Влияние реамберина и липоевой кислоты на расстройства поведения и метаболизма при экспериментальном сахарном диабете

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВЛИЯНИЕ РЕАМБЕРИНА И б-ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ НА РАССТРОЙСТВА ПОВЕДЕНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Мирошниченко Ирина Юрьевна

Работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Волчегорский Илья Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Ларионов Леонид Петрович

заслуженный работник высшей школы РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Венгеровский Александр Исаакович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «____» _____________ 2010 года в ________ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу: 454092, г.Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «____» ________________________ 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

доктор медицинских наук,

профессор Телешева Л.Ф.

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Проблема нейропатических осложнений сахарного диабета (СД) относится к числу важнейших медико-социальных проблем современности и носит глобальный характер. Диабетические нейропатии (ДН), наряду с диабетическими ангиопатиями, относят к числу наиболее часто встречающихся осложнений СД, которые отягощают его протекание, ухудшают прогноз и существенно снижают качество жизни (КЖ) больных (Смулевич А.Б., 2003; Балаболкин М.И. и др., 2005; Дедов И.И. и др., 2006; Amos A.F. et al., 1997; Jakus V., Reitbrock N., 2004).

На сегодняшний день недостаточно изучена проблема центральных диабетических нейропатий, которые считаются клинически менее значимые в сравнении с периферическими нейропатиями. В первую очередь, это относится к диабетической энцефалопатии (ДЭ), ранние этапы развития которой проявляются неспецифическими, слабовыраженными когнитивными и аффективными расстройствами (Дамулин И.В., 2004; Коркина М.В., Елфимова Е.В., 2004; Волчегорский И.А., Местер Н.В., 2007; Местер Н.В., 2007). Это существенно затрудняет раннюю диагностику и своевременное начало лечения данного синдрома (Волчегорский И.А. и др., 2006). Важно подчеркнуть, что медленное прогрессирование ДЭ резко увеличивает риск развития деменции у больных СД (Коркина М.В., Елфимова Е.В., 2004; Allen K.V. et al., 2004).

Изложенные обстоятельства иллюстрируют необходимость целенаправленной разработки подходов к патогенетически обоснованной коррекции нарушений аффективного статуса и когнитивной сферы при СД. Наиболее очевидным путем решения этой задачи является адекватная терапия основного заболевания, направленная на достижение устойчивой компенсации СД (Балаболкин М.И. и др., 2005; Дедов И.И. и др., 2006). При всей очевидности данного подхода необходимо помнить, что использование препаратов инсулина может привести к неоднозначным последствиям в отношении эмоциональной сферы и интеллектуальных возможностей больных. Весьма проблемным моментом, касающимся влияния препаратов инсулина на функциональное состояние головного мозга у больных СД, является изменение обмена в-амилоидного пептида под влиянием инсулина. Gasparini L. et al. (2001) убедительно продемонстрировали, что инсулин ограничивает протеолитическую деструкцию в-амилоидного пептида, накопление которого в головном мозге играет общеизвестную роль в развитии болезни Альцгеймера. Это хорошо согласуется с данными Noh J.H. et al. (2005) о негативном влиянии инсулинотерапии на эмоциональную сферу и когнитивные функции у больных СД 2 типа (СД 2). Более того, известно, что пациенты, страдающие СД 2, являются группой риска по развитию болезни Альцгеймера (Biessels G.J. et al., 2006; Araki A., 2010; Carlsson C.M, 2010; Umegaki H., 2010). Данные факты свидетельствуют о целесообразности применения средств, ограничивающих СД 2 - ассоциированную гиперинсулинемию и увеличивающих чувствительность к этому гормону, для борьбы с церебральной дисфункцией при болезни Альцгеймера и СД.

Пристального внимания заслуживают данные о позитивном влиянии оригинальных российских лекарственных средств (ЛС) - производных янтарной кислоты (реамберина и мексидола) на выраженность клинических проявлений нейропатического процесса при СД. Установлено, что оба этих ЛС эффективно корригируют «позитивные» и «негативные» симптомы дистальной симметричной сенсомоторной полинейропатии (ДССП) и улучшают аффективный статус больных СД (Волчегорский И.А. и др., 2004, 2005; Чащина Е.Н., 2005; Волчегорский И.А., Местер Н.В., 2007; Местер Н.В., 2007). Следует отметить, что реамберин продемонстрировал существенные преимущества по влиянию на симптоматику ДССП в сравнении с мексидолом (Волчегорский И.А. и др., 2005), а также характеризовался меньшей в сравнении с мексидолом «стоимостью единицы эффекта» (Чащина Е.Н., 2005). Кроме того, реамберин проявил заметное, хотя и статистически незначимое, преимущество по влиянию на выраженность эмоциональных нарушений у больных с синдромом диабетической стопы (СДС) в сравнении с мексидолом. Это свидетельствует о перспективе преимущественного применения реамберина в качестве средства патогенетической коррекции расстройства церебральных функций при СД. Справедливость данной постановки вопроса иллюстрируется не только анксиолитическим и тимоаналептическим действием реамберина, но и его благоприятным влиянием на показатели гликемии у пациентов с СДС (Волчегорский И.А. и др., 2005).

Данные Storozheva Z.I. et al. (2008) позволяют предположить, что сукцинатсодержащие препараты могут вызывать редокс-праймирование инсулиновых рецепторов (ИР) за счет оптимального увеличения уровня продукции активных форм кислорода (АФК) в процессе митохондриального окисления янтарной кислоты.

