Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях
Изучение спектра и относительных частот диагностически значимых мутаций в гене в обширной выборке российских больных муковисцидозом. Оценка и характеристика распространенности некоторых мутаций гена в разных этнических группах коренного населения России.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 02.08.2018 |
| Размер файла | 143,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях
03.00.15 - генетика
Петрова Ника Валентиновна
Москва - 2009
Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра РАМН, Москва
Научный консультант: академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Евгений Константинович Гинтер
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, Наталья Николаевна Вейко
доктор биологических наук, профессор Светлана Андреевна Лимборская
доктор биологических наук, профессор Валерий ВячеславовичНосиков
Ведущее научное учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита диссертации состоится «02» февраля 2009 г. на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН (ГУ МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН.
Автореферат разослан 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01, доктор медицинских наук Р.А. Зинченко.
Характеристика работы
Актуальность исследования.
Муковисцидоз (МВ, CF; OMIM #219700) наиболее частое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов и выполняет ряд иных важных функций (Riordan J.M. et al., 1989). При муковисцидозе в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма: органов дыхания, системы пищеварения (поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт), а также потовые железы и урогенитальный тракт (Капранов Н.И. и др., 2004; Witt H., 2003).
В настоящий момент описаны более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR (CFTR mutation database, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), частоты которых широко варьируют в разных этнических группах. Спектры различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью, являясь отражением генетических процессов, формирующих популяции. Частота МВ варьирует в разных популяциях мира в весьма широких пределах (например, в Европе от 1:1800 новорожденных в Ирландии до 1:26000 новорожденных в Финляндии) (WHO, 2004). Оценки частоты MB в разных популяциях Российской Федерации (РФ) также весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 живорождённых) (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997; Капранов Н.И., 2001; Капранов Н.И., 2006; Радионович А.М. и др., 2005; Воронин С.В. и др., 2007; Матулевич С.А., 2007; Михальчук В.В. и др., 2007; Одинокова О.Н. и др., 2007). Значительное различие спектров CFTR мутаций и частоты заболевания вносит объективные сложности в разработку протоколов проведения ДНК-диагностики МВ и проведения генетического консультирования среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах.
Клиническая картина при МВ весьма разнообразна: продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных МВ. И хотя вариабельность клинического течения МВ несомненно обусловлена многочисленностью CFTR мутаций, а следовательно, и CFTR генотипов, но различие в течении МВ, наблюдающееся у больных, имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, позволяет предполагать влияние на клиническую картину МВ других генетических факторов, отличных от гена CFTR (Ferrari M., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006; Mekus F. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007). В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления МВ. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы МВ. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма (Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003; Yarden J. et al., 2005; Garred P.et al., 2003; Thio C.L. et al., 2005; Wiertsema S.P. et al., 2006; Иващенко Т.Э., Баранов В.С., 2000; Келембет Н.А. и др., 2005; Корытина Г.Ф.и др., 2004)..
Несмотря на то, что муковисцидоз интенсивно изучается на протяжении нескольких десятков лет специалистами разных направлений, в том числе и в России, интерес к проблемам этого заболевания не ослабевает. Вопросы распространенности МВ в разных популяциях и этнических группах, выявления гено-фенотипических корреляций, определения факторов, лежащих в основе вариабельности клинических проявлений, особенностей консультирования в связи с введением пресимптоматической диагностики в России не решены до конца.
Цель исследования:
Получение оценки частоты муковисцидоза, изучение молекулярно-генетического разнообразия гена CFTR в российских популяциях, выявление гено-фенотипических корреляций у российских больных и разработка на основе полученных результатов принципов медико-генетического консультирования.
Задачи исследования:
1. Оценить частоту МВ в популяциях европейской части России;
2. Изучить спектр и относительные частоты диагностически значимых мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ;
3. Оценить распространенность некоторых мутаций гена CFTR в разных этнических группах коренного населения России;
4. Изучить генетическую изменчивость локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам в семьях с МВ; оценить возможность использования этих полиморфизмов для косвенной ДНК-диагностики в семьях с частичной информативностью;
5. Изучить клинические особенности МВ у больных в зависимости от CFTR генотипа;
6. Изучить возможное модифицирующее влияние ряда генов на клинические проявления муковисцидоза у больных, гомозиготных по мутации F508del;
7. Разработать принципы медико-генетического консультирования для российских семей, отягощенных МВ. Провести расчеты генетического риска МВ при наличии двух независимых факторов риска (положительный тест на ИРТ и ДНК-тестирование; гиперэхогенный кишечник и ДНК-тестирование).
Научная новизна:
1. Впервые на основе определенных прямыми методами популяционной и относительной частот мутации F508del дана оценка частоты муковисцидоза в популяциях русских европейской части России.
