Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Иммунологическая реактивность, плоидность и кинетика клеточного цикла клеток периферической крови при различных патологических состояниях у детей

14.00.36 - аллергология и иммунология

Хисамова Назиля

УФА - 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении здравоохранения «Республиканская детская клиническая больница»

Научный руководитель- доктор медицинских наук, профессор

Хайруллина Раиса Масгутовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Теплова Светлана Николаевна

доктор медицинских наук,

Азнабаева Лиля Фаритовна

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова» Росздрава

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Перспективным направлением клинической иммунологии является комплексный подход к изучению процессов, протекающих в иммунокомпетентных клетках и характеристика взаимосвязей между различными звеньями системы иммунитета. Физиологическое состояние клеток и способность к осуществлению присущих им функций характеризуется, в частности, уровнем ДНК (плоидностью) и показателями кинетики клеточного цикла. Для объективной оценки этих параметров широкое распространение получает проточная цитофлуориметрия, разделом которой является ДНК-цитометрия [Saha I. et al., 2000]. По прогнозам специалистов [Шмаров Д.А., Козинец Г.И., 2004], в самом ближайшем будущем можно ожидать внедрения проточной ДНК-цитометрии в практику работы клинико-диагностических лабораторий.

Согласно консенсусу по стандартизации методов проточной цитометрии, созданному по инициативе Совета Европейского Общества Целлюлярной Аналитической Патологии, материалом для определения плоидности клеток и кинетики клеточного цикла могут быть клетки крови, костный мозг, хирургические биоптаты, жидкости тела [Ormerod M.G., Tribukait B., 2001].

К настоящему времени большое количество научных работ посвящено изучению плоидности и кинетики клеточного цикла в биоптатах органов и тканей [Rytwiсski K. et al., 1999, 2000; Tsuji Y. et al., 2000; Garcнa-Escudero A. et al., 2001; Both C.T. et al., 2001; Wnuk A. et al., 2001; Takes R.P. et al., 2002; Driemel O. et al., 2005].

Наряду с ДНК-цитометрией биоптатов, развивается направление, включающее оценку функционального состояния иммунной системы с использованием качественных параметров клеток, участвующих в иммунном ответе. Так, методом проточной ДНК-цитометрии исследовали функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и пролиферативную активность лимфоцитов цельной крови при сочетанной травме. В условиях инкубации с митогенами и специфическими антигенами, было установлено угнетение функции лимфоцитов в первые дни и восстановление пролиферативной активности к четвёртой неделе после травмы [Бычкова Н.В. и др., 2004].

В методическом плане наименьшие сложности возникают при работе с периферической кровью, но исследования в этой области носят фрагментарный характер и в литературе отражены результаты ДНК-цитометрии клеток периферической крови лишь в условиях профессионального длительного радиационного воздействия [Ястребов А.П., Сазонов С.В., 1995].

В отделении клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы с 2002 года внедрено в практику изучение иммунного статуса и функционального состояния клеток на проточном цитофлуориметре, включающее ДНК-цитометрию клеток периферической крови. Комплексные исследования проводятся при хронических инфекционно-воспалительных процессах, новообразованиях, хронических гломерулонефритах на фоне иммуносупрессии, врождённых пороках развития - состояниях, оказывающих влияние на уровень ДНК и клеточный цикл.

Несмотря на преимущества проточной цитометрии (высокая точность, быстрота анализа), множество вопросов возникает при изучении функциональной активности клеток периферической крови и особенно процессов пролиферации. В связи с этим, актуальным является определение роли и места проточной ДНК-цитометрии в диагностике и прогнозе различных патологических состояний в педиатрической практике.

Цель исследования

Определить диагностическое и прогностическое значение ДНК-цитометрии периферической крови в комплексной оценке иммунного статуса и функционального состояния клеток при различных патологических состояниях у детей.

Задачи исследования

1 Провести клинико-иммунологическое обследование, ДНК-цитометрию клеток периферической крови у здоровых детей, определить корреляционные взаимосвязи между изучаемыми параметрами.

2 Оценить иммунологическую реактивность у детей с врождёнными пороками развития мочеполовой системы, хроническими гломерулонефритами, опухолями головного мозга и острыми лейкозами.

3 Методом ДНК-цитометрии охарактеризовать плоидность и кинетику клеточного цикла клеток периферической крови у детей с врождёнными пороками развития мочеполовой системы, хроническими гломерулонефритами, опухолями головного мозга и острыми лейкозами.

4 Оценить корреляционные взаимосвязи между параметрами, характеризующими иммунный статус и показателями ДНК-цитометрии клеток периферической крови при различных патологических состояниях у детей.

Научная новизна

Впервые дана характеристика плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови методом проточной ДНК-цитометрии и установлена взаимозависимость между иммунологическими параметрами, показателями ДНК-гистограмм у практически здоровых детей, при хронических инфекционно-воспалительных процессах на фоне врожденных пороков развития мочеполовой системы и хронических гломерулонефритов, иммуносупрессивной терапии, при опухолевой трансформации.