Накопленные к настоящему времени данные не позволяют прийти к однозначному выводу об относительном вкладе прооксидантной активности сукцинатсодержащих препаратов (Storozheva et al., 2008) и роли сукцината в качестве ко-антиоксиданта (Меньщикова Е.Б. и др., 2006) в реализации антинейропатического действия производных янтарной кислоты. Данное положение в полной мере касается другого редокс-активного ЛС (б-липоевой кислоты), традиционно применяемого в лечении ДН. Препараты б-липоевой кислоты (б-ЛК) содержат её окисленную форму, которая непосредственно может оказывать только прооксидантный эффект (Лалетин В.С., Колесниченко Л.С., 2010; Dicter N. et al., 2002). Вместе с тем, восстановленная форма б-ЛК (дигидролипоевая кислота) является не менее важным чем сукцинат компонентом антиоксидантной защиты (АОЗ) (Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Konrad D., 2005). В литературе превалирует мнение об антиоксидантной природе антинейропатического действия б-ЛК (Borcea V. et al., 1999; Vincent A.M. et al., 2004). Эффективность данного ЛС в лечении СД-ассоциированного нейропатического процесса аргументировано доказана лишь в отношении периферических нейропатий (Reljanovic M. et al., 1999; Ametov A.S. et al., 2003; Zeigler D. et al., 2004, 2006). Значительно меньше известно о возможном влиянии б-ЛК на проявления ДЭ (Vincent A.M. et al., 2004).

В целом, имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют сформировать однозначного мнения об эффективности реамберина и б-ЛК в коррекции СД-ассоциированных когнитивных и аффективных расстройств. Это иллюстрирует актуальность экспериментальных исследований, посвященных сравнительному анализу влияния реамберина и б-ЛК на расстройства мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения в сопоставлении с действием этих ЛС на нарушения углеводного и липидного обмена и сопутствующими сдвигами в системе «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» (ПОЛ-АОЗ) при экспериментальном СД. Важным сегментом актуальности таких исследовании является целенаправленное изучение влияния реамберина и б-ЛК на чувствительность к инсулину в сопоставлении со способностью этих ЛС модулировать проявления оксидативного стресса (ОС) in vitro.

Цель исследования

Провести сравнительное изучение влияния реамберина и б-липоевой кислоты на расстройства мотивированного поведения, условнорефлекторного обучения и метаболизма при экспериментальном сахарном диабете в сопоставлении с влиянием этих лекарственных средств на чувствительность к инсулину, толерантность к нагрузке глюкозой и интенсивность перекисного окисления липидов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить нижеперечисленные задачи.

Задачи работы:

1. Оценить влияние однократного введения реамберина и б-липоевой кислоты на чувствительность крыс к инсулину и сопоставить полученные данные с ПОЛ-модулирующим эффектом изученных лекарственных средств.

2. Изучить влияние реамберина и б-липоевой кислоты на толерантность крыс к нагрузке глюкозой.

3. Исследовать антигипоксическое и противовоспалительное действие реамберина и б-липоевой кислоты в экспериментах на мышах.

4. Исследовать влияние курсового введения реамберина и б-липоевой кислоты на расстройства углеводного и липидного обмена, мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения при экспериментальном сахарном диабете у крыс и мышей.

5. Изучить зависимость выраженности психотропных и метаболических эффектов реамберина и б-липоевой кислоты от дозировок и кратности введения этих лекарственных средств животным с экспериментальным сахарным диабетом, сопоставить полученные данные с влиянием реамберина и б-липоевой кислоты на чувствительность к инсулину, толерантность к сахарной нагрузке, устойчивость к гипоксии и острому флогогенному воздействию.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное экспериментальное исследование влияния реамберина и б-липоевой кислоты на расстройства мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения лабораторных животных с экспериментальным сахарным диабетом. Продемонстрировано, что оба лекарственных средства уменьшают выраженность гипергликемии и нормализуют этологический статус мышей и крыс с аллоксановым диабетом. Установлено, что курсовое введение реамберина и б-липоевой кислоты лабораторным грызунам с аллоксановым диабетом корригируют расстройства углеводного и липидного обмена, мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения в зависимости от влияния изученных лекарственных средств на чувствительность к инсулину и толерантность к нагрузке глюкозой.

Впервые показано, что реамберин снижает выраженность гипергликемии и существенно корригирует нарушения мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения лишь при краткосрочном (1 и 7 дневном) применении относительно низких доз. Более продолжительное (14 дневное) применение реамберина сопровождается развитием толерантности в отношении его сахароснижающего и психотропного эффектов с одновременным усугублением дислипидемических расстройств при аллоксановом диабете.

Впервые показано, что б-липоевая кислота, в отличие от реамберина, обладающая антигипоксическим и противовоспалительным действием, характеризуется кумулятивным развитием сахароснижающего, гиполипидемического, тимоаналептического, анксиолитического и ноотропного эффектов при аллоксановом диабете. Выраженность этих эффектов б-липоевой кислоты достигает максимума при 14 дневном курсовом применении данного лекарственного средства.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в диссертационном исследовании результаты существенно расширяют представления о фармакодинамике реамберина и б-липоевой кислоты в условиях экспериментального сахарного диабета. Это позволяет использовать полученные данные в рамках учебного процесса на кафедрах фармакологии и фармацевтической химии медицинских и фармацевтических вузов, а также для обучения врачей, интернов и ординаторов в системе последипломного и дополнительного образования. Высокая эффективность реамберина и б-липоевой кислоты в коррекции нарушений метаболизма, мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения при аллоксановом диабете может служить теоретическим основанием для совершенствования стандартов комплексного лечения больных сахарным диабетом.

