профилактических учреждениях кардиологического профиля. Выявленные ассоциации атеросклеротического поражения сонных артерий с некоторыми полиморфизмами генов-кандидатов в перспективе могут быть применены для разработки подходов к дифференцированному проведению профилактических и лечебных мероприятий с учетом индивидуальных генетических особенностей.

Практическое внедрение результатов исследования.

Результаты диссертации являются фрагментом бюджетной темы НИИ терапии СО РАМН «Интегральное изучение генетико-средовых особенностей возникновения артериальной гипертензии и поражения внутренних органов/органов-мишеней у жителей Сибири» 2009-2012. Материалы диссертации, ее выводы и рекомендации используются: в практике кардиологической и медико-генетической службы в клинике и поликлинике НИИ терапии СО РАМН; в учебном процессе на кафедре медицинской генетики Новосибирского Государственного Медицинского Университета; на курсе ультразвуковой диагностики и циклах последипломного усовершенствования по кардиологии и терапии на кафедре терапии ФПК и ППВ НГМУ.

Лично автором выполнены формирование базы данных, статистический анализ; клиническая оценка кардиологического статуса обследуемых; генотипирование полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на конкурсе молодых учёных Российской научно-практической конференции «Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения» (Новосибирск, 2008), на отчетной сессии НИИ терапии СО РАМН (Новосибирск, 2009), на Европейском конгрессе кардиологов «Congress of the European Society of Cardiology» (Барселона, 2009), на международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2010). Апробация работы проведена на межлабораторном семинаре НИИ терапии СО РАМН 16 апреля 2010 года.

1. Материал и методы исследования

Объект и дизайн исследования. Исследование проводилось на материале Европейского проекта по изучению генетики артериальной гипертензии EPOGH (European Project on Genes in Hypertension), принципиальный исследователь в Новосибирском центре - акад. РАМН Никитин Ю.П., координатор скрининга - проф. Малютина С.К. Исследование поддержано грантами EC FP6, EU Network of Excellence (In Genious HyperCare), FP7-Health-2007-201550 (HyperGenes).

Объектом исследования явилась рандомизированная выборка семей из популяции (жители Октябрьского района г.Новосибирска). Выбранный район с общей численностью населения около 150 000 человек типичен для Новосибирска по национальному и возрастному составу и занятости населения. Условием включения семей в исследование являлось наличие двух детей не моложе 18 лет и наличие одного или двух родителей не старше 60 лет (рис. 1).

атероматозный полиморфизм сердечный сосудистый

Рисунок 1. Формирование выборки исследования

Популяционная выборка семей была обогащена семьями, в которых хотя бы один из родственников имел артериальную гипертензию (АГ), отобранными из клиники НИИ терапии СО РАМН. Всего в проекте обследовано 89 семей (324 мужчин и женщин 18-60 лет с откликом 68%). В настоящую работу включены 295 человек (86 семей), у которых технически адекватно были выполнены ультразвуковое сканирование сонных артерий и генотипирование. Работа выполнена в формате одномоментного исследования.

Методы исследования. Основной скрининг по проекту EPOGH проводился с помощью стандартных эпидемиологических методов исследования ССЗ и их факторов риска (Rose G. еt al., 1984) и некоторых методик углубленного исследования.

Ультразвуковое ангиосканирование. УЗИ сонных артерий выполнялось на сканере SIM 7000 СFM (Esaote, Italy) фазированным датчиком 7,5/10,0 MГц одним исследователем (д.м.н. Рябиков А.Н.). С обеих сторон в режиме «on-line» оценивали состояние просвета, наличие и количество атеросклеротических бляшек в общей сонной артерии (ОСА), ее бифуркации, внутренней, наружной сонной артерии. Исследование документировано видеозаписью и измерения выполняли в режиме «off-line». На реконструированных видеоизображениях стенок сонных артерий, синхронизированных с R-зубцом ЭКГ (диастола) в продольном сечении проводили измерение толщины интимо-медиального комплекса (ТИМК) ОСА в дистальном сегменте на протяжении 10 мм до бифуркации. ТИМК оценивалась на задней стенке сосуда, на участке, свободном от бляшек и измерялась по правилу «переднего края». Рассчитывали среднюю ТИМК по данным трех измерений с каждой стороны. В качестве конечной переменной использовали максимальное среднее значение ТИМК с одной из сторон. За бляшку принимали локальное утолщение стенки артерии ? 1,5 мм или превышающим на 50% и более толщину примыкающего неизмененного интимо-медиального комплекса. Наличие атеросклероза каротидных артерий (АКА) устанавливали на основании увеличения ТИМК>=0,9 мм (ESH/ESC, 2007) и/или наличия множественных бляшек сонных артерий. В анализе рассматривали средние показатели ТИМК и дихотомическую переменную АКА.

Производили забор образцов крови, которые сохраняли в замороженном виде при -70С до выделения ДНК, выделение ДНК проводилось стандартным фенолхлороформным методом (Смит К. и соавт., 1990). Генотипирование выполнялось в лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний НИИ терапии СО РАМН (зав. лаб. - чл.-корр. РАМН Воевода М.И.). Из числа известных генов-кандидатов ССЗ были исследованы полиморфизмы следующих генов (табл.1): эндотелиальной NO-синтазы, матричной металлопротеиназы-3, металлопротеиназы-9, аполипопротеина Е, 2В-адренорецептора, метилентетрагидрофолатредуктазы.