2. Впервые определен спектр частых мутаций в гене CFTR, составляющих до 75,7% мутантных аллелей у российских больных МВ, на основе которого разработаны наборы для ДНК-диагностики.
3. Впервые изучена распространенность семи CFTR мутаций в популяциях европейской части России в пяти этнических группах (русские Ростовской, Тверской, Псковской, Кировской областей, марийцы, чуваши, удмурты, башкиры). Выявлены различия в частоте встречаемости мутации F508del среди изученных этносов.
4. Впервые изучена молекулярно-генетическая изменчивость промоторной и 5' регуляторной областей гена CFTR у российских больных МВ, у которых при предварительном тестировании не идентифицированы одна или обе мутации.
5. Выявлены мутации 3944delTG, 3667delTCAA и L138insA, ранее не обнаруженные у российских больных МВ. Впервые идентифицированы мутации 604insA и K598ins. Мутации L138ins и 604insA можно отнести к относительно частым у российских пациентов с МВ.
6. Впервые в семьях российских больных МВ проанализированы частоты аллелей внутригенного полиморфизма IVS1CA и частоты гаплотипов четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA. Показаны различия в частотах и наборах гаплотипов изученных полиморфизмов, ассоциированных с нормальными и мутантными аллелями гена CFTR.
7. Выявлены три группы мутаций, ассоциированные с определенными гаплотипами четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA-IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17bCA: мутации F508del, N1303K, G542X, 2143del и 394delTT - с гаплотипом 21-6-23-13; мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, L138ins - с гаплотипом 22-7-16-13; мутации W1282X, R334W - с гаплотипом 26-7-17-17.
8. Впервые у российских больных МВ изучена взаимосвязь клинической картины и CFTR генотипа (с учетом классификации мутаций в зависимости от степени дефекта хлорного канала).
9. Впервые на выборке российских больных МВ, гомозиготных по мутации F508del, изучено модифицирующее влияние шести генов на клинические проявления заболевания и показано, что гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать в качестве модификаторов клинической картины заболевания.
10. Впервые для российских семей проведены расчеты генетического риска при наличии двух независимых факторов риска МВ: положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании и положительного или отрицательного результата ДНК-диагностики.
11. Впервые для российских семей показан высокий риск МВ (приближающийся к 0,25) у плода, имеющего гиперэхогенный кишечник во 2-м триместре, при выявлении носительства CFTR мутации одним из родителей.
Научно-практическая значимость работы:
1. Определение спектра и долей частых CFTR мутаций и изучение генетической изменчивости локуса гена CFTR по внутригенным и внегенным полиморфизмам позволило разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики МВ, в том числе пренатальной, в российских семьях, отягощенных муковисцидозом.
2. Обнаружение новых для российских больных МВ CFTR мутаций расширило спектр мутаций, которые можно рекомендовать для рутинного анализа в диагностических лабораториях.
3. Введение полиморфизма IVS1CA в протокол анализа повышает эффективность косвенной диагностики в семьях с неполной информативностью. Использование методов прямой (анализ частых CFTR мутаций) и косвенной (анализ четырех внутригенных и пяти внегенных полиморфизмов) ДНК-диагностики позволяет обеспечить проведение пренатальной диагностики для 99,5% семей, отягощенных муковисцидозом.
4. Изучение взаимосвязи между фенотипом и CFTR генотипом позволяет выявить ассоциации между CFTR мутациями и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы и дать более точный прогноз течения заболевания у больных МВ.
5. Изучение полиморфизмов некоторых генов позволяет выявить возможные механизмы, лежащие в основе клинического разнообразия у пациентов с одинаковым CFTR генотипом.
6. Расчеты риска МВ в случаях положительного результата первого теста на ИРТ у новорожденного или обнаружения гиперэхогенности кишечника у плода при ультразвуковом исследовании с учетом результата ДНК-диагностики могут дать более точный прогноз для потомства при медико-генетическом консультировании.
7. Результаты по выявлению частых, диагностически значимых для российских больных МВ мутаций в гене CFTR и контрольные образцы ДНК с известными мутациями использованы при разработке наборов для ДНК-диагностики МВ (в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН).
Положения, выносимые на защиту:
1. Изучение спектра и относительных частот мутаций в гене CFTR в обширной выборке российских больных МВ (776 индивидов) из разных регионов РФ выявило, что к диагностически значимым можно отнести мутации F508del (54,2%), CFTRdele2,3(21kb) (7,2%), 2143delT (2,1%), W1282X (2,0%), N1303K (1,9%), 3849+10kbC>T (1,9%), 2184insA (1,7%), G542X (1,3%), 1677delTA (0,8%), 3821delT (0,8%), R334W (0,7%), L138ins (0,6%) и 394delTT (0,5%). Доля не охарактеризованных мутантных аллелей составила 23%.