Положения, выносимые на защиту:

1. Однократное введение реамберина и б-липоевой кислоты в дозах, эквивалентных терапевтическому диапазону для человека, увеличивает чувствительность крыс к инсулину в зависимости от выраженности прооксидантного эффекта изученных лекарственных средств.

2. б-липоевая кислота, в отличие от реамберина, обладает антигипоксическим и противовоспалительным действием, а также увеличивает толерантность крыс к сахарной нагрузке. Несмотря на выраженную инсулин-потенциирующую активность реамберина, его однократное введение оказывает гипергликемизирующее действие и снижает толерантность крыс к нагрузке глюкозой.

3. Ежедневное введение реамберина и б-липоевой кислоты лабораторным грызунам с аллоксановым диабетом на протяжении 14 дней корригируют расстройства метаболизма, мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения в зависимости от влияния изученных лекарственных средств на чувствительность к инсулину и толерантность к сахарной нагрузке.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах VI итоговой научно-практической конференции молодых ученых ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Челябинск, 2008), в материалах V Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008), в материалах VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Челябинск, 2009), в материалах Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), в трудах научной сессии профессорско-преподавательского состава ЧелГМА, посвященной 65-летию медицинской академии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Челябинск, 2009).

Апробация работы состоялась на расширенном заседании кафедры фармакологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (протокол № 13, от 25 июня 2010 года).

Внедрение в практику

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по теме «Гормональные препараты» в разделе «Фармакотерапия сахарного диабета» и в элективном курсе «Новые направления в фармакологии», а также на кафедрах фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета при изучении тем «Использование различных вариантов спектрофотометрии в фармацевтическом и биологическом анализе», «Барбитураты в химико-токсикологическом анализе» и «Предельные карбоновые кислоты».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 5 - по перечню рецензируемых научных журналов, определенных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 145 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 2 рисунками. Список литературы содержит 333 источников, из которых 91 опубликован в отечественной литературе и 242 - в зарубежных изданиях.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 515 белых беспородных мышах массой 18-20 г и 483 белых беспородных крысах массой 200-250 г. Организация работы соответствовала международным этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных (Копаладзе Р.А., 1998), отражённых в приказе Минздрава СССР № 775 от 12.08.1977 г., в законе о благополучии животных Конвенции Европейского Союза и Европейской Конвенции защиты позвоночных животных для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), в международных правилах Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies от 04.03.2002 г. и в приказе МЗ РФ № 267 от 19.06. 2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

В работе были использованы препарат б-липоевой кислоты и 1,5 % раствор реамберина (табл. 1).

Таблица 1. Фармакологические препараты, использованные в исследовании

Примечание к табл. 1: в левом столбце указаны торговые наименования лекарственных препаратов. В скобках обозначены международное непатентованное наименование [МНН] лекарственного вещества (для б-ЛК) и химическое название активного компонента (для реамберина) с указанием производителя препаратов в обоих случаях.

Исследуемые препараты разводили в 0,9 % растворе NaCl и применяли в трех дозах, экстраполированных из разовых дозировок терапевтического диапазона для человека с учётом различий в величинах относительной площади поверхности тела (Волчегорский И.А. и др., 2000). В обоих случаях минимальной дозой изучаемого диапазона являлась Ѕ от расчетного эквивалента средней терапевтической дозы (ЭСТД). В качестве максимальной дозировки использовался удвоенный ЭСТД. Разовые дозы 1,5 % реамберина для крыс составили 12,5, 25 и 50 мл/кг, для мышей - 25, 50 и 100 мл/кг. Препарат б-ЛК вводили крысам в дозах 25, 50 и 100 мг/кг, соответствующие дозировки для мышей составили 50, 100 и 200 мг/кг. Животные контрольных подгрупп получали соответствующие объемы 0,9 % раствора NaCl.

В серии экспериментов по изучению влияния реамберина и б-ЛК на чувствительность к инсулину было использовано 70 интактных крыс, подвергнутых предварительному суточному голоданию при свободном доступе к воде. Исследуемые ЛС вводили однократно внутрибрюшинно в ранее указанных разовых дозах. Контрольные животные получали 0,9 % раствор NaCl в соответствующем объеме. Сразу после внутрибрюшинного введения изучаемых ЛС или 0,9 % раствора NaCl крысам проводили струйную внутривенную инфузию нейтрального раствора инсулина для инъекций (Хумулин регуляр, «Eli Lilly», Франция), предварительно разведенного в растворе Рингера (состав: на 400 мл водного раствора - 3,6 г NaCl, 0,08 г KCl, 0,08 г СаС1₂, 0,4 г глюкозы) до концентрации 8 IU/мл в объёме 5 мл/кг (доза 40 IU/кг) (Волчегорский И.А. и др., 1993). Чувствительность животных к инсулину оценивали по длительности временного промежутка с момента инъекции до развития комы (Волчегорский И.А. и др., 1993).