Таблица 1. Исследованные полиморфизмы генов-кандидатов и возможные пути реализации в контексте изучаемой патологии

Полиморфизм генов тестировали с помощью опубликованных методик, основанных на полимеразной цепной реакции: 5А/6А MMP3 - Dunleavey L., 2000; С1562T ММР9 - Jones G., 2003; 4a/4b eNOS - Wang X., 1996; Glu298Asp eNOS - Lembo G., 2001; APOЕ (e2/e3/e4) - Hixson J. et al., 1990; I/D ADRA2B - Snapir A. et al., 2003; C677T MTHFR - Fujimura H. et al., 2000.

Измерение артериального давления (АД) выполняли на недоминантной руке ртутным сфигмоманометром, использовали среднее из 5 измерений для офисного АД с интервалом между ними 1 мин. Наличие АГ устанавливали при повышении систолического и/или диастолического АД (САД, ДАД) > 140/90 (WHO/ISH, 1999; ESH/ESC, 2003) и/или приеме гипотензивных препаратов в течение 2-х предшествующих недель. Массу тела измеряли с точностью до 0,1 кг на медицинских рычажных весах. Измерение роста проводили при помощи ростомера с точностью до 0,5 см. Для характеристики массы тела рассчитывали индекс Кетле: индекс массы тела (ИМТ) (кг/м2) = вес (кг)/рост2 (м2) (Pyorala K. et al., 1994). Опрос о курении проводили по стандартизованному опроснику: регулярным курильщиком считали обследуемого, выкуривающего хотя бы одну сигарету в день. Среднее потребление алкоголя в день выражали в граммах этанола с помощью стандартных коэффициентов конверсии. Уровень физической активности оценивали по показателю энерготрат (McArdle W. et al., 1991). Наличие ишемической болезни сердца (ИБС) оценивали по эпидемиологическим критериям на основе опросника Rose (Rose G. еt al., 1984), кодирования электрокардиографических (ЭКГ) изменений по Миннесотскому коду (Prineas R. et al., 1982), и документированных медицинских данных о наличии ИБС.

Кровь брали путем венепункции после 12-часового голодания. Сыворотку хранили при -70С до выполнения анализов (1-3 месяца). Концентрацию общего холестерина крови (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛВП) и глюкозы определяли энзиматическим методом, уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП) рассчитывали по формуле Fridewald (Braunwald E. et al., 2001). Наличие сахарного диабета устанавливали на основании уровня глюкозы крови ? 7,0 ммоль/л или истории болезни сахарного диабета, согласно Европейским рекомендациям, 2007. Исследования выполняли на автоанализаторе “Labsystem” (Finland) в лаборатории биохимии НИИ терапии СО РАМН (зав. лаб. - д.м.н. Рагино Ю.И., отв. исполнитель - Иванова М.В.).

Статистическая обработка полученных результатов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ SPSS (v.11.5). На первом этапе определяли частоты генотипов и аллелей изучаемых генов-кандидатов в общей выборке семей. Анализировалась ассоциация полиморфизмов изучаемых генов-кандидатов с наличием каротидного атеросклероза у мужчин и женщин с помощью таблиц сопряженности с использованием критерия хи-квадрат по Пирсону. Относительный риск заболевания по каждому аллелю или генотипу в нескольких моделях оценивали на основании отношения шансов (OR - odds ratio). После получения первичных результатов выполняли логистический регрессионный анализ в одновариантной и мультивариантной моделях (стандартизация по возрасту, полу и стандартным факторам риска ССЗ: САД, прием гипотензивной терапии, ИБС, ОХС, ХС-ЛВП, ХС-ЛПНП, ТГ, глюкоза крови, курение, прием алкоголя). Оценку различий средних значений количественных показателей между разными генотипами проводили после стандартизации по полу, возрасту и другим ковариатам с помощью процедуры GLM. Учитывая семейный характер выборки также использовался QTDT анализ (Abecasis G.R. et al., 2000) с выполнением внутрисемейного disequilibrium transmission-теста для количественного признака (ТИМК). За уровень статистической значимости принимали р<0,05 (для двухсторонних тестов).

2. Результаты исследования и обсуждение

Атеросклероз сонных артерий и полиморфизмы генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний.

Общая характеристика выборки. Основные клинические и демографические характеристики изучаемой выборки представлены в таблице 2.

В обследованной выборке 18-60 лет распространенность каротидного атеросклероза составила 13,2% (18,8% у мужчин и 9,0% у женщин). У мужчин частота развития АКА была в 2,3 раза выше, чем у женщин, OR=2,34 (95%CI 1,17-4,67, р=0,014).