Научно-практическая значимость работы

Определены области применения ДНК - цитометрии клеток периферической крови при различных патологических состояниях у детей в качестве показателей:

1) выраженности деструктивно-дистрофических изменений в почках при хронической почечной недостаточности на фоне врождённых пороков развития мочеполовой системы;

2) степени активности процесса и эффективности иммуносупрессии при хроническом гломерулонефрите;

3) агрессивности течения заболевания при острых лейкозах.

Установлены особенности иммунологической реактивности, проявляющиеся у здоровых детей активацией, а при хронических инфекционно-воспалительных процессах супрессией клеточных эффекторных механизмов иммунной защиты, которые необходимо учитывать при разработке адаптационных норм и назначении иммунокоррекции.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы комплексных исследований, включающих показатели ДНК-цитометрии клеток периферической крови и иммунного статуса, используются в работе отделений клинической иммунологии, нефрологии, урологии, онкогематологии, нейрохирургии, отделении гемодиализа и трансплантации почки Республиканской детской клинической больницы, на циклах повышения квалификации врачей клинической лабораторной диагностики Института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1 ДНК-гистограммы клеток периферической крови практически здоровых детей соответствуют диплоидному содержанию ДНК. Основная масса клеток находится в G1 фазе клеточного цикла. Иммунный статус характеризуется высоким уровнем цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток.

2 При врождённых пороках развития мочеполовой системы у детей развивается комплекс иммунопатологических реакций в виде депрессии показателей противовирусной защиты (CD8⁺; CD16⁺56⁺), высокого содержания циркулирующих иммунных комплексов. Компенсированная стадия хронической почечной недостаточности характеризуется диплоидным типом гистограмм, в терминальной стадии выявляется анеуплоидия.

3 Иммунологическая реактивность у больных хроническим гломерулонефритом характеризуется снижением уровня естественных киллерных клеток, высоким содержанием клеток, несущих маркёры активации (CD25⁺) и циркулирующих иммунных комплексов. При хроническом гломерулонефрите на фоне базисной терапии отмечаются достоверные различия с контрольной группой по показателям кинетики клеточного цикла (фазы пролиферации).

4 К особенностям иммунологической реактивности при опухолях головного мозга относится высокое содержание в крови В-лимфоцитов и клеток, несущих маркеры ранней активации (CD25⁺), при остром В-лимфобластном лейкозе - В-лимфоцитоз. Доброкачественные и злокачественные новообразования головного мозга характеризуются диплоидным типом гистограмм, анеуплоидия выявляется при остром В-лимфобластном лейкозе.

5 Корреляционным анализом взаимосвязей между параметрами иммунного статуса и показателями ДНК-цитометрии установлены различные типы межклеточной кооперации.

Апробация работы

Основные положения диссертации обсуждены на научно-практической конференции «Педиатрия в Приволжском Федеральном Округе» (Казань, 2004); научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (СПб., 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям, новые технологии специализированной медицинской помощи. Роль стационарных детских учреждений в выполнении федеральных программ» (Уфа, 2007).

Апробация диссертации проведена на расширенном межкафедральном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, педиатрии и детской хирургии ИПО, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, детской хирургии, ортопедии и анестезиологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава (протокол № 1 от 11.12.2008), на заседании Объединенного совета ДМ 208.006.05 (протокол №1 от 29.01.2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 в изданиях журналов, рекомендованных ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста и состоит из обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа содержит 28 таблиц, 25 рисунков. Список литературы включает 204 источников (106 отечественных и 98 иностранных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе отделения клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (г. Уфа).

В соответствии с поставленной целью и задачами исследования проводили в несколько этапов. На первом этапе осуществляли клинико-лабораторное обследование практически здоровых детей (контрольная группа, n=30), отвечавших следующим требованиям [Хайруллина Р.М., 1999]:

- отсутствие жалоб на нарушения состояния здоровья в момент осмотра;

- эпизоды вирусных заболеваний не более 4 раз в течение года;

- отсутствие признаков аллергии и другой хронической патологии.

Следующим этапом работы было комплексное клинико-лабораторное обследование 84 детей с различными нозологическими формами заболеваний:

- врожденные пороки развития мочеполовой системы (ВПРМПС), осложненные пиелонефритом и хронической почечной недостаточностью различной степени тяжести: двухсторонний мегауретер (n=10), гипоплазия (n=5), поликистоз (n=4) или удвоение почек (n=4);

- хронический гломерулонефрит (ХГН) (нефротическая и смешанная формы) с начальными признаками нарушений детоксицирующей и выделительной функции почек. Обследование пациентов (n=20) проводили на фоне базисной терапии ХГН, включающей прием гормонов (преднизолон) и цитостатиков (хлорбутин, азатиаприн), механизм иммуносупрессивного действия которых связан с влиянием на пролиферативную фазу иммунного ответа [Цыгин А.Н., Сергеева Т.В., 1998];

- опухоли головного мозга: 10 больных с доброкачественными (краниофарингеома, зрелая тератома), 12 - со злокачественными новообразованиями головного мозга (опухоль лобной доли, III желудочка, медуллобластома, саркома, астроцитома, диффузная глиома ствола мозга). Клинико-иммунологическое обследование проводили до удаления массива опухоли. Злокачественный характер опухоли подтверждался результатами гистологических исследований;

- острые лейкозы: 16 больных с острым В-лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), 3 - с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ); обследование проводили в день постановки диагноза до назначения соответствующей терапии.

