Полиморфизмы некоторых генов при бронхиальной астме

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полиморфизмы некоторых генов при бронхиальной астме

14.01.04 - внутренние болезни 14.01.25 - пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

РАЗВОДОВСКАЯ Анастасия Владимировна

Красноярск 2015

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней №1 ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Никулина Светлана Юрьевна

доктор медицинских наук доцент Черкашина Ирина Ивановна

Официальные оппоненты: Логвиненко Надежда Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ, профессор кафедры;

Волкова Людмила Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра внутренних болезней педиатрического факультета, заведующий кафедрой.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Иркутск.

Защита состоится «19» ноября 2015 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.01, созданного на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, http://www.krasgmu.ru

Автореферат разослан «___» _________________ 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.037.01

доктор медицинских наук, доцент Штарик Светлана Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) в настоящее время является одним из наиболее часто-встречаемых бронхолегочных заболеваний, при котором заболеваемость и смертность продолжают расти [Демко И.В., 2012; Bartolomei-Diaz J. A., 2011]. Эпидемиологические исследования последних лет подтверждают высокую распространенность БА, которая варьирует в среднем от 5 до 10% [Ненашева Н.М., 2011; Faiz A., 2012]. Эти факты определяют пристальное внимание исследователей к проблеме профилактики БА[Федосеев Г.Б., 2012].

Наряду с общепризнанными факторами риска БА, такими, как воздействие различных аллергенов, курения и профессиональных вредностей