2. В результате изучения частоты семи CFTR мутаций (CFTRdele2,3(21kb), F508del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT и 3821delT) в выборках здоровых индивидов, относящихся к 5 этническим группам РФ: русских из европейской части России, марийцев, удмуртов, чувашей и башкир, показано, что частота мутации F508del среди русских европейской части России значимо выше (0,00518), чем у изученного коренного населения Волго-Уральского региона (<0,002).
3. Частота муковисцидоза, рассчитанная из популяционной и относительной частот мутации F508del для популяций русских европейской части России, составляет 1:10935.
4. Анализ четырех внутригенных маркеров гена CFTR (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) выявляет неравновесие по сцеплению аллелей и гаплотипов в выборках мутантных и нормальных хромосом. Мутация F508del сцеплена с гаплотипами 21-6-17-13 и 21-6-23-17 в 91,8% случаев. Мутации G542X, N1303K, 394delTT и 2143delT ассоциированы с гаплотипом 21-6-23-13. С гаплотипом 22-7-16-13 сцеплены мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA и L138insA; с гаплотипом 26-7-17-17 - мутации W1282X и R334W. Самым частым в выборке нормальных хромосом родителей больных МВ (23,5%) является гаплотип 22-7-16-13. Анализ четырех внутригенных маркеров (IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA и IVS17BCA) и пяти внегенных маркеров (XV-2c; KM19; CS7; J3.11; W30) позволяет проводить пренатальную диагностику МВ практически во всех семьях (99,5%).
5. У российских больных МВ выявлена ассоциация между CFTR генотипом и тяжестью поражения как органов пищеварительной, так и бронхолегочной системы. У больных с двумя мутациями I и/или II классов дебютом заболевания чаще является кишечный синдром, манифестирующий в более раннем возрасте; колонизация легких P.aeruginosa начинается в более раннем возрасте, что приводит к более быстрому прогрессированию заболевания по сравнению с больными, имеющими, по крайней мере, одну мутацию IV или V класса.
6. Гены eNOS, MBL2 и HFE можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений МВ у российских больных. Установлена ассоциация полиморфного аллеля A VNTR eNOS4 со снижением показателей функции внешнего дыхания (ФЖЕЛ и ОФВ1; p<0,05) и со снижением частоты цирроза печени (p<0,05). Выявлена ассоциация аллелей G54D, G57E, R52C и -221G>С гена MBL2 со снижением показателей ОФВ1 у детей дошкольного возраста (p<0,05), более ранним поражением P.aeruginosa (p=0,017) и ассоциация мутации G54D с более частым поражением Al. xylosoxidans (p=0,037) и St. maltophilia (p=0,049). Обнаружена ассоциация мутации Н63D гена HFE с более тяжелым поражением пищеварительной системы и ранней манифестацией кишечного синдрома (p<0,05).
7. Параметрами, которые необходимо учитывать при медико-генетическом консультировании в семьях с МВ и расчетах апостериорного риска, являются частота МВ (1:10965), частота гетерозиготного носительства мутантных аллелей МВ (0,019), доля выявляемых при ДНК-диагностике мутаций (75,5%) и относительные частоты МВ мутаций, если оба родителя происходят из популяций европейской части России. Риск МВ у новорожденного, положительно тестированного на ИРТ, составляет 0,0541 при обнаружении у него одной CFTR мутации и 0,0005, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена. Риск МВ у плода с эхогенностью кишечника, диагностированной при УЗИ во втором триместре беременности, при обнаружении CFTR мутации у одного из родителей составляет 0,1733, если ни одна из частых CFTR мутаций не обнаружена - 0,0017.
Личное участие автора в получении научных результатов.