Комплексное обследование больных включало сбор анамнеза, анализ клинических данных, проведение лабораторных исследований. Иммунологическое обследование проводилось с использованием комплекса стандартизированных тестов, включающих оценку:

- клеточного звена иммунитета на проточном цитофлуориметре FACSCalibur с программным обеспечением SimulSet c использованием моноклональных антител фирмы Becton Dickinson и определением относительного содержания основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺56⁺, CD19⁺, CD25⁺, CD95⁺, HLA-DR⁺);

- плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови методом проточной ДНК - цитометрии, основанным на связывании ДНК с флуоресцентным зондом - пропидиума йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 000 клеток) анализировали на проточном цитофлуориметре, оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit;

- концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G (Ig A, Ig М, Ig G) определяемых методом радиальной иммунодиффузии в геле [Manchini G. et al.,1965];

- уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) осаждением полиэтиленгликолем (мол. масса -6000) [Имельбаева Э.А. и др., 2006].

Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде «Windows-XP» с использованием современных пакетов прикладных программ «STATISTICA 6.0». Для показателей, имеющих нормальное распределение признака, вычислялись среднее арифметическое значение (М) и стандартная ошибка среднего значения (m). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялись медиана и интеркартильный размах (25 - 75 перцентили). Достоверность различий оценивалась по критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ выполнялся по методу Спирмена с определением коэффициента ранговой корреляции (rs). Значения р 0,05 приняты статистически значимыми [Гланц С., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели иммунологической реактивности и ДНК-цитометрии клеток периферической крови у здоровых детей и при различных патологических состояниях.

Изучение особенностей иммунологической реактивности при различных патологических состояниях невозможно без чёткого представления о норме. Нормативные показатели для каждого региона формируются при воздействии на организм человека различных внешних факторов. Изучение особенностей иммунологической реактивности практически здоровых детей проводилось в сравнении с нормативными показателями по РФ [Луговская С.А., Морозова В.Т., 2006] (табл. 1).

Таблица 1 - Иммунологические показатели практически здоровых детей

Показатели	Контрольная группа, Mm (n=30)	Средние показатели по РФ, Mm
Ig A, (г/л)	1,010,12	1,46 0,38
Ig M,(г/л)	1,260,21	1,04 0,46
Ig G,(г/л)	10,680,57*	12,20 0,27
ЦИК, у.е.	29,242,50	До 50 у.е.
CD3+ (%)	62,101,31	64,00 1,20
CD4+ (%)	37,431,26	38,50 0,75
CD8+ (%)	37,051,53*	31,50 0,85
CD19+ (%)	14,760,90*	12,00 0,60
CD16+56+ (%)	22,101,73*	14,00 0,50
HLA-DR+ (%)	9,900,87*	14,00 0,80
CD25+ (%)	16,840,90*	9,00 0,90
CD95+ (%)	28,503,67	Нет данных
CD4+/CD8+	1,060,07*	1,35 0,04

*- различие статистически значимо (р0,05)

Клеточное звено иммунитета у детей контрольной группы характеризовалось высоким уровнем содержания эффекторных клеток: цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8⁺), естественных киллерных клеток (CD16⁺56⁺), а также повышенным количеством клеток, несущих маркёры ранней активации (CD25⁺).

При сравнительной оценке состояния гуморального звена иммунитета в сыворотке крови у здоровых детей было выявлено снижение уровня Ig G. Перечисленные различия, очевидно, являются отражением адаптационных особенностей иммунологической реактивности.

Наряду с клинико-иммунологическими исследованиями, у детей контрольной группы была проведена ДНК - цитометрия клеток периферической крови. Как следует из таблицы 2, в 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причём основная масса клеток (99,860,02%) находилась в G0/1-фазе клеточного цикла, т.е. на стадии реализации присущих клетке функций в интересах ткани и организма в целом [Мазурик В.К., 2001].

Таблица 2 - Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у здоровых детей (n=30)

Фазы клет. цикла Группа	Плоидность клеток	G0/1-фаза клеточного цикла	G2-фаза клеточного цикла	S-фаза клеточного цикла	CV
Контр.группа Mm , %	100	99,86 0,02	0,04 0,01	0,1 0,01	2,480,09

Доля клеток в стадии синтеза ДНК (S-фаза) составляла 0,10,01%, в фазе G2-М - 0,040,01%. На рисунке 1 представлена типичная гистограмма распределения популяции клеток (46XY) по содержанию ДНК, позволяющая идентифицировать клетки в фазах G0/1 (диплоидные), S (в стадии синтеза ДНК) и G2+М (тетраплоидные и в стадии митоза).



Рисунок 1 - Гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла в контрольной группе.

Одним из основных направлений работы было изучение взаимного влияния иммунных механизмов и функционального состояния клеток периферической крови на клинической модели инфекционно-воспалительного процесса при врождённых пороках развития, хронических гломерулонефритах на фоне иммуносупрессии и опухолевой трансформации.