Толщина интимо-медиального комплекса сонных артерий в среднем составила 0,59 мм и была достоверно выше у мужчин 0,63 мм против 0,56 мм у женщин, р=0,003. Уровни САД у мужчин и женщин достоверно не различались, р=0,197, а величина ДАД у мужчин была выше, чем у женщин 85 мм.рт.ст. против 81 мм.рт.ст., р=0,009. Частота приема гипотензивных препаратов у женщин (19,8%) была в 2,6 раз выше, чем у мужчин (8,6%), р=0,008. Также у женщин по сравнению с мужчинами был выше показатель ХС-ЛВП (р=0,002). Индекс массы тела был выше у женщин (26,2 против 24,5 кг/м2), р=0,005 и чаще встречался сахарный диабет (р=0,030). Потребление алкоголя и курение, напротив, среди мужчин были в 4-5 раз выше по сравнению с женщинами, р<0,001. По остальным показателям (возраст, ТГ, глюкоза, ОХС, ХС-ЛПНП, наличие ИБС, АГ) достоверной разницы относительно пола не получено.

Таблица 2. Общая характеристика семейной выборки (мужчины и женщины, 18-60 лет, г.Новосибирск)

Примечание: М - среднее значение, SE - ошибка среднего значения.

Изучались нижеперечисленные полиморфизмы генов-кандидатов ССЗ. Частоты генотипов и аллелей всех проанализированных генов в исследованной выборке были близки к опубликованным для европеоидных и некоторых других популяций (Czarnecka D. et al., 2005; Debette S. et al., 2006; Hanon O. et al., 2000; McQuillan B. et al., 1999; Pцllдnen P. еt al., 2001; Sigusch H. et al., 2000; Snapir A. et al., 2003; Suzuki N. et al., 2003; Terashima M. еt al., 1999; Wolff B. еt al., 2005; Zuntar I. еt al., 2003); (табл.3).

Таблица 3. Частоты генотипов генов-кандидатов ССЗ в семейной выборке (мужчины и женщины, 18-60 лет, г.Новосибирск)

Полиморфизм 5A/6A гена матричной металлопротеиназы-3 (MMP3). Частоты аллелей гена ММР3 5А6А (0,46/0,54 против 0,41/0,59; р=0,396) и генотипов 5А5А/5А6А/6А6А в зависимости от наличия АКА не различались (18,4%/55,3%/26,3% против 13,4%/55,7%/30,9% в контроле; р=0,665, n=284). Величина ТИМК относительно генотипов 5А5А/5А6А/6А6А составила 0,58мм/0,59мм/0,60мм, р=0,917. Во внутрисемейном QTDT анализе достоверной связи 5А/6А полиморфизма гена ММР3 с ТИМК также не получено (ч2=0,42; р=0,518). У мужчин и женщин показатели ТИМК в зависимости от генотипов также не различались. При стандартизации по возрасту выявлена статистически достоверная ассоциация носительства гомозиготного генотипа 5А5А гена ММР3 с АКА у мужчин в модели 5А5А против 5А6А/6А6А OR=7,63 (95%CI: 1,08-54,22; р=0,042) и в модели 5А5А против 6А6А OR=25,63 (95%CI: 1,16-566,81; р=0,040), рис. 2.

Рисунок 2. Отношение шансов наличия каротидного атеросклероза в зависимости от полиморфизма гена ММР3 в различных моделях (стандартизация по возрасту; мужчины, женщины, объединенная по полу выборка)

Для женщин связи АКА с полиморфизмом 5А6А гена ММР3 не выявлено. Мультивариантный регрессионный анализ показал, что ассоциация АКА с носительством 5А5А генотипа у мужчин не зависела от возраста, уровня АД, гипотензивной терапии, индекса массы тела, OR=9,3 (95%CI: 1,14-75,72; р=0,037), табл. 4. (модель 3). При включении в анализ таких ковариат, как уровень ОХС, курение, потребление алкоголя также сохранялась связь АКА у мужчин с вышеуказанным генотипом (модель 5). Но, при включении в модель ХС-ЛВП или ИБС достоверность связи нивелировалась (р=0,068 и р=0,096, соответственно). Эти данные предполагают, что ассоциация каротидного атеросклероза с гомозиготностью 5А5А генотипа у мужчин частично объяснялась вкладом уровня ХС-ЛВП и наличия ИБС.

Обнаруженная ассоциация атеросклероза каротидных артерий с гомозиготным генотипом 5А5А гена ММР3 согласуется с результатами ряда работ (Terashima М. et al., 1999; Humphries S. et al., 2002; Liu Р. et al., 2005). Данные в пользу 5А аллеля могут отражать предполагаемую в мета-анализе связь этого варианта с нестабильностью бляшки вследствие повышенного протеолиза (Abilliera S. еt al., 2006). Более того, ассоциация каротидного атеросклероза с 5А5А генотипом гена ММР3 в нашей выборке зависела от мужского пола и частично модулировалась вкладом ХС-ЛВП и наличием ИБС, что свидетельствует в пользу общности механизмов связи полиморфизма ММР3 как с коронарогенными событиями, так и каротидным атеросклерозом.

Таблица 4. Результаты мультивариантного регрессионного анализа ассоциации АКА с 5А5А генотипом гена ММР3 у мужчин и у женщин, 18-60 лет, Новосибирск

Примечание. Стандартизация: Модель 1 - по возрасту; Модель 2 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии; Модель 3 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ; Модель 4 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, курению, потреблению алкоголя; Модель 5 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, курению, потреблению алкоголя, ОХС; Модель 6 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, курению, потреблению алкоголя, ХС-ЛВП; Модель 7 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, курению, потреблению алкоголя, наличию ИБС.