В отдельной серии экспериментов оценивали влияние реамберина и б-ЛК на толерантность к глюкозе у интактных крыс. Было использовано 70 животных, подвергнутых предварительному суточному голоданию при свободном доступе к воде. Через 30 минут после однократного внутрибрюшинного введения ЛС в изучаемых дозах у животных забирали кровь из хвостовых вен для регистрации исходных значений гликемии и выполняли тест толерантности к глюкозе (ТТГ). С этой целью применяли нагрузку глюкозой в дозе 2 г/кг (5 мл/кг 40% раствора глюкозы, внутрибрюшинно). Изменения гликемии в динамике ТТГ регистрировали через 60 и 120 минут после сахарной нагрузки. Животным контрольных подгрупп за 30 минут до ТТГ вместо изучаемых ЛС вводили эквиобъемные количества 0,9 % раствора NaCl.

Учитывая известную роль редокс-праимирования инсулинового рецептора в регуляции чувствительности к этому гормону (Goldstein B.J. et al., 2005), в отдельной серии экспериментов было изучено ПОЛ-модулирующее действие реамберина и б-ЛК in vitro. Для изучения влияния реамберина и б-ЛК на интенсивность свободнорадикального (перекисного) окисления липидов in vitro использовался метод И.А. Волчегорского и др. (2000), основанный на анализе переокисления липидов стандартизованного препарата гомогенатов головного мозга крыс в присутствии изучаемых препаратов. Влияние ЛС на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) in vitro оценивали по изменениям накопления веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в 2% гомогенатах головного мозга крыс, инкубируемых в атмосфере воздуха при 37 ⁰С в течение 60 минут (Волчегорский И.А. и др., 2000). Для изучения ПОЛ-модулирующего действия реамберина и б-ЛК в зависимости от их концентрации готовили ряд серийных разведений исходных растворов этих ЛС в 10, 100, 1000, 10000, 100000 и 1000000 раз. Это позволило оценить влияние реамберина и б-ЛК на ПОЛ в диапазоне от миллимолярной до наномолярной концентрации. Каждая проба выполнялась в 5 параллельных повторностях с последующим расчетом среднего показателя.

Изучение антигипоксического действия реамберина и б-ЛК проводилось на модели острой гипоксической гипоксии (асфиксии утопления) (Кулинский В.И. и др., 1986). Для оценки противовоспалительного действия изучаемых ЛС использовали тест «формалинового отека» на мышах (Балтина Л.А. и др., 1988; Волчегорский И.А. и др., 2000).

Аллоксановый диабет моделировали на крысах и мышах. В серии экспериментов на крысах индукцию аллоксанового диабета осуществляли путем внутрибрюшинного введения аллоксана тригидрата («La Chema», Чехия) или аллоксана моногидрата («ДИА^эМ», Россия) в эквивалентных дозах (200 мг/кг и 163 мг/кг, соответственно). Экспериментальный СД у мышей вызывали путем подкожного введения аллоксана тригидрата («La Chema», Чехия) или аллоксана моногидрата («ДИА^эМ», Россия) в эквивалентных дозах (300 мг/кг и 245 мг/кг соответственно). В обеих экспериментальных сериях контрольным животным вместо аллоксана вводили эквиобъёмное количество 0,9 % раствора NaCl.

Учитывая общеизвестную фазную динамику гликемии и инсулинемии у лабораторных грызунов после введения аллоксана, выраженность проявлении экспериментального СД оценивали не ранее чем через 72 часа с момента моделирования этого состояния (Lenzen S., 2008).

На фоне сформировавшегося экспериментального СД была изучена эффективность трех схем введения реамберина и б-ЛК. Каждый препарат вводили животным внутрибрюшинно 1 раз в сутки в ранее обозначенных дозах на протяжении 1, 7 и 14 дней.

Для предотвращения фатального кетоацидоза и гибели животных, начиная с 4 дня после инъекции аллоксана всем лабораторным грызунам с 7 и 14 дневным курсом терапии экспериментального СД проводили базисную инсулинотерапию (Federiuk I.F. et al., 2004). Для этого животным раз в сутки подкожно вводили раствор инсулина аспарата двухфазного (НовоМикс 30 Пенфилл, «Novo nordisk», Дания) в дозах 3 IU/кг (для крыс) и 6 IU/кг (для мышей).

В экспериментах на крысах через 1, 7 и 14 дней от начала терапии реамберином и б-ЛК исследовали поведение животных в «открытом поле» по показателям локомоции, исследовательско-ориентировочной активности, груминга и дефекации, считающейся вегетативным эквивалентом тревоги у крыс (Буреш Я. И др., 1991; Волчегорский И.А. и др., 2000). В работе применялся вариант актографа «открытое поле», разработанный И.А. Волчегорским и соавт. (1993, 1998, 2000). Примененный подход позволяет получить интегральную характеристику аффективного статуса грызунов, активность которых в «открытом поле» формируется как равнодействующая двух противоположных тенденций - страха незнакомого пространства и мотивации к его исследованию (Буреш Я. и др., 1991; Волчегорский И.А. и др., 2000). По завершении тестирования крыс в «открытом поле» оценивали их способность к выработке условного рефлекса активного избегания (УРАИ). В работе использовался вариант УРАИ, связанный с формированием навыка «избегания плаванием» за одну попытку (Буреш Я. и др., 1991). О качестве формирования УРАИ судили по кратности снижения латентного периода избегания через 24 часа после обучающей попытки.