В последние годы в Республике Башкортостан отмечается тенденция к увеличению числа детей, родившихся с пороками развития МПС [Мурзабаева С.Ш., Марданова А.К., и др., 2005]. Учитывая актуальность проблемы, проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование больных с различными пороками развития почек и мочевых путей, осложненных пиелонефритом и хронической почечной недостаточностью (ХПН) различной степени тяжести. Согласно классификации Н.А Лопаткина и И.Н. Кучинского (2007) и на основании клинического течения заболевания было выделено две подгруппы детей: у пациентов первой подгруппы была установлена интермитирующая и терминальная стадии ХПН, во 2-ой - латентная и компенсированная.

По данным ДНК-цитометрии, в первой подгруппе была выявлена анеуплоидия клеток периферической крови: 40,96% клеток были анеуплоидными, 52,64%- диплоидными. Во второй подгруппе гистограммы характеризовались диплоидным типом (таблица 3).

Таблица 3 - Распределение клеток периферической крови у детей с врождёнными пороками развития МПС по плоидности и фазам клеточного цикла

Плоидность и фазы клеточного цикла	Контрольная группа (n= 30), Ме	1-ая подгруппа (n= 12), Мe	2-ая подгруппа (n= 11), Ме
Диплоидные %	100	52,64 (2,70-65,97)	100
G0/1 %	99,89 (99,83-99,90)	94,31** (74,26-99,97)	99,02** (97,74-99,70)
G2 %	0,02 (0,00-0,04)	0,02 (0,00-8,00)	0,00 (0,00-0,05)
S %	0,10 (0,09-0,11)	5,70** (0,22-10,94)	0,76** (0,25-2,26)
CV	2,57 (2,29-2,83)	4,38* (3,03-6,71)	5,67* (7,59-7,11)
Анеуплоидные %	0	40,96 (24,16-95,30)	0
G0/1 %	0	99,67 (97,86-99,87)	0
G2 %	0	0,00 (0,00-0,04)	0
S %	0	0,29 (0,00-2,10)	0
CV	0	4,29 (3,78-5,52)	0

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,01)

При изучении кинетики клеточного цикла было установлено, что основная масса клеток у детей с врождёнными пороками развития МПС находилась в G0/1-фазе клеточного цикла. Пролиферативная активность клеток периферической крови превышала показатели контрольной группы. Так, при диплоидном типе гистограмм доля клеток в S-фазе составила 0,76%, при гиперплоидии - 5,70%. Дети обеих подгрупп на момент обследования не принимали химиопрепараты, способные повлиять на клеточный цикл. Можно предположить, что митогенами для клеток являлись инфекционные агенты.

В таблице 4 приведены данные иммунологических показателей у детей обеих подгрупп.

Таблица 4 - Сравнительная характеристика иммунологических показателей у детей с врождёнными пороками развития мочеполовой системы

Показатели	Контрольная группа (n=30)	1-ая подгруппа (n=12)	2-ая подгруппа (n=11)
Ig A, (г/л)	0,86 (0,75-1,09)	0,90 (0,68-1,98)	1,52 (0,93-2,3)
Ig M,(г/л)	0,91 (0,70-1,44)	1,00 (0,88-1,03)	1,46 (0,78-2,08)
Ig G,(г/л)	10,00 (9,00-12,50)	10,00 (8,50-11,00)	16,00 (11,50-20,90)
ЦИК, у. е.	31,00 (25,00-35,00)	38,00 (34,00-96,00)	41,00* (37,00-46,00)
CD3+ (%)	62,00 (58,00-67,00)	68,00 (65,00-71,00)	77,00* (66,00-80,00)
CD4+ (%)	38,00 (33,00-39,00)	38,00 (37,00-40,00)	48,00 (44,00-53,00)
CD8+ (%)	37,00 (31,00-41,00)	28,50** (25,00-32,00)	26,00** (25,00-28,00)
CD19+ (%)	15,00 (12,00-17,00)	12,00 (11,00-15,00)	12,00 (10,00-13,00)
CD16+56+ (%)	22,00 (18,00-28,00)	9,50** (6,00-13,00)	12,00* (10,00-12,00)
HLA-DR+ (%)	9,00 (7,00-12,00)	9,00 (7,00-11,00)	9,00 (8,00-10,00)
CD25+ (%)	17,00 (15,00-20,00)	13,50 (8,00-18,00)	11,00 (9,00-14,00)
CD4+/CD8+	1,00 (0,85-1,20)	1,38* (1,20-1,58)	2,00** (1,71-2,04)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,01)

В результате сравнительного анализа выявлены однотипные иммунопатологические реакции, а именно: увеличение содержания ЦИК, повышение значений иммунорегуляторного индекса (CD4⁺/CD8⁺), низкий уровень цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8⁺), естественных киллерных клеток (CD16⁺56⁺).

На рисунке 2 представлена гистограмма больного Л. с диагнозом: Нейромышечная дисплазия мочевой системы. Двухсторонний нерефлексирующий мегауретер. Хронический пиелонефрит. Ренальная гипертензия. ХПН, терминальная стадия.