Представляемая диссертационная работа является обобщением результатов многолетних комплексных исследований. Работа выполнена на базе лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН. Планирование эксперимента, обработка, анализ и обобщение материалов исследования выполнены лично автором. Автор участвовала в сборе популяционных образцов крови совместно с сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН, в сборе клинических данных о больных МВ совместно с сотрудником лаборатории генетической эпидемиологии Тимковской Е.Е. и сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза д.м.н. Н.Ю. Каширской, к.м.н. Радионович А.М., к.м.н. Воронковой А.Ю. Автором создана коллекция ДНК больных МВ и их родственников. Выделение ДНК из образцов крови и ворсин хориона плодов, анализ частых мутаций в гене CFTR у 776 больных МВ, 1082 родителей, в популяционных выборках (3739 индивидов); анализ внутригенных и внегенных полиморфизмов в семьях с МВ (344 больных и 488 родителей); проведение 109 пренатальных диагностик МВ выполнены лично автором. Анализ кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов методом денатурирующего гель-электрофореза проведен в Институте биогенетики (Брест, Франция); анализ полиморфизма генов-модификаторов клинической картины МВ (148 больных, гомозиготных по мутации F508del) проведен совместно с сотрудником лаборатории Тимковской Е.Е.; анализ последовательности 5' регуляторной и промоторной области гена CFTR у 83 больных МВ и 50 здоровых индивидов методом анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК проведен совместно с сотрудниками лаборатории к.б.н. М.Ю. Скобловым и О.Н. Нурутдиновой, что оговорено в соответствующих местах текста. Статистический анализ: расчет относительных частот мутаций, расчет популяционной частоты мутации F508del, оценка частоты МВ в популяциях европейской части России, анализ гено-фенотипических корреляций у российских больных МВ, оценка возможного влияния генов-модификаторов на клиническую картину МВ у больных с одинаковым CFTR генотипом, расчет генетических рисков при наличии двух независимых факторов риска МВ в разных регионах России выполнены лично автором.
Апробация работы.
Результаты исследования были представлены на Европейских конференциях по муковисцидозу (в 1991, 1996, 1999, 2006, 2008 годах); на Европейских международных симпозиумах по муковисцидозу (в 1997, 2000, 2001, 2002, 2003 годах); на Европейской конференции по генетике человека (2008 г.); на 2 (4) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000 г.); на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2003» (С.-Петербург, 2003 г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003 г.); на Третьем съезде генетиков и селекционеров России “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004 г.); на Третьих антропологических чтениях к 75-летию со дня рождения академика В.П.Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем» (Москва, 2004 г.); на V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005 г.); на VII национальном конгрессе по муковисцидозу (Воронеж, 2005 г.); на Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006 г.); на VIII Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2007 г.); на межлабораторном семинаре ГУ МГНЦ РАМН (25 июня 2008 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 74 работы из них 38 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.
Структура и объем работы.
Работа изложена на 305 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований и обсуждений результатов, заключения, выводов, списка цитированной литературы (401 источник, в том числе 45 отечественных и 356 зарубежных) и приложения. Иллюстративный материал содержит 68 таблиц, 43 рисунка, 33 таблицы Приложений.
Содержание работы
Материалы и методы.
Характеристика выборок. Больные МВ, их родители и сибсы для проведения молекулярно-генетического исследования направлялись из научно-клинического отделения муковисцидоза и научно-консультативного отдела ГУ МГНЦ РАМН, Детской Республиканской клинической больницы, Научного центра здоровья детей РАМН, региональных клинических детских больниц. Родственники больных МВ направлялись также из региональных медико-генетических консультаций. Выборка больных МВ и их родственников формировалась по мере обращения в период с 1990г. по 2007г. Объем выборки больных МВ составил 776 пациентов из 766 семей в возрасте от 0 до 39 лет. Объем выборки родителей и сибсов - 1082 человека. Более 87,4% семей проживали в европейской части России, около 12,6% - в Сибири и на Дальнем Востоке.
Анализ сцепления с полиморфными маркерами гена CFTR проведен у 344 больных муковисцидозом из неродственных семей и 488 их родителей.
Для изучения гено-фенотипических корреляций и модифицирующего влияния ряда генов на клиническую картину МВ проанализированы истории болезни 460 детей из 776 больных МВ, находившихся на постоянном амбулаторном учете в научно-клиническом отделении муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН с 1991 по 2006 год, из них 122 истории болезни пациентов, проживающих в Москве. У всех больных, включенных в исследование, диагноз муковисцидоза был установлен клинически врачами научно-клинического отделения муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., профессор Капранов Н.И.) Подтверждался диагноз потовым тестом (концентрация хлоридов более 60 ммоль/л), измерением разности электрических потенциалов на эпителии носа. Возраст обследованных больных колебался от 3 месяцев жизни до 21 года. Средний возраст составил 9,79±0,26 лет. Распределение больных по полу показало практически равное соотношение мальчиков и девочек (239 : 221; 52% : 48%). Данные для расчета массо-ростового индекса (МРИ) были доступны для 358 МВ больных. У 51,4% пациентов наблюдается отставание физического развития (МРИ<90% от должного). Измерения для оценки показателей функции внешнего дыхания (ФВД) были проведены у 307 больных. Данные микробиологического исследования мокроты были доступны у 424 больных. Данные о состоянии гепатобилиарной системы имелись по 455 больным. Цирроз печени отмечен у 15,4% пациентов, диффузный фиброз - у 9,7%. Гепатит - у 6,8%, в том числе вирусный - у 3,9% в анамнезе. Мекониальный илеус (МИ) отмечен у 4,9%, а синдром дистальной интестинальной обструкции (СДИО) - у 8,5% в анамнезе (данные по 409 пациентам). В большинстве наблюдений имела место смешанная форма МВ - 93,5%, кишечная форма в обследуемой выборке составила лишь 1,1% (5 больных), а легочная форма - 5,4 % (23 пациента). Данные доступны для 447 больных. Течение заболевания оценивалось как тяжелое у 59,4%, средне-тяжелое - у 40,4% и легкое - у 0,2% пациентов (всего оценка была возможна у 451 больного). мутация ген российский муковисцидоз
Для анализа частот CFTR мутаций в популяциях европейской части России использован материал, собранный в ходе медико-эпидемиологических экспедиций сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН в период 1993-2007 годов. Образцы крови башкир собраны сотрудниками Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (г. Уфа, Башкирия) в 2006-2007 годах. Материал собирался у здоровых неродственных индивидов, принадлежащих к коренному этносу вплоть до третьего поколения и являющихся уроженцами обследуемых населенных пунктов. При сборе материала были получены письменные информированные согласия. При этом заполнялась анкета с указанием мест рождения и этнической принадлежности обследуемых и их предков до третьего поколения (бабушки-дедушки). Всего исследовано 3739 здоровых индивидов.