В отдельных сериях экспериментов на мышах через 1, 7 и 14 дней от начала терапии аллоксанового диабета исследовали поведение мышей в «открытом поле». Для этой цели применяли актограф, конструкция которого описана в работе M.L. Weischer (1976). Сразу после завершения регистрации активности мышей в «открытом поле» выполняли шестиминутный тест подвешивания за хвост (Steru L., 1985) с регистрацией длительности «поведения отчаяния», который рассматривается как гомолог депрессивных расстройств у человека (Steru L., 1985).

Выраженность метаболических расстройств у экспериментальных животных с аллоксановым диабетом оценивали по показателям гликемии после 24 часовой депривации пищи при свободном доступе к воде. В серии экспериментов на крысах дополнительно определяли сывороточную концентрацию фруктозамина (ФА), отражающего интенсивность неферментного гликозилирования белков плазмы крови (Меньшиков В.В. и др., 1987). О состоянии липидного обмена судили по общему содержанию холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови, которые регистрировали с помощью унифицированных клинико-лабораторных методов (Меньшиков В.В. и др., 1987). Уровень продуктов ПОЛ в сыворотке крови определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А. и др., 1989, 2000). Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) - Е₂₃₂/Е₂₂₀ (относительное содержание диеновых коньюгатов; ДК) и Е₂₇₈/Е₂₂₀ (уровень кетодиенов и сопряженных триенов; КД и СТ). О состоянии АОЗ судили по содержанию б-токоферола (б-ТК) и церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови. Концентрацию б-ТК определяли с использованием реактива Эммери-Энгель и поправкой на оптическое поглощение каротинов (Спиричев В.Б. и др., 1979). Уровень ЦП регистрировали модифицированным методом Ревина (Колб В.Г. и др., 1976).

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием пакета прикладных компьютерных программ SPSS - 13.0 и StatSoft Statistica v. 6.0. Полученные данные были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица и Колмогорова-Смирнова. Анализ динамики гликемии при выполнении ТТГ проводился с помощью парного критерия Уилкоксона, предназначенного для суждения о значимости различий в связанных выборках. Межгрупповые сопоставления показателей летальности проводили с помощью точного критерия Фишера. Для изучения статистических взаимосвязей рассчитывали коэффициент ранговой корреляции по Спирману (r_s) и Кендалу (r_k). Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р=0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования было установлено, что реамберин и б-ЛК оказывают инсулин-потенциирующее действие in vivo (табл.2) и способствуют накоплению ТБК-реактивных веществ в гомогенатах головного мозга крыс in vitro (рис. 1).

Рис. 1. Влияние б-липоевой кислоты (А) и реамберина (Б) на переокисление липидов головного мозга крыс in vitro

Примечание к рис. 1:

1) инкубационная смесь содержала исследуемые лекарственные средства растворенные в 1,8 мл 0,04М фосфатного буфера приготовленного на 0,9% растворе NaCl (рН=7,4) и 0,2 мл 20% гомогената мозга крыс; инкубацию проводили в течение 60 мин при температуре 37°С в условиях контакта с атмосферным воздухом; контрольные пробы не содержали изучаемых лекарственных средств;

2) показатели прироста содержания продуктов ПОЛ (ТБК-реактивных веществ) представлены в % от исходного уровня;

3) показатели ПОЛ-модулирующего действия б-липоевой кислоты (А) и реамберина (Б) представлены в виде средних значений результатов 5-ти кратной постановки эксперимента in vitro.

Выраженный прооксидантный эффект обоих препаратов проявлялся, начиная с микромолярных концентраций ЛС, и достигал наибольшей выраженности при их миллимолярных концентрациях.

Выявленная прооксидантная активность б-ЛК и реамберина (рис. 1) позволяет считать, что в основе и их инсулин-потенциирующего действия лежит усиление редокс-трансдукции гормонального сигнала (Goldstein B.J. et al., 2005). Важно подчеркнуть, что б-ЛК, сокращавшая латентность развития инсулиновой комы в 1,9 - 2,7 раза от контрольных значении (табл. 2), превосходила реамберин по способности усиливать ПОЛ in vitro (рис. 1). Меньшая выраженность ПОЛ-стимулирующего действия реамберина была связана с дозозависимым ускорением развития инсулиновой комы лишь в 1,6 - 1,8 раза от контрольных значений. Полученные данные укладываются в рамки представлений о прямой зависимости между интенсивностью функционирования митохондриальных электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) и чувствительностью к инсулину (Storozheva Z.I. et al., 2008).

Выраженный инсулин-потенциирующий эффект б-ЛК и реамберина был связан с неоднозначными сдвигами толерантности к сахарной нагрузке (табл. 3). Было установлено, что Ѕ ЭСТД б-ЛК оказалась единственной дозой этого ЛС, способной увеличивать толерантность к глюкозе. Это проявилось достоверным снижением показателя гликемии через 60 минут после введения глюкозы. Не исключено, что б-ЛК вызывает лишь слабовыраженное увеличение толерантности к глюкозе из-за чрезмерного потенцирования аутокринного действия инсулина на панкреатические в-эндокриноциты (Loreti L. et al., 1974). Подобное усиление аутокринного сигнала отрицательной обратной связи может ограничивать секрецию эндогенного инсулина в ответ на сахарную нагрузку. Вероятно, аналогичная закономерность лежит и в основе парадоксального снижения толерантности к глюкозе под действием реамберина. Все дозировки этого производного янтарной кислоты увеличивали содержание глюкозы в крови через 2 часа после сахарной нагрузки. Применение Ѕ ЭСТД реамберина дополнительно повышало гликемию через 60 минут после нагрузки. Важно подчеркнуть, что через 30 минут после введения всех доз реамберина достоверно возрастали даже преднагрузочные показатели гликемии (табл. 3). Качественные отличия влияния реамберина на показатели ТТГ от соответствующего эффекта б-ЛК могут быть связаны также со стимулирующим действием янтарной кислоты на орфановый рецептор GPR91, что приводит к активации ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (He W. et al., 2004) и может вызвать вторичную активацию симпато-адреналовой системы со снижением толерантности к глюкозе.