Рисунок 2 - ДНК- гистограмма клеток периферической крови больного Л.

Таким образом, у детей с врожденными пороками развития в терминальной стадии хронической почечной недостаточности, выявлялась анеуплоидия клеток периферической крови. После билатеральной нефрэктомии, в отдельных случаях, отмечалась трансформация анеуплоидного типа гистограмм в диплоидный. Возможно, одной из причин выявленного транзиторного изменения плоидности клеток, являлась деструкция почечной ткани, так как проведенными ранее морфологическими исследованиями было установлено наличие деструктивно- дистрофических нарушений в интерстиции почек в терминальной стадии ХПН при врождённых пороках мочеполовой системы [Казанская И.В., 1987].

Важную роль в патогенезе хронических гломерулонефритов играют аутоиммунные и иммунокомплексные процессы. В связи с этим, одной из актуальных проблем детской нефрологии является оценка эффективности иммуносупрессии как необходимого элемента базисной терапии.

ДНК- гистограммы периферической крови у детей с хроническим гломерулонефритом в 100% случаях характеризовались диплоидным набором хромосом (таблица 5).

гломерулонефрит кровь реактивность детский

Таблица 5 - Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей с хроническим гломерулонефритом

Плоидность и фазы клеточного цикла	Контрольная группа (n= 30), Ме	Дети с ХГН (n= 20), Ме
Диплоидные %	100	100
G0/1 %	99,89 (99,83-99,90)	99,77 (99,32-99,83) **
G2 %	0,02 (0,00-0,04)	0,09 (0,04-0,16) **
S %	0,10 (0,09-0,11)	0,15 (0,09-0,37) *
CV %	2,57 (2,29-2,83)	3,06 (2,38-3,84) **

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,01)

Различия отмечались во всех фазах клеточного цикла, но наиболее значимыми они были в фазах пролиферации (S+G2/M), несмотря на то, что дети получали базисную иммуносупрессивную терапию.

Показатели иммунного статуса характеризовались увеличением количества общих Т-лимфоцитов (CD3⁺ клеток), высоким уровнем маркёра ранней активации (CD25⁺), низким содержанием иммуноглобулинов класса G, естественных киллерных клеток (CD16⁺56⁺) (таблица 6).

Таблица 6 - Характеристика иммунологических показателей у детей с хроническими гломерулонефритами

Показатели	Контрольная группа (n=30)	Дети с ХГН (n=20)
Ig A, (г/л)	0,86 (0,75-1,09)	1,13 (0,86-1,55)
Ig M,(г/л)	0,91 (0,70-1,44)	1,34 (0,72-3,26)
Ig G,(г/л)	10,00 (9,00-12,50)	7,00* (4,00-9,60)
ЦИК, у. е.	31,00 (25,00-35,00)	37,50 (26,00-41,00)
CD3+ (%)	62,00 (58,00-67,00)	70,00* (63,00-78,00)
CD4+ (%)	38,00 (33,00-39,00)	36,00 (31,00-41,00)
CD8+ (%)	37,00 (31,00-41,00)	40,00 (35,00-46,00)
CD19+ (%)	15,00 (12,00-17,00)	18,00 (7,00-22,00)
CD16+56+ (%)	22,00 (18,00-28,00)	16,00** (7,00-18,00)
HLA-DR+ (%)	9,00 (7,00-12,00)	8,00 (6,00-19,00)
CD25+ (%)	17,00 (15,00-20,00)	25,00* (18,00-36,00)
CD95+ (%)	32,50 (13,00-38,00)	27,00 (17,50-41,50)
CD4+/CD8+	1,00 (0,85-1,20)	0,87 (0,77-1,08)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,01),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,001)

Перечисленные особенности иммунологической реактивности и ДНК-цитометрии клеток периферической крови отражают реакцию организма на базисную терапию. Комплексный подход, объединяющий клиническую картину заболевания, иммунологические показатели, кинетику клеточного цикла, позволяет всесторонне оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессивной терапии.

В структуре летальности от новообразований у детей одно из ведущих мест занимают лейкемии и опухоли головного мозга. Для характеристики иммунологической реактивности и функционального состояния клеток периферической крови в условиях опухолевой трансформации нами проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование детей с острыми лейкозами, доброкачественными и злокачественными новообразованиями головного мозга. Группы были подобраны с учётом прямого и опосредованного воздействия опухолевого процесса на клетки периферической крови.

По данным ДНК-цитометрии у детей со злокачественными и доброкачественными опухолями головного мозга клетки периферической крови имели диплоидный набор хромосом. Во всех группах наблюдений количество клеток в G0/1 фазе клеточного цикла было достоверно ниже, чем в контроле. Доля клеток в фазе синтеза ДНК, характеризующей пролиферативную активность, превышала данные контрольной группы, и составило 0,16% и 0,20% (таблица 7).