Полиморфизм С1562Т матричной металлопротеиназы-9 (ММР9). Частоты аллелей гена MМР9 C/T (0,77/0,23 против 0,73/0,27 в контроле; p=0,475, n=238) и генотипов СС/СТ/ТТ в группе с АКА (60,6%/33,3%/6,1%) не отличались от группы без каротидного атеросклероза (54,6%/36,6%/8,8%; р=0,773). Построение различных моделей в зависимости от генотипов не выявило ассоциации полиморфизма С1562Т гена ММР9 с АКА. Величина ТИМК относительно генотипов СС/СТ/ТТ составила 0,60мм/0,59мм/0,57мм, р=0,780. У мужчин и у женщин показатели ТИМК также не различались в зависимости от генотипов гена ММР9. При стандартизации по возрасту взаимоотношения полиморфизма С1562Т с величиной ТИМК не изменились, р=0,969. В QTDT анализе связи данного полиморфизма с ТИМК также не выявлено (ч2=2,65; р=0,103). Таким образом, в обследованной выборке не обнаружено ассоциации изучаемого фенотипа с полиморфизмом С1562Т гена MMP9, что согласуется с рядом исследований (Wang J. et al., 2001; Haberbosch W. et al., 2005) и данными мета-анализа (Abilleira S., 2006).

Полиморфизм Glu298Asp гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Частоты аллелей гена eNOS Glu298/Аsp298 (0,80/0,20 против 0,71/0,29; р=0,126) и генотипов GluGlu/GluАsp/АspАsp в зависимости от наличия АКА не различались (64,1%/30,8%/5,1% против 50,6%/40,9%/8,5%; р=0,284). Величина ТИМК относительно генотипов GluGlu/GluАsp/АspАsp составила 0,61мм/0,58мм/0,60мм, р=0,723. У мужчин и женщин показатели ТИМК в зависимости от генотипов гена eNOS также не различались. В QTDT анализе связи данного полиморфизма с ТИМК также не было получено (ч2=0,02, р=0,878). Среди мужчин выявлена тенденция к увеличению частоты АКА у носителей гомозиготного генотипа GluGlu против GluAsp/AspAsp: OR=2,26, р=0,084. По результатам мультивариантного регрессионного анализа выявлена ассоциация АКА с носительством Glu/Glu генотипа у мужчин, независимая от возраста, уровня САД, приема гипотензивной терапии, ИМТ, курения, потребления алкоголя, OR от 4,2 до 4,6 (р<0,05), табл.5 (модели 3,4,5).

Таблица 5. Результаты мультивариантного регрессионного анализа ассоциации АКА с Glu/Glu генотипом гена eNOS у мужчин и женщин, 18-60 лет, Новосибирск

Примечание. Стандартизация: Модель 1 - по возрасту; Модель 2 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии; Модель 3 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, наличию ИБС; Модель 4 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, наличию ИБС; Модель 5 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, наличию ИБС, курению, потреблению алкоголя; Модель 6 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, наличию ИБС, ОХС; Модель 7 - по возрасту, САД, гипотензивной терапии, наличию ИБС, ХС-ЛВП.

Данная ассоциация реализовалась только при условии включения в модель ИБС. При дополнительном включении таких ковариат, как уровень ОХС или ХС-ЛВП значимость связи нивелировалась (модели 6,7). Учитывая значимость ИБС в получении достоверной ассоциации нашим следующим шагом стало разделение выборки на группы с ИБС и без ИБС. При мультивариантной стандартизации OR развития АКА у мужчин-носителей Glu/Glu генотипа в комбинации с наличием ИБС против мужчин-носителей GluAsp/AspAsp генотипов без ИБС составило 19,62 (р=0,034), рис.3. Уровни липидов крови (ОХС, ХС-ЛВП) также в основном объясняли эту ассоциацию. Для женщин связи АКА с полиморфизмом Glu298Asp гена eNOS не выявлено.

Рисунок 3. Относительный риск наличия каротидного атеросклероза в зависимости от генотипов гена еNOS при разделении выборки по наличию ИБС у мужчин (стандартизация по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, курению, потреблению алкоголя)

Полученные результаты отличаются от данных большинства работ, где получены ассоциации коронарного или каротидного атеросклероза, а также инфаркта миокарда (ИМ) с мутантным Asp аллелем (Lembo G. et al., 2001; Wolff B. et al., 2005; Shimasaki Y. et. al., 1998). Эти наблюдения предполагают, что у лиц-носителей Asp aллеля имеется сниженная продукция NO на фоне эндотелиальной дисфункции, что соответственно может увеличивать риск развития ИБС (Casas J.P. et al., 2006). В то же время, полученные результаты схожи с данными исследований в славянских популяциях (Кузнецова Т.Ю., 2009; Затейщикова А.А. и соавт., 2001). Так, в работе Кузнецовой Т. патологические изменения сонных артерий при АГ были ассоциированы с аллелем G полиморфизма Glu298Asp гена eNOS, при этом у мужчин аллель G повышал риск поражения сонных артерий в 1,5 раза. Также наши результаты согласуются с данными Bogalusa Heart Study (2004, 2008), где при наличии Т aллеля гена eNOS в сочетании с TT генотипом гена GNB3 (C825T) наблюдались меньшие значения ТИМК среди чернокожих и в этнически смешанной популяции (Bhuiyan A.R. et al., 2008).