Таблица 2. Влияние -липоевой кислоты и реамберина на латентность развития инсулиновой комы у интактных крыс (Mm)

Примечание к табл. 2:

1) сразу после внутрибрюшинного введения ЛС или 0,9% раствора NaCl крысам проводили струйную внутривенную инфузию нейтрального раствора инсулина для инъекций (Хумулин регуляр, «Eli Lilly», Франция) в дозе 40 IU/кг, о наступлении инсулиновой комы судили по неспособности животных выходить из физиологически неестественного положения (провисание на горизонтальном стержне, подведённом под область живота, в течение 60 секунд) [Волчегорский И.А. и др.,1993, 2000];

2) контрольным крысам вместо -липоевой кислоты и реамберина вводили эквиобъемные количества 0,9% раствора NaCl;

3) - различия с группой контроля достоверны (p < 0,05 по критерию Манна-Уитни).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном инсулин-потенциирующим действии б-ЛК и реамберина, обусловленном их прооксидантной активностью.

Таблица 3. Влияние -липоевой кислоты и реамберина на показатели теста толерантности к глюкозе у интактных крыс (Mm)

Примечание к табл. 3:

1) через 30 минут после однократного введения ЛС животным вводили глюкозу в дозе 2 г/кг (5 мл/кг 40% раствора глюкозы, внутрибрюшинно), контрольным крысам вместо -липоевой кислоты и реамберина вводили 0,9% раствора NaCl;

2) значимость отличий от преднагрузочного уровня гликемии через 60 минут после сахарной нагрузки оценивали с помощью парного критерия Уилкоксона; значимость различий с контрольной группой оценивали с помощью критерия Манна-Уитни;

3) - p < 0,05 по сравнению с преднагрузочными значениями гликемии (только для контрольных групп); ⁺ - p < 0,05 по сравнению с гликемией через 1 час после сахарной нагрузки (только для контрольных групп), - p< 0,05 в группах экспериментальной терапии по сравнению с соответствующими значениями контроля.

Из двух изученных ЛС лишь б-ЛК обладала отчетливым антигипоксическим действием, т.е. вызывала увеличение латентности асфиксической гибели мышей в 1,1 - 1,3 раза по сравнению с контролем (n=10; p=0,000 - 0,035) в прямой зависимости от дозы.

Однократное введение ЭСТД б-ЛК мышам существенно уменьшало выраженность эдемогенного действия формалина. Это проявилось уменьшением выраженности формалинового отека с 41,64 % в контроле до 30,50 % у мышей, получавших б-ЛК (в обоих случаях n=10; p=0,013). Реамберин не оказывал влияния на выраженность формалинового отека ни в одной из изученных доз.

В целом, данные предварительных экспериментов иллюстрируют преимущества б-ЛК над реамберином не только по инсулин-потенциирующему действию и на толерантность к сахарной нагрузке, но и по антигипоксическому и противоспалительному действию. Полученные результаты согласуются с характером влияния изученных ЛС на течение экспериментального СД.

Таблица 4. Влияние реамберина на длительность «поведения отчаяния», активность в «открытом поле» и выраженность гипергликемии при аллоксановом диабете у мышей (M±m)

Примечания к табл. 4:

1) в таблице представлены результаты регистрации актов поведенческой активности, полученные в течение пятиминутного наблюдения за животными в «открытом поле»; длительность «поведения отчаяния» оценивали в 6-минутном тесте подвешивания за хвост (Steru L. et al., 1985);

2) интактным мышам вместо аллоксана, реамберина и инсулина вводили 0,9% раствора NaCl; контрольным мышам с аллоксановым диабетом вместо реамберина вводили эквиобъемное количество 0,9% раствора NaCl;

3) - p < 0,05 по сравнению с интактным контролем; - p< 0,05 по сравнению с контрольной группой мышей с аллоксановым диабетом;

4) значимость межгрупповых различий оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица, Колмогорова-Смирнова.

В результате проведенного исследования было установлено, что введение аллоксана приводит к 2-4 кратному возрастанию концентрации глюкозы в крови мышей на всех сроках эксперимента (табл. 4, 5). Через 96 часов после индукции экспериментального диабета в контрольных группах животных была отмечена летальность от 22,2% до 42,1%. Базисная инсулинотерапия оказалась недостаточной для коррекции гипергликемии, но эффективно предотвращала гибель больных животных. В отсутствии инсулинотерапии использованная доза аллоксана вызывала 100 % летальность мышей на 7 сутки после введения.