Таблица 7 - Распределение клеток периферической крови у детей с опухолями головного мозга и контрольной группы

Плоидность и фазы клеточного цикла	Контрольная группа, (n= 30) Ме	Группа со злокачественными опухолями, (n=12) Ме	Группа с доброкачественными опухолями, (n=10) Ме
Диплоид. %	100	100	100
G0/1 %	99,89 (99,83-99,90)	99,51* (99,38-99,85)	99,75* (99,50-99,87)
G2 %	0,02 (0,00-0,04)	0,05 (0,00-0,43)	0,05 (0,03-0,10)
S %	0,10 (0,09-0,11)	0,16* (0,13-0,20)	0,20* (0,12-0,39)
CV %	2,57 (2,29-2,83)	2,65 (2,44-2,67)	2,63 (2,11-2,73)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05)

Иммунофенотипирование лимфоцитов методом проточной цитометрии выявило достоверное повышение содержания В-лимфоцитов (CD19⁺) и высокий уровень клеток с маркёром ранней активации (CD25⁺) у детей обеих групп. Показатели гуморального звена иммунитета в группе детей с доброкачественными опухолями головного мозга не имели достоверных различий с контролем. У детей со злокачественными новообразованиями отмечалось достоверное, в сравнении с контрольной группой, снижение уровня Ig G (таблица 8).

Таблица 8 - Характеристика иммунологических показателей детей с опухолями головного мозга

Показатели	Контрольная группа,(n=30) Ме	Группа со злокачественными опухолями (n=12), Ме	Группа с доброкачественными опухолями (n=10), Ме
Ig A, (г/л)	0,86 (0,75-1,09)	0,83 (0,57-0,97)	1,02 (0,94-1,04)
Ig M,(г/л)	0,91 (0,70-1,44)	1,45 (0,96-1,63)	0,97 (0,85-1,35)
Ig G,(г/л)	10,00 (9,00-12,50)	8,30* (5,90-8,60)	11,40 (10,60-13,00)
ЦИК, у. е.	31,00 (25,00-35,00)	26,50 (21,50-37,00)	21,00 (20,00-49,00)
CD3+ (%)	62,00 (58,00-67,00)	62,00 (53,00-67,00)	65,00 (51,00-74,00)
CD4+ (%)	38,00 (33,00-39,00)	33,00 (30,00-40,00)	38,00 (33,00-41,00)
CD8+ (%)	37,00 (31,00-41,00)	35,00 (31,00-43,00)	37,00 (32,00-46,00)
CD19+ (%)	15,00 (12,00-17,00)	26,00** (24,00-30,00)	21,00* (19,00-24,00)
CD16+56+ (%)	22,00 (18,00-28,00)	12,00 (7,00-30,00)	16,00 (12,00-17,00)
HLA-DR+ (%)	9,00 (7,00-12,00)	7,00 (6,00-9,00)	5,00 (5,00-11,00)
CD25+ (%)	17,00 (15,00-20,00)	28,00* (22,00-36,00)	27,00* (21,50-29,00)
CD95+ (%)	32,50 (13,00-38,00)	21,00 (19,00-36,00)	13,00 (11,00-21,50)
CD4+/CD8+	1,00 (0,85-1,20)	1,03 (0,85-1,17)	0,85 (0,81-1,24)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,005)

Диагноз острого лейкоза устанавливался на основании клинической картины заболевания, цитоморфологических исследований и иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга.

У детей с ОМЛ выявлялся диплоидный тип гистограмм. В зависимости от плоидности клеток периферической крови больные с В-ОЛЛ были разделены на две группы: с диплоидным и анеуплоидным типом гистограмм.

Результаты ДНК-цитометрии у детей с В-ОЛЛ отражены в таблице 9. При диплоидном типе гистограмм были выявлены достоверные различия по количеству клеток в G0/1 и S-фазах клеточного цикла. Так, в фазе G0/1 находилось 99,00% клеток (в контрольной группе - 99,89%). Доля клеток в S-фазе составила 0,90%, в контроле- 0,10%. При анеуплоидии различия касались лишь количества диплоидных клеток, что составило 80,0%.

Таблица 9 - Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей с острым В-лимфобластным лейкозом

Плоидность и фазы клеточного цикла	Контрольная группа (n= 30), Ме	Группа с В-ОЛЛ Диплоидный, (n=10) Ме (%)	Группа с В-ОЛЛ анеуплоидный (n=6) Ме (%)
Диплоидные %	100	100	80,00** (63,60-93,00)
G0/1 %	99,89 (99,83-99,90)	99,00** (95,6 -99,40)	99,90 (99,80-100,0)
G2 %	0,02 (0,00-0,04)	0,10 (0,00-0,20)	0,10 (0,01-0,02)
S %	0,10 (0,09-0,11)	0,90** (0,50-4,50)	0,00 (0,00-0,00)
CV %	2,57 (2,29-2,83)	3,70* (2,60-4,40)	2,80 (2,70-3,5)
Анеуплоидные %	0	0	20,00 (7,00-36,40)
G0/1 %	0	0	96,75 (95,80-98,50)
G2 %	0	0	0,00 (0,00-0,00)
S %	0	0	3,80 (0,00-4,90)
CV %	0	0	3,30 (2,60-3,80)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,001)

В группе с диплоидным типом гистограмм отмечалось снижение уровня IgG, во 2-ой группе достоверных различий с контролем по показателям гуморального звена не выявлено (таблица 10).