Противоречивость результатов может быть связана с этнической принадлежностью выборок, малым размером нашей выборки (т.е. малым числом ТТ гомозигот в группе АКА), а кроме того малоизученным эффектом самой замены. Так, в нашей выборке ассоциация GluGlu генотипа с АКА была контекст-зависимой и реализовалась только у мужчин с ИБС. Выявленная связь каротидного атеросклероза с полиморфизмом eNOS, объяснявшаяся в существенной степени вкладом липидов крови, косвенно поддерживает предположение о негативном влиянии гиперхолестеринемии на продукцию оксида азота. Таким образом, хотя несколько исследований, включая наше, свидетельствуют в пользу скромного защитного эффекта аллеля Asp и негативного эффекта Glu аллеля на артериальную структуру и функцию, однако функциональные эффекты замены Glu298Asp и ее роль в патогенезе ССЗ остаются спорными и требуют уточнения в крупномасштабных исследованиях.

Полиморфизм 4a4b эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Частоты аллелей а/b в 4 интроне гена eNOS (0,21/0,79 против 0,18/0,82 в контроле; p=0,546) и генотипов 4а4а/4а4b/4b4b в группе с каротидным атеросклерозом не отличались от группы с неизмененной артериальной стенкой (2,6%/35,9%/61,5% против 3,3%/28,9%/67,9%; р=0,666, n=285). У женщин в модели 4a4a/4a4b против 4b4b при стандартизации по возрасту и другим факторам получена ассоциация 4a aллеля с увеличением ТИМК, р=0,005 (табл. 6). Нами также обнаружена тенденция к увеличению ТИМК при гомозиготном генотипе 4а4а eNOS у мужчин в модели 4a4a против 4a4b/4b4b (р=0,053) при мультивариантной стандартизации (табл. 6). Внутрисемейный QТDТ анализ не подтвердил связи 4ab полиморфизма с ТИМК (ч2=0,61, р=0,433). Мы не обнаружили ассоциации наличия бляшек и соответственно АКА в целом с 4a4b полиморфизмом гена eNOS.

В обследованной семейной выборке при популяционном анализе обнаружена связь увеличения ТИМК с 4аb генотипом и 4а аллелем у женщин и тенденция к связи с гомозиготным генотипом 4а4а eNOS у мужчин.

Таблица 6. Средние показатели ТИМК в моделях 4а4а/4а4b vs 4b4b1 и 4а4а vs 4а4b/4b4b2 гена eNOS у мужчин и женщин, 18-60 лет, Новосибирск

Примечание. Модель 1 стандартизована: а) по возрасту; b) по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, ИБС, ОХС, ХС-ЛВП, курению, потреблению алкоголя. Модель 2 стандартизована: а) по возрасту; b) по возрасту, ИМТ, АГ, гипотензивной терапии, ИБС, по уровню триглицеридов, потреблению алкоголя.

Эти данные согласуются с результатами большинства работ, где получены ассоциации ИБС, атеросклероза, ИМ, АГ с аллелем 4а (Ichihara S. еt al., 1998; Park J. et al., 1998; Минушкина Л., 2008; Popova L. et al., 2008). Имеются данные Fatini C. и соавторов (2004) о связи носительства 4а аллеля с каротидным стенозом при мультивариантной стандартизации. Ассоциация ССЗ с наличием 4а аллеля может быть связана с повышением уровня нитратов и нитритов в крови, напрямую зависящих от скорости выработки оксида азота эндотелием сосудов (Ichihara S. et al., 1998; Ignarro L. et al., 1989). Это свидетельствует о потенциальной роли генотипа 4a/4a как фактора риска состояний, связанных с нарушением выработки NO и развитием атеросклероза (Wang X. еt al., 1997; Tsukada T. et al., 1998).

Полиморфизм е2/е3/е4 гена аполипопротеина Е (АРОE). В отношении полиморфизма e2/e3/e4 гена APOE в группе с АКА распределение аллелей не отличалось от группы с неизмененной артериальной стенкой (e2/e3/e4=0,09/0,80/0,12 против 0,08/0,81/0,10; р=0,706-0,858; n=284). Частоты генотипов e2e2/e2e3/e2e4/e3e3/e3e4/e4e4 составили 0%/12,8%/5,1%/64,1%/17,9%/0% в группе АКА против 1,6%/10,2%/3,3%/69%/14,7%/1,2% в контроле (p=0,847; n=284). Получена тенденция к увеличению ТИМК при генотипе e2e4 у мужчин (р=0,087), что могло быть случайным в связи с малым числом носителей генотипа e2e4 (n=3). При стандартизации по возрасту выявлена достоверно большая ТИМК у женщин при генотипах e2e3 и e3e4 гена АРОЕ, р=0,031 и тенденция к увеличению ТИМК у мужчин при генотипах е2е3, е2е4, р=0,055. При мультивариантной стандартизации значимость связи сохранялась у женщин, р=0,010. В моделях е3е4/е4е4 и е2е2/е2е3 против е3е3 при мультивариантной стандартизации обнаружена ассоциация увеличения ТИМК с носительством аллеля е4 (р=0,029) и е2 (р=0,008) гена АРОЕ у женщин (табл. 7).