Таблица 5. Влияние б-липоевой кислоты на длительность «поведения отчаяния», активность в «открытом поле» и выраженность гипергликемии при аллоксановом диабете у мышей (M±m)

Примечания к табл. 5: соответствуют примечаниям к таблице 4.

Выраженная гипергликемия сопровождалась существенным снижением активности животных в «открытом поле» и нарастанием продолжительности «поведения отчаяния». В объединенных выборках контрольных животных с аллоксановым диабетом на все сроках эксперимента длительность «поведения отчаяния» отрицательно коррелировала с изученными показателями поведения в «открытом поле» (r_s= - 0,487 - - 0,875; Р=0,001 - <0,001). Данная закономерность свидетельствует о том, что в основе угнетения мотивации к исследованию незнакомого пространства лежит депрессивное расстройство поведения (ДРП), т.к. иммобильность в тесте подвешивания за хвост у мышей гомологична депрессии у человека (Steru L. et al., 1985).

Лишь через 17 суток с момента индукции аллоксанового диабета была выявлена прямая зависимость продолжительности «поведения отчаяния» от показателей гликемии (r_s=0,571; Р<0,001). По-видимому, этот срок характеризуется формированием состояния, гомологичного диабетической энцефалопатии человека, при которой хроническая гипергликемия становится основным фактором метаболического поражения головного мозга с сопутствующим развитием депрессии (Коркина М.В. и др., 2003, 2004; Волчегорский И.А. и др., 2006).

Введение б-ЛК и реамберина мышам с аллоксановым диабетом привело к существенным изменениям показателей «поведения отчаяния» и активности животных в «открытом поле». Направленность и выраженность эффекта исследуемых средств существенно зависели от дозы и длительности их применения. Однократное введение б-ЛК и реамберина привело к диаметрально противоположным изменениям поведения больных животных. Через 24 часа после разового применения реамберина было отмечено существенное нарастание активности в «открытом поле» (табл. 4). Наиболее эффективной оказалась минимальная доза (Ѕ ЭСТД), вызвавшая двукратное увеличение всех видов активности больных мышей в «открытом поле». Использование более высоких дозировок (ЭСТД и 2 ЭСТД) привело к интенсификации исследовательской и ориентировочной активности больных мышей, но не оказало значимого влияния на их двигательную активность. В изученном диапазоне доз однократно вводимый реамберин не повлиял на длительность «поведения отчаяния» у мышей с аллоксановым диабетом.

Однократное применение относительно высоких доз б-ЛК (ЭСТД и 2 ЭСТД), в отличие от реамберина, вызвало слабовыраженное, но статистический достоверное уменьшение исследовательской активности больных мышей (табл. 5). Разовое введение минимальной дозы б-ЛК приводило к более чем двукратному снижению ориентировочной активности в «открытом поле» и достоверному сокращению длительности «поведения отчаяния». 7 и 14 кратное введение всех изученных доз б-ЛК вызывали достоверную редукцию «поведения отчаяния» и параллельное увеличение всех видов активности больных животных в «открытом поле» (табл. 5). Единственное исключение составила двигательная активность мышей с аллоксановым диабетом, получавших ЭСТД б-ЛК. Данный показатель оставался неизменным по сравнению с контролем в течение первой недели курса и достоверно возрастал лишь через 14 дней от начала применения б-ЛК.

Курсовое применение реамберина тоже вызывало значимую коррекцию расстройств поведения у мышей с экспериментальным СД (табл. 4). При 7 и 14 кратном введении всех доз реамберина наблюдалось достоверное увеличение активности больных мышей в «открытом поле» и сокращение периода иммобильности в тесте подвешивания за хвост. Полученные данные согласуются с результатами клинического исследования, продемонстрировавшими развитие выраженного тимоаналептического эффекта у больных СД, получавших курсовое лечение реамберином (Волчегорский И.А. и др., 2005). Исключение составила двигательная активность животных, получавших Ѕ ЭСТД реамберина в течение двух недель. В этом случае показатель поведенческой активности статистически не отличался от соответствующего параметра контрольной группы.

Отдельного внимания заслуживает динамика гликемии у животных с аллоксановым диабетом в процессе применения б-ЛК и реамберина. Как видно (табл. 5), б-ЛК не влияла на выраженность гипергликемии при однократном введении, но существенно снижала содержание глюкозы в крови при 7 и 14 дневном применении всех изученных доз. Аналогичный эффект реамберина развивался быстрее, зависел от дозы и носил двухфазный характер. Уже однократное введение минимальной дозы реамберина почти в два раза снизило показатели гликемии у больных мышей (табл. 4). Разовое введение ЭСТД и 2 ЭСТД не отразилось на выраженности гипергликемии. То же самое касается 7 дневного введения всех изученных доз. Лишь двухнедельное применение реамберина привело к уменьшению гипергликемии при всех режимах дозирования. Полученные данные позволяют считать, что антидепрессивный эффект б-ЛК и реамберина при аллоксановом диабете в значительной степени связан с их корригирующем влиянием на расстройства углеводного обмена.

Через 96 часов после введения аллоксана в группе контрольных животных отмечалась гибель 8 из 19 мышей (42,1 %, p=0,005). У животных, получавших Ѕ ЭСТД реамберина, летальность не отмечалась вообще (n=15; p=0,042), а у мышей, получавших ЭСТД, погибло лишь одно животное из 17 в группе (5,9 %, p=0,015).