Образцы пятен крови новорожденных г. Москвы 1990 г.р. и 1995 г.р. для анализа частоты мутации F508del были любезно предоставлены А.Д.Байковым (Московский центр неонатального скрининга, ДПБ №6 г.Москвы).
Экспериментальные методы. Материалом исследования являлась ДНК, выделенная из различных источников (лейкоцитов цельной крови, пятен высушенной крови, ворсин хориона). ДНК выделяли методом ферментативного гидролиза протеиназой К с последующей очисткой высаливанием, хлороформной экстракцией и осаждением охлажденным этанолом (96%), а также с использованием наборов реактивов для выделения ДНК «Wizard Genomic DNA Purification Kit» (фирма «Promega», (USA) и DiatomTM DNA Prop (ООО «Изоген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Анализ частых мутаций и полиморфизмов гена CFTR проводили методами ПЦР и мультиплексной ПЦР, рестрикционного анализа, гель-электрофореза, используя олигонуклеотиды, последовательности которых были опубликованы в статьях (Kerem B.-S. et al., 1989; Zielenski J. et al., 1991; Ng I.S.I. et al., 1991; Highsmith W.E. et al., 1994; Dork T. et al., 2000; Chehab F.F. et al., 1991; Rosenbloom C.L. et al., 1989; Feldman G.L. et al., 1988; Williams C. et al., 1988; Northrup H. et al., 1989; Dean M. et al., 1990). Для анализа мутаций F508del, I506del, 1677delTA, CFTRdele2,3(21kb), 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT методом мультиплексной ПЦР использовали набор праймеров, разработанный д.б.н., проф. А.В. Поляковым (лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН). Скрининг CFTR мутаций методом электрофореза в денатурирующем градиентном геле (DGGE) и последующее секвенирование фрагментов ДНК с аномальной подвижностью проводили в лаборатории биогенетики Центра биогенетики (Брест, Франция), согласно разработанной в этой лаборатории методике (Verlingue C. et al., 1995). Поиск мутаций в промоторной и 5' регуляторных регионах гена CFTR проводили методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). Автоматическое секвенирование фрагментов ДНК с аномальной подвижностью проводили в ООО «Хеликон», Россия. Анализ мутаций и полиморфизмов генов eNOS, MBL2, TNFA, LTA, GSTM1, HFE1 проводили методами ПЦР, мультиплексной ПЦР, рестрикционного анализа и гель-электрофореза, используя праймеры, описанные в литературе (Monti L.D. et al., 2003; Zang D.L. et al., 2003; Madsen H.O. et al., 1998; Beutler E. et al., 1996; Пай Г.В. и др., 2003) .