Таблица 7. Средние показатели ТИМК в моделях е3/е4/е4е4 vs е3е31 и е2е2/е2е3 vs е3е32 гена АРОЕ у мужчин и женщин, 18-60 лет, Новосибирск

Примечание. Модель 1 и Модель 2 стандартизованы: а) по возрасту; b) по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, ИБС, ОХС, ХС-ЛВП, курению, потреблению алкоголя.

Рисунок 4. Отношение шансов наличия каротидного атеросклероза в зависимости от носительства аллеля е4 гена АРОЕ и курения, мужчины, 18-60лет, г.Новосибирск (стандартизация по возрасту, САД, гипотензивной терапии, ИМТ, ИБС, ОХС, ХС-ЛВП, глюкозе крови)

Результаты внутрисемейного QTDT анализа подтвердили ассоциацию ТИМК с полиморфизмом (е2/е3/е4) гена АРОЕ (ч2=3,72; р=0,05). Вероятность увеличения ТИМК была связана с передачей аллеля е4 внутри семьи. В вышеуказанных моделях не было найдено положительной ассоциации АКА с полиморфизмом гена АРОЕ в общей выборке и при разделении по полу. Учитывая данные литературы о возможной контекст-зависимости изучаемых ассоциаций, мы провели анализ в подгруппах в зависимости от курения. У курящих мужчин, носителей аллеля е4 гена АРОЕ, против некурящих мужчин с отсутствием аллеля е4 риск АКА составил 39,95 (р=0,048) при стандартизации по возрасту, САД, приему гипотензивной терапии, ИМТ, уровням ОХС, ХС-ЛВП, сахару крови, наличию ИБС (рис.4).

В обследованной семейной выборке обнаружено, что величина ТИМК была выше у женщин, носителей аллеля е2 и носителей аллеля е4 гена АРОЕ против е3е3 (р=0,008 и р=0,029, соответственно), независимо от других факторов. Эти результаты согласуются с данными ряда других исследований (Сattin L. et al., 1997; Haraki Т. et al., 2002; Wohlin M. et al., 2007). Хотя большинство работ обнаруживало связь каротидного атеросклероза с аллелем е4 гена APOE, наши данные по связи аллеля е2 с увеличением ТИМК сопоставимы с результатами крупномасштабного ARIC Study (De Andrade et al., 1995) и исследования Hannon O. и соавт., 2000. Механизмы данной связи предполагают влияние е2-изоформы на замедление клиренса триглицерид-насыщенных липопротеидов.

В нашей работе получена контекст-зависимая от мужского пола и курения ассоциация носительства аллеля е4 гена АРОЕ с АКА (OR=39,9; р=0,048), что подтверждает данные Рябикова А.Н., 2006, ранее полученные в мужской популяции, 35-54 лет, где OR наличия каротидного атеросклероза у курящих мужчин, носителей аллеля е4 составило 2,13. Близкие данные получены еще в ряде работ (Karvonen J. et al., 2002; Djoussе L. et al., 2002). Выявленное модулирующее влияние курения на связь полиморфизма е2/е3/е4 гена АРОЕ с атеросклерозом согласуется с результатами когортного исследования Northwick Park Heart Study, в котором риск заболеваемости ИБС у курящих мужчин, носителей аллеля е4, был в 3 раза выше по сравнению с некурящими (Humphries S.E. et al., 2001). Это взаимодействие может быть связано с повышенным уровнем окисления ЛНП у курильщиков в результате снижения антиоксидантной протекции и меньшем размере ЛНП-частиц у лиц, носителей аллеля е4 по сравнению с е2 или е3, а также с низкой концентрацией аполипопротеина E, способствующей миграции гладкомышечных клеток артериальной стенки, ускоряя процесс атерогенеза.

Инсерционно-делеционный полиморфизм гена 2В-адренорецептора (ADRA2B, I/D). Частоты аллелей I/D полиморфизма гена 2В-адренорецептора (0,70/0,30 против 0,67/0,33 в контроле; p=0,553) и генотипов II/ID/DD в группе с каротидным атеросклерозом не отличались от группы контроля (53,8%/33,3%/12,8% против 45%/44,2%/10,8%; р=0,445, n=288). Величина ТИМК относительно генотипов II/ID/DD составила 0,60мм/0,58мм/0,63мм, р=0,390. У мужчин и у женщин показатели ТИМК также не различались в зависимости от генотипов гена ADRA2B. В QTDT анализе достоверной связи данного полиморфизма с ТИМК также не получено (ч2=0,09; р=0,765). При стандартизации по возрасту выявлена тенденция к уменьшению частоты АКА у женщин, носителей D аллеля, OR=0,23 (95%CI: 0,05-1,03; р=0,055) в модели ID/DD против II. При стандартизации по другим факторам (возраст, САД, наличие ИБС, ИМТ, ХС-ЛВП, ОХС, курение, потребление алкоголя) отрицательная связь АКА с D аллелем ADRA2B у женщин стала статистически достоверной, OR=5,62 (95%CI: 1,04-30,52), р=0,045 (табл. 8). Но при включении факта приема гипотензивной терапии значимость связи нивелировалась. Эти данные предполагают, что протективный эффект D aллеля гена ADRA2B в отношении АКА у женщин преимущественно объяснялся вкладом приема гипотензивной терапии. Этот факт наблюдался изолированно у женщин, вероятнее всего, в связи с их большей приверженностью к лечению АГ. Для мужчин связи АКА с I/D полиморфизмом гена 2В-адренорецептора не установлено.