Показатели клеточного иммунитета в 1-группе характеризовались низким уровнем содержания общих Т-лимфоцитов (CD3⁺), цитотоксических Т-лимфоцитов(CD8⁺), ЕКК (CD16⁺56⁺) и В-лимфоцитозом (CD19⁺). При анеуплоидии (2-ая группа), наряду с высоким уровнем В-лимфоцитов, отмечался дефицит естественных киллерных клеток.

Таблица 10 - Характеристика иммунологических показателей детей с острым В-лимфобластным лейкозом

Показатели	Контрольная группа (n=30)	Группа с В-ОЛЛ Диплоидный (n=10)	Группа с В-ОЛЛ анеуплоидный (n=6)
Ig A, (г/л)	0,86 (0,75-1,09)	0,70 (0,60-0,70)	0,80 (0,70-0,80)
Ig M,(г/л)	0,91 (0,70-1,44)	0,60 (0,50-0,60)	0,60 (0,60-1,10)
Ig G,(г/л)	10,00 (9,00-12,50)	7,80* (6,00-8,40)	8,80 (7,40-9,20)
ЦИК, у. е.	31,00 (25,00-35,00)	34,00 (28,00-37,00)	35,00 (21,00-38,00)
CD3+ (%)	62,00 (58,00-67,00)	25,50** (9,00-54,00)	51,50 (37,00+73,00)
CD4+ (%)	38,00 (33,00-39,00)	25,50 (10,00-40,00)	41,00 (27,00-41,00)
CD8+ (%)	37,00 (31,00-41,00)	14,00** (10,00-27,00)	22,00 (18,00-35,00)
CD19+ (%)	15,00 (12,00-17,00)	61,00** (45,00-75,00)	63,00** (26,00-67,00)
CD16+56+ (%)	22,00 (18,00-28,00)	6,00* (3,00-7,50)	14,00** (8,00-15,00)
HLA-DR+ (%)	9,00 (7,00-12,00)	7,00 (3,00-65,00)	7,00 (6,00-10,00)
CD25+ (%)	17,00 (15,00-20,00)	22,00* (20,00-50,00)	15,50 (12,00-19,50)
CD95+ (%)	32,50 (13,00-38,00)	16,50 (9,00-25,50)	15,00 (14,00-20,00)

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05),

** - различие с контролем статистически значимо (р0,001)

Корреляционные взаимосвязи между показателями иммунного статуса и ДНК-цитометрии клеток периферической крови.

Для изучения взаимосвязей между различными звеньями системы иммунитета и данными ДНК-цитометрии проведён корреляционный анализ (рисунок 3).

В контрольной группе прямые взаимосвязи высокой степени интенсивности установлены между количеством диплоидных клеток, находящихся в G0/1-фазе и количеством CD4⁺, CD25⁺-клеток, что, очевидно, отражает нормальное содержание ДНК в клетках-индукторах.



Размещено на http://www.allbest.ru/

При врождённых пороках развития МПС была выявлена прямая корреляционная зависимость между количеством анеуплоидных клеток и ЕКК (CD16⁺56⁺) клетками (rs = 0,94), что мы расценили как высокую степень сопряженности естественных киллерных клеток с феноменом анеуплоидии. Анализ корреляционных связей в популяции Т-лимфоцитов с хелперной активностью (CD4⁺) позволил сделать вывод о том, что наиболее типичным вариантом для CD4⁺ клеток является диплоидный набор хромосом, причём большая часть Т-хелперов - индукторов находилась в фазе синтеза ДНК.

Особенности кинетики клеточного цикла в группе детей с хроническим гломерулонефритом отражены в корреляционных взаимосвязях между числом диплоидных клеток в G1-фазе и количеством сегментоядерных нейтрофилов (rs =0,71), а также числом диплоидных клеток в S-фазе и содержанием лимфоцитов (rs = 0,79).

Исследованиями в области онкологии доказано, что цитотоксические Т-лимфоциты (CD8⁺), проникая через гематоэнцефалический барьер, вступают в непосредственный контакт с опухолевыми клетками и течение злокачественного процесса зависит, наряду с прочими факторами, от уровня цитотоксической активности иммунокомпетентных клеток [Perrini G., et al. 1999]. Корреляционная матрица в группе больных с опухолями головного мозга, отражающая обратную связь между цитотоксическими Т-лимфоцитами и способностью клеток к пролиферации, по нашему мнению, характеризует клеточные механизмы, обеспечивающие противоопухолевую защиту.

Анализ корреляционных взаимосвязей у больных с острыми лейкозами выявил различные типы межклеточной кооперации в зависимости от плоидности клеток. При диплоидном типе гистограмм наиболее выраженной (rs = 0,70) была взаимосвязь между количеством клеток в G1-фазе и цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8⁺). Высокий уровень сопряжённости между В-лимфоцитами и количеством клеток с анеуплоидией (rs = 0,81), установлен во второй группе, что вполне логично, так как именно эта популяция подвержена неконтролируемой пролиферации при В-ОЛЛ.