Полученные данные свидетельствуют, что реамберин превосходит б-ЛК по темпу развития корригирующего эффекта в отношении расстройств мотивированного поведения, углеводного обмена и эффективно предотвращает гибель больных животных при аллоксановом диабете у мышей.

В экспериментах на крысах было установлено, что однократное введение аллоксана вызывает развитие гипергликемии, не полностью корригируемой базисной инсулинотерапией. На всех сроках эксперимента уровень глюкозы в крови больных крыс превышал значения интактного контроля в 2,5 - 3,2 раза (табл. 6, 7). Нарушения углеводного обмена у экспериментальных животных сопровождались отчетливыми дислипидемическими расстройствами. Это проявилось значимым нарастанием триглицеридемии через 4 и 17 дней после введения аллоксана, а также статистически значимой гиперхолестеринемией на заключительном этапе исследования. Отмеченные дислипидемические расстройства сопровождались слабовыраженными сдвигами в состоянии системы ПОЛ-АОЗ (табл. 6, 7). Это проявлялось статистически значимым уменьшением КД и СТ _[г] через 10 дней после введения аллоксана. Уровень ДК_[и] тоже снижался через 17 дней после моделирования аллоксанового диабета. Одновременно со снижением продуктов ПОЛ на заключительном этапе эксперимента было выявлено достоверное увеличение концентрации циркулирующего ЦП, который рассматривается в качестве основного антиоксиданта (АО) плазмы крови (Stocks J. et al., 1974).

Расстройства метаболизма у контрольных животных с аллоксановым диабетом сопровождались ярко выраженными нарушениями поведения в «открытом поле» (табл.8). Это проявилось усугубляющимся в динамике снижением показателей исследовательско-ориентировочной и двигательной активности животных, что отражает нарушение мотивации к исследованию незнакомого пространства у лабораторных грызунов (Буреш Я. И и др., 1991). Параллельно, отмечалось усиление груминга и анксиогенной дефекации, которые рассматриваются в качестве проявления тревожных реакций у крыс (Буреш Я. И и др., 1991). Отмеченные расстройства аффективного статуса сопровождались прогрессирующим во времени снижением показателя качества УРАИ, что иллюстрирует развитие когнитивного дефицита в динамике экспериментального сахарного диабета.

Курсовое применение изученных ЛС вызывало заметную коррекцию этологических расстройств у животных с СД. Прежде всего, это касается б-ЛК, которая оказала существенное корригирующее влияние на параметры поведения крыс с аллоксановым диабетом. Введение даже минимальной дозы б-ЛК (Ѕ ЭСТД) корригировало этологические показатели тревоги у крыс с аллоксановом диабетом. Это проявилось достоверным снижением интенсивности груминга, а также 2 - 4 кратным уменьшением показателя анксиогенной дефекации при 7 - 14 дневном введении Ѕ ЭСТД. При этих режимах введения минимальная доза б-ЛК вызвала существенное возрастание всех показателей исследовательско-ориентировочной, а также двигательной активности больных крыс в «открытом поле». Важно добавить, что при однократном применении Ѕ ЭСТД б-ЛК отмечалось более чем двукратное увеличение показателя качества формирования УРАИ. Аналогичный, но менее выраженный сдвиг был зарегистрирован при двухнедельном введении минимальной дозы б-ЛК.

Относительно высокие дозы (ЭСТД и 2 ЭСТД) б-ЛК вызвали однотипные изменения показателей груминга (табл. 8). Использование этих дозировок б-ЛК вызывало значимое уменьшение груминга только при повторном (7 и 14 кратном) введении. То же самое касалось влияния максимальной дозы б-ЛК на показатели анксиогенной дефекации. ЭСТД б-ЛК уменьшало выраженность анксиогенной дефекации при всех режимах введения. Применение относительно высоких доз, б-ЛК в отличие от минимальной дозы этого ЛС, корригировало показатель качества УРАИ только при курсовом (7 и 14 кратном) введении.

Применение реамберина также приводило к коррекции расстройств поведения и условнорефлекторного обучения крыс с аллоксановым диабетом (табл. 8). При этом временная динамика психотропных эффектов реамберина принципиально отличалась от действия б-ЛК. Прежде всего, это касалось минимальной дозировки реамберина, которая в отличие от Ѕ ЭСТД б-ЛК оказывала не только анксиолитическое и ноотропное действие, но и существенно увеличивала показатели исследовательско-ориентировочной реакции крыс в «открытом поле». Стоит добавить, что более высокие дозы реамберина (ЭСТД и 2 ЭСТД) повышали активность больных животных в «открытом поле» только при повторном (7 и 14 кратном) введении, также как соответствующие дозировки б-ЛК. Однако, в отличие от б-ЛК, все дозы реамберина уменьшали уровень анксиогенной дефекации при всех изученных режимах введения. Важно отметить двухфазный характер влияния Ѕ ЭСТД реамберина на показатели груминга, которые при однократном введении реамберина достоверно возрастали относительно контрольных значении, а при повторном применении оказались существенно ниже по сравнению с аналогичными показателями контрольных крыс с аллоксановым диабетом. Более высокие дозировки реамберина (ЭСТД и 2 ЭСТД) вызывали достоверные изменения груминга только при 1 и 7 кратном введении. При этом, максимальная доза реамберина, также как его минимальная дозировка, вызывала значимое, более чем трехкратное увеличение интенсивности груминга при однократном применении.