Таблица 8. Результаты мультивариантного регрессионного анализа ассоциации АКА в модели ID/DD vs II гена ADRA2B у мужчин и у женщин, 18-60 лет, Новосибирск

Примечание. Стандартизация: Модель 1 - по возрасту; Модель 2 - по возрасту, САД; Модель 3 - по возрасту, САД, наличию ИБС, ИМТ, ХС-ЛВП; Модель 4 - по возрасту, САД, наличию ИБС, ИМТ, курению, потреблению алкоголя, ОХС; Модель 5 - по возрасту, САД, наличию ИБС, ИМТ, курению, потреблению алкоголя, ХС-ЛВП, ОХС, гипотензивной терапии.

Наши данные отличаются от многих работ, где показаны ассоциации АГ, ИМ, ИБС с D аллелем или гомозиготным генотипом по делеции (Snapir A. et al., 2001, 2003; Von Wowern F. et al., 2004; Максимов В., 2007), но не противоречат данным китайской популяции, где была обнаружена связь АГ с I аллелем у мужчин (Zhang H. et al., 2005), хотя в нашей выборке была определена ассоциация атеросклероза сонных артерий с II генотипом у женщин.

Полиморфизм C677T гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Частоты аллелей гена MTHFR C/T (0,73/0,27 против 0,69/0,31 в контроле; p=0,345, n=292) и генотипов CC/CT/TT в группе с АКА не отличались от группы с неизмененной артериальной стенкой (53,8%/41%/5,1% против 48,6%/40,7%/10,7%; р=0,540). Величина ТИМК относительно генотипов СС/СТ/ТТ составила 0,60мм/0,59мм/0,56мм; р=0,657. У мужчин и у женщин показатели ТИМК также не различались в зависимости от генотипов гена MTHFR. При анализе с учетом возраста связи полиморфизма с ТИМК также не получено, р=0,791. Отмечен недостоверный сдвиг к снижению пропорции ТТ генотипа против СС в группе АКА среди женщин, р=0,168. Во внутрисемейном QTDT анализе выявлена ассоциация данного полиморфизма с увеличением ТИМК при нестандартизованной оценке. Итак, в обследованной выборке нами не обнаружено ассоциации изучаемого фенотипа с полиморфизмом С677Т гена MTHFR.

В большинстве других исследований также не обнаружено подобной ассоциации (Gonzaґlez-Peґrez E. et al., 2002; Girelli D. et al., 1998; Alioglu E. et al., 2009; Kostulas K. et al., 1998). Во многих работах обнаружена ассоциация каротидного атеросклероза с гипергомоцистеинемией, но не получено стабильных свидетельств его связи с полиморфизмом гена MTHFR при известной связи гомоцистеинемии с Т аллелем (Loncar R. et al., 2006; McQuillan B. et al., 1999; Spence J. et al., 1999; Рябиков А. и соавт., 2005). Учитывая отдельные данные о связи увеличения ТИМК с ТТ генотипом (Fernбndez-Miranda С. et al., 2006; Kelemen L. et al., 2004; McQuillan B. et al., 1999), нельзя исключить потенциальный риск АКА среди лиц, где гомозиготность по Т аллелю реализуется в повышении уровня гомоцистеина при определенных условиях (например, недостатке в пищевом рационе фолиевой кислоты).

Заключение

В обследованной выборке семей из популяции изучены структурные изменения артериальной стенки (на примере сонных артерий) по данным ультразвукового исследования. Атеросклеротическое поражение артерий устанавливали на основании утолщения интимо-медиального комплекса (ТИМК) ? 0,9 мм и/или наличия множественных атеросклеротических бляшек. Атеросклеротические изменения каротидных артерий встречались примерно у каждого восьмого в обследованной выборке и преобладали среди мужчин.

В изученной выборке обнаружена ассоциация каротидного атеросклероза с генотипом 5А5А гена ММР3 у мужчин, которая частично объяснялась вкладом ИБС и уровнем ХС-ЛВП.

Получена положительная ассоциация носительства аллеля 4а гена eNOS с утолщением «интимы-медии» у женщин, что реплицирует результаты других исследований в этой области.

В обследованной выборке выявлена ассоциация каротидного атеросклероза с гомозиготным генотипом Glu298/Glu298 гена eNOS у мужчин при наличии ИБС, хотя она в существенной степени объяснялась вкладом уровня холестерина крови. Эти результаты отличаются от данных большинства зарубежных работ, где получены ассоциации атеросклероза с Asp298 аллелем. Противоречивость данных различных исследований может быть связана с этническим, половозрастным и клиническим составом выборок, а кроме того и с малоизученными эффектами данного полиморфизма в сочетании с другими факторами риска.