Общеклинические методы. Анализируемые параметры включали: пол, возраст, место проживания, проводимую терапию, время манифестации кишечного и респираторного синдрома, возраст постановки диагноза, форму заболевания, тяжесть течения, показатели ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ1), результаты посева мокроты (наличие высева, его периодичность, существование мукоидной или гладкой формы P.aeruginosa, наличие высева St.aureus, MRSA, Al.xylosoxidans, B.сepacia, St.maltophilia), массу и рост, поражение гепатобилиарной системы и наличие в анамнезе мекониального илеуса. Для оценки массы и роста использовался массо-ростовой индекс (МРИ) определяемый по формуле: (фактическая масса/идеальная масса по росту и полу) 100%, для чего использовали перцентильные графические стандарты, полученные Национальным Центром по Статистике здоровья (National Centre for Health Statistics - NCHS), и рекомендованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), в тех странах, где нет своих национальных стандартов (Zhang Z. et al., 2004). Снижение МРИ ниже 90% от возрастной нормы считалось отставанием в физическом развитии. Для оценки функции легких использовались такие основные показатели ФВД, как Форсированная Жизненная Емкость Легких (ФЖЕЛ) и Объем Форсированного Выдоха в 1 секунду (ОФВ1). Оценка степени тяжести легочной патологии проводилась с учетом показателей ФВД, данных микробиологического исследования мокроты, состояния питания и физического развития (оценивался массо-ростовой индекс), врачебной оценки тяжести течения, которая, в свою очередь, опиралась на шкалу Швахмана-Брасфильда, в модификации С.В. Рачинского и Н.И. Капранова и на оценку рентгенологической картины по шкале Криспина-Нормана. Выделялись три степени тяжести течения - тяжелое, средне-тяжелое и легкое течение. Под поражением печени подразумевалось наличие врачебного заключения об имевшемся диффузном фиброзе, холестатическом гепатите и циррозе печени. Врачебный диагноз заболеваний печени базировался на клинической картине, результатах УЗИ, данных биохимического анализа крови. Имевшееся у ряда больных вирусное поражение печени учитывали отдельно. Данную часть работы проводили совместно с сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., проф. Н.И. Капранов).
Статистическая обработка результатов исследований. Статистическая оценка различий частот аллелей и гаплотипов ДНК-маркеров, а также частоты качественных признаков проводилась с использованием критериев 2, модифицированного 2, теста Фишера (Животовский Л.А., 1991). Расчет осуществляли с использованием пакета программ, составленного сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии д.б.н. Ельчиновой Г.И., д.б.н. Нурбаевым С.Д. Для анализа ассоциаций между мутациями и полиморфными вариантами изучаемых генов и клиническими характеристиками заболевания использован непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Оценка функции выживания в группах пациентов с разными генотипами проведена методом множительных оценок Каплана-Мейера. Для сравнения показателей выживаемости использовали критерий Вилкоксона, модифицированный по Гехану. При расчетах использовали пакет компьютерных программ Statistica 6.0. Для расчетов апостериорных вероятностей поражения новорожденного или плода МВ использовали вероятностный метод Байеса.
Результаты и обсуждение.
Одной из важных задач в изучении наследственных заболеваний является определение его частоты. Оценки частоты муковисцидоза в России разнятся в весьма широких пределах. Расчет частоты МВ в популяциях европейской части России проведен с использованием двух показателей: относительной доли распространенных CFTR мутаций у больных МВ и популяционной частоты данных мутаций.
Анализ относительных частот CFTR мутаций у больных МВ.
Молекулярно-генетические исследования по муковисцидозу проводятся в лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН на протяжении длительного периода, начиная с 1989 года. Спектр частых мутаций гена CFTR, характерный для больных из России, был определен в результате совместного с Институтом Биогенетики (Брест, Франция) исследования всей кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов в 1993-1995 годах (Verlingue C. et al., 1995), межъевропейского коллаборативного исследования распространения мутации CFTRdele2,3(21kb) (Dцrk T. et al., 2000), самостоятельных работ (Петрова Н.В. и др., 1994, 1997, 2001; Петрова Н.В., 2005) с учетом данных других отечественных исследователей, анализирующих независимые от нас выборки больных (Иващенко Т.Э,, 2000; Корытина Г.Ф. и др., 2002; Голубцов В.И. и др., 2007).
Для определения относительных долей частых CFTR мутаций были проанализированы 1532 мутантные хромосомы (766 неродственных больных МВ). В спектр рутинно анализируемых мутаций вошли мутации F508del, CFTRdele2,3(21kb), I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, G551D, R553X, W1282X, N1303K, E85Q, 621+1G>T, R117H, 1717-1G>A, 3849+10kbC>T, R334W, R347P, S1196X. В ряде случаев были обнаружены образцы, имеющие измененную подвижность амплифицированных фрагментов ДНК в 4, 20, 19 и 13 экзонах. При секвенировании амплифицированных фрагментов с аномальной подвижностью были идентифицированы мутации 3667insTCAA (вставка четырех нуклеотидов TCAA после положения 3667, 19 экзон) и K598ins (13 экзон, вставка трех нуклеотидов AAA после положения 1923, что приводит к вставке аминокислоты лизин после позиции 598) (каждая у одного больного в компаунде с мутацией F508del), 3944delGT (вставка двух нуклеотидов после положения 3944, 20 экзон; у двух неродственных больных, у одного в компаунде с мутацией F508del, у другого - с 3849+10kbC>T), 604insA (4 экзон, вставка нуклеотида A после положения 604; у трех неродственных больных: у двух в компаунде с мутацией F508del, у третьего - с мутацией G542X) и L138ins (4 экзон, вставка трех нуклеотидов CTA после положения 546, что приводит к вставке аминокислоты лейцин после позиции 138; у шести неродственных больных: у двух в компаунде с мутацией F508del, у двух - с мутацией CFTRdele2,3(21kb), у одного - с мутацией 2184insA, а у одного вторая мутация осталась не идентифицированной). Мутации 3667insTCAA, 3944delGT и L138ins ранее не были отмечены другими отечественными исследователями. Мутации 604insA и K598ins обнаружены впервые. Мутации L138ins и 604insA включены нами в рутинный анализ частых CFTR мутаций у российских больных МВ.