Таким образом, прикладное значение проведенных комплексных исследований заключается в определении диагностических и прогностических возможностей ДНК - цитометрии клеток периферической крови и установлении взаимосвязей между иммунологическими показателями и функциональными характеристиками клеток у здоровых детей и при различных патологических состояниях.

Изучение процессов, протекающих в иммунокомпетентных клетках, включающих определение плоидности и кинетики клеточного цикла, способствует оптимизации диагностики и лечения детей с различными заболеваниями. Результаты проведённых исследований, особенности ДНК-цитометрии периферической крови, внесут свой вклад в формирование лабораторного перечня для характеристики функционального состояния клеток.

ВЫВОДЫ

1 ДНК-цитометрия клеток периферической крови у практически здоровых детей характеризуется диплоидным типом гистограмм: (99,860,02)% клеток находится в G0/1- фазе, (0,10,01)% в стадии синтеза ДНК (S-фазе), в G2/М - фазе - (0,040,01)%. К особенностям иммунологической реактивности у здоровых детей относится высокий уровень цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток (CD16⁺56⁺).

2 Иммунопатологические реакции при врождённых пороках развития мочеполовой системы у детей характеризуются снижением цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток, высоким уровнем циркулирующих иммунных комплексов. При хронических гломерулонефритах отмечается снижение количества естественных киллерных клеток, высокое содержание клеток с маркёрами активации (CD25⁺) и циркулирующих иммунных комплексов. При доброкачественных и злокачественных опухолях головного мозга выявляется высокое содержание В-лимфоцитов и клеток с маркёрами активации (CD25⁺), при остром В-лимфобластном лейкозе - В-лимфоцитоз (CD19⁺).

3 ДНК-гистограммы во всех группах наблюдения характеризуются диплоидным типом. Анеуплоидия выявляется у детей с врождёнными пороками развития мочеполовой системы в терминальной стадии хронической почечной недостаточности и остром В - лимфобластном лейкозе. При хроническом гломерулонефрите на фоне базисной терапии отмечаются достоверные различия с контрольной группой по показателям кинетики клеточного цикла (фазы пролиферации).

4 При врождённых пороках развития мочеполовой системы в терминальной стадии хронической почечной недостаточности анеуплоидия сопряжена с естественными киллерными клетками, а при остром В-лимфобластном лейкозе - с В-лимфоцитами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Результаты иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии клеток периферической крови в группе здоровых детей рекомендуются в качестве ориентировочных нормативных показателей при сравнительной оценке иммунного статуса и функционального состояния клеток.

2 Рекомендовано включение ДНК-цитометрии клеток периферической крови в иммунологический мониторинг перед трансплантацией почки для исключения анеуплоидии.

3 Мониторинг показателей пролиферативной активности клеток по данным ДНК-цитометрии периферической крови рекомендован в качестве маркера активности процесса и эффективности иммуносупрессивной терапии при хронических гломерулонефритах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 ДНК-цитометрия в диагностике лейкозов / З.Р. Хаматдинова, Р.М. Хайруллина, Т.Н. Красавцева, Е.В. Чувилина // Нижегородский медицинский журнал «Здравоохранение Приволжского Федерального Округа». - 2004. - С. 53.

2 Проточная цитометрия в диагностике острых лейкозов у детей / Р.М. Хайруллина, З.Р. Хаматдинова, А.Ж. Гильманов, Е.В. Чувилина, Н.Ф. Хисамова // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, № 2-3. - С. 212.

3 ДНК - цитометрия клеток периферической крови у детей с патологией мочеполовой системы / Н.Ф. Хисамова, З.Р. Хаматдинова, Р.М. Хайруллина, Р.З. Ахметшин // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 343.

4 Иммунофенотипическая характеристика бластных клеток при верификации острых лейкозов / З.Р. Хаматдинова, Р.М. Хайруллина, Н.Ф. Хисамова, Т.Н. Красавцева // Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Уфа, 2007. - С. 213.

5 ДНК-цитометрия периферической крови в педиатрической практике / Н.Ф. Хисамова, Р.М. Хайруллина, З.Р. Хаматдинова, А.Ж. Гильманов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 9 - С. 57.

6 DNA CONTENT IN PERIFERAL WHITE BLOOD CELL AT CONGENITAL URINARY TRACT MALFORMATIONS IN CHILDREN / N. Khisamova, R. Khairullina, Z. Khamatdinova, A. Gilmanov // Laboratorine MEDICINA. - 2008. - Vol. 10: Program and Abstracts 9^th Baltic Congress of Laboratory Medicine. - P. 27.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

РФ - Российская Федерация

ХГН - хронический гломерулонефрит

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ВПРМПС - врождённые пороки развития мочеполовой системы

МПС - мочеполовая система

СD - кластеры дифференцировки

Ig A - иммуноглобулины класса А

Ig M - иммуноглобулины класса М

Ig G - иммуноглобулины класса G

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЕКК - естественные киллерные клетки

ИКК - иммунокомпетентные клетки

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

В-ОЛЛ - острый В-лимфобластный лейкоз

Размещено на Allbest.ru