В изученной выборке обнаружена контекст-зависимая от курения и мужского пола ассоциация атеросклеротического поражения стенки сонных артерий с носительством аллеля е4 гена АРОЕ. Толщина каротидного интимо-медиального комплекса была достоверно выше у женщин, носителей аллелей е2 и е4 гена APOE.

В изученной выборке выявлена отрицательная связь атеросклеротических изменений стенки сонных артерий с носительством аллеля D гена ADRA2B у женщин, что может свидетельствовать о его протективном эффекте. Отсутствие ассоциации каротидного атеросклероза с полиморфизмом С1562Т гена ММР9 и С677Т гена MTHFR в нашем исследовании соответствует ряду литературных данных.

В целом, выявленные ассоциации атеросклеротического поражения сонных артерий с полиморфизмом ряда генов-кандидатов ССЗ в семейной выборке из Новосибирской популяции перспективны для оптимизации и дифференцированного проведения профилактических и лечебных мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. По данным ультразвукового исследования распространенность атеросклеротического поражения стенки сонных артерий в выборке семей из популяции 18-60 лет (г.Новосибирск) составляет 13,2%. Частота каротидного атеросклероза среди мужчин в 2,3 раз выше, чем среди женщин (18,8% и 9,0% соответственно; р=0,014).

2. В обследованной выборке обнаружена ассоциация каротидного атеросклероза с носительством гомозиготного генотипа 5А5А гена ММР3 у мужчин (OR=13,1; р=0,04).

3. Выявлена связь каротидного атеросклероза с носительством гомозиготного генотипа Glu298/Glu298 гена eNOS, ограниченная мужским полом и наличием ИБС (р=0,034).

4. В обследованной выборке обнаружена контекст-зависимая от курения и мужского пола ассоциация атеросклеротического поражения стенки сонных артерий с носительством аллеля е4 гена АРОЕ (p=0,048).

5. Толщина каротидного интимо-медиального комплекса была достоверно выше у женщин, носителей аллеля 4а гена eNOS (р=0,005) и аллелей е2 и е4 гена APOE (р=0,008 и р=0,029, соответственно).

6. В изученной выборке выявлена отрицательная связь атеросклеротических изменений стенки сонных артерий с носительством аллеля D гена ADRA2B (OR=0,18; р=0,045) у женщин, что может свидетельствовать о его протективном эффекте.

7. В семейной выборке мужчин и женщин 18-60 лет не обнаружено ассоциации изучаемого фенотипа с полиморфизмом генов MMР9 (С1562Т) и MTHFR (С677Т).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Выявленные ассоциации атеросклеротического поражения сонных артерий с полиморфизмом некоторых генов-кандидатов в перспективе могут быть использованы при разработке алгоритмов первичной и вторичной профилактики с учетом индивидуальных генетических особенностей и при формировании подходов к разработке новых лекарственных средств. Полученные результаты могут служить предпосылкой для поиска новых маркеров раннего атеросклероза. Стандартизованная методология скринингового ультразвукового исследования сердца и сосудов рекомендуется к применению при массовых профилактических обследованиях населения и в амбулаторной кардиологической практике.

Литература

1. Маздорова Е.В. Ассоциации полиморфизма некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с атеросклеротическим поражением стенки сонных артерий // Бюллетень СО РАМН. - 2008. - № 4 (132). - С. 65-71.

2. Ассоциации атеросклеротических изменений артериальной стенки с полиморфизмом гена аполипопротеина Е / А.Н. Рябиков, Е.В. Шахтшнейдер, С.К. Малютина, Е.В. Маздорова, М.И. Воевода // Генетика человека и патология: Сб. научн. тр. - Томск, 2007. - Вып. 8. - С. 113.

3. Ассоциации полиморфизма некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с атеросклеротическим поражением стенки сонных артерий / Е.В. Маздорова // Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения: тез. докл. Всероссийская конф. - Новосибирск. - 2008. - С. 247-250.

4. Ryabikov А., Malyutina S., Shakhtshneider E., Maximov V., Mazdorova E., Voevoda M., Kuznetsova T., Staessen J.A., Nikitin Yu. Carotid atherosclerosis: analysis of association with polymorphism of several candidate genes // European Heart Journal. - 2009. - Vol. 30 (Abstr. Suppl. Congress of the European Society of Cardiology. - Barcelona, 2009). - P. 642 (P 3940).

5. Связь каротидного атеросклероза с полиморфизмом некоторых генов-кандидатов / Е.В. Маздорова, А.Н. Рябиков, В.Н. Максимов, С.К. Малютина, М.И. Воевода, Ю.П. Никитин // Кардиология на перекрестке наук: тез. докл. Международный конгресс. - Тюмень, 2010. - С. 168-169.

6. Ассоциация каротидного атеросклероза с полиморфизмом е2/е3/е4 гена аполипопротеина Е / Е.В. Маздорова, А.Н. Рябиков, С.К. Малютина, Е.В. Шахтшнейдер, В.Н. Максимов // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии: тез.докл. Всероссийская научно-практ. конф. - Кемерово, 2010. - С. 171-173.

Размещено на Allbest.ru