На рис. 1 приведена схема распределения относительных долей обнаруженных CFTR мутаций в проанализированной выборке мутантных хромосом.
Рис.1. Распределение относительных частот CFTR мутаций (в %) у российских больных МВ.
Анализ мутаций, встречающихся у больных МВ в разных регионах России, подтверждает тенденции, прослеживающиеся в распределении CFTR мутаций в Европе: снижение относительной доли мутации F508del с северо-запада на юго-восток - у российских больных МВ относительная частота мутации F508del в среднем составляет 54,2% и колеблется от 59% на северо-западе до 47% на юге европейской части России. Второй по частоте, после мутации F508del, среди российских больных является мутация CFTRdele2,3(21kb), в среднем составляя 7,2%. Данное значение относительной частоты, самое высокое в Европе, согласуется с гипотезой о происхождении мутации CFTRdele2,3(21kb) на территории Восточной Европы среди славянских племен и проникновением ее в Западную Европу с востока. Следует отметить, что среди обследованных нами пациентов мутация CFTRdele2,3(21kb) обнаружена не только у русских, но и у пациентов с другой этнической принадлежностью: у армян, грузин, чеченцев и татар. Такие частые в мире мутации, как G542X и N1303K, обнаружены и в обследованной нами выборке, с частотами от 0,5% до 2-4% в разных регионах, что соответствует снижению встречаемости данных мутаций с удалением от средиземноморского региона. Мутации в 13 экзоне гена CFTR, 2143delT и 2184insA, являются относительно частыми мутациями среди изученных российских больных МВ, что согласуется с данными других отечественных авторов, проанализировавших независимые выборки больных МВ (Иващенко Т.Э., 2000; Корытина Г.Ф. и др., 2002; Одинокова О.Н. и др., 2006; Рукавичкин Д.В., 2007). Мутации G551D и R553X, распространенные во многих популяциях Европы, не были обнаружены ни у одного из обследованных нами больных МВ. По-видимому, эти мутации у пациентов из России являются крайне редкими, что согласуется с данными других авторов (Корытина Г.Ф. и др., 2002; Одинокова О.Н. и др., 2006; Рукавичкин Д.В., 2007), в исследованиях которых данные мутации также не были выявлены. Только в исследовании Т.Э. Иващенко мутации G551D и R553X были обнаружены у двух и одного из 815 больных, соответственно (Иващенко Т.Э., 2000).
Тринадцать мутаций являются наиболее часто встречающимися у российских больных МВ (относительные частоты каждой из них превышают 0,005): F508del - 0,542, CFTRdele2,3(21kb) - 0,072, 2143delT - 0,021, W1282X - 0,020, N1303K - 0,019, 3849+10kbC>T - 0,019, 2184insA - 0,017, G542X - 0,013, 1677delTA - 0,008, 3821delT - 0,008, R334W - 0,007, L138ins - 0,006, 394delTT - 0,005, будучи диагностируемыми практически во всех изученных регионах России и суммарно составляя 75,7% от всех мутантных аллелей. Общая доля всех идентифицированных мутаций равна 77%.
Поиск мутаций в 5' -дистальной и промоторной области гена CFTR.
Даже в результате изучения нуклеотидной последовательности всей кодирующей области гена CFTR доля не идентифицированных мутаций у российских больных МВ составляет не менее 20% (Verlingue C. et al., 1995). Поскольку известно, что несбалансированная экспрессия аллелей, возникающая вследствие полиморфного состояния регуляторных элементов характерна для 27% генов человека (Pastinen T. et al., 2006), а исследование этих регионов гена CFTR у российских пациентов с МВ ранее не проводилось, был осуществлен поиск возможных мутаций в 5' -дистальной и промоторной области гена CFTR. Изучено семь регуляторных элементов, участие которых в определении уровня экспрессии гена CFTR было экспериментально доказано: cайты связывания транскрипционного фактора SP1, находящиеся в положениях -194 и -273 от точки инициации транскрипции гена (Chou J.L. et al., 1991); DHS-элемент (сайт, чувствительный к ДНКазе I) с позицией -20,9 тыс.п.н. от точки инициации транскрипции гена (Nuthall H.N. et al., 1999); CRE-элемент в положении 115 п.н. от ATG-кодона (Yoshimura K. et al., 1991; Pastinen T. et al., 2006); ССААТ-элемент в положении (-132) - (-119) н. от начала транслирующего кодона (Nuthall H.N. et al., 1999; Li et al., 1999; Pittman N. et al., 1995); сайты связывания с транскрипционным фактором Nf-kB в положениях (-1103) - (-1093) п.н. от начала инициации транскрипции гена (Brouillard F. et al., 2001) и SRE-элемент, находящийся в положении -108 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции (Renй C. et al., 2005). Поиск мутаций в регуляторных элементах, участвующих в транскрипции гена CFTR, был осуществлен на выборках 83 образцов ДНК больных муковисцидозом, у которых не были найдены частые CFTR мутации (22 человека), либо была найдена только одна мутация в гене CFTR (61 пациент) (всего 105 хромосом с неизвестными мутациями), и 50 образцов ДНК здоровых индивидов. В результате проведенного SSCP-анализа в исследованных регуляторных элементах гена CFTR не было выявлено изменений подвижности фрагментов ДНК ни в одном образце. Можно предположить, что мутации в 5' регуляторной и промоторной областях гена CFTR у российских больных, как и у пациентов в других популяциях мира, достаточно редки.
Подобные документы
Общая характеристика генных болезней, возникающих в результате повреждения ДНК или мутаций на генном уровне. Виды мутаций: геномные, хромосомные, генные. Генетические, клинические, патогенетические разновидности генных болезней. Патогенез болезни.
реферат [28,7 K], добавлен 25.03.2012Наследование муковисцидоза по аутосомно-рецессивному типу. Мутация гена трансмембранного регулятора муковисцидоза. Основные формы муковисцидоза. Уровень иммунореактивного трипсина в сухом пятне крови. Организации диспансерного наблюдения за больными.
реферат [258,2 K], добавлен 20.12.2016Схема организации генома вируса гепатита С. Структурные и неструктурные белки. Диагностика заболевания по специфическим антителам и РНК. Полиморфные локусы core-Ag. Встречаемость естественных мутаций. Варианты терапии больных. Перелечивание генотипа 1.
презентация [1,2 M], добавлен 06.03.2016Понятие наследственных заболеваний и мутаций. Генные наследственные болезни: клинический полиморфизм. Изучение и возможное предотвращение последствий генетических дефектов человека как предмет медицинской генетики. Определение хромосомных болезней.
контрольная работа [34,5 K], добавлен 29.09.2011Клиническая характеристика генных и хромосомных мутаций. Изучение наследственных патологий и заболеваний: фенилкетонурия, муковисцидоз, серповидно-клеточная анемия. Синдромы Патау, Дауна и Эдвардса как геномные мутации. Лечение наследственных болезней.
реферат [52,6 K], добавлен 14.08.2013Структура и функции генов. История расшифровки механизма развития болезней с наследственным предрасположением. Понятие, сущность и причины мутаций. Характеристика хромосомных болезней и болезней нарушения обмена веществ (аминокислот, жиров и углеводов).
реферат [26,2 K], добавлен 11.03.2010Этапы оценки структуры стоматологической заболеваемости населения, ее распространенности в различных возрастных группах. Вероятные причины кариеса. Направления профилактики данного заболевания. Факторы, влияющие на выбор профилактических методов.
реферат [20,2 K], добавлен 09.11.2014Анализ ассоциаций генотипов и аллелей исследованных полиморфизмов с гестозом в популяциях русских и якутов. Оценка ассоциации tagSNPs генов LEP и ACVR2A с развитием клинических форм гесоза в русской и якутской популяциях. Анализ частот гаплотипов.
дипломная работа [2,4 M], добавлен 11.02.2017Этиология муковисцидоза - генетического наследственного заболевания, сопровождающегося специфическим системным поражением в адрес экзокринных желез. Генетический тест для взрослых для диагностики муковисцидоза и современные принципы его лечения.
презентация [6,8 M], добавлен 16.03.2017Определение ключевых понятий общей патологии и сущность теории причинности. Изучение патогенеза, типы и виды мутаций. Классификация наследственных болезней. Формула Хольцингера как качественная оценка вклада наследственного и средового факторов.
реферат [23,4 K], добавлен 11.05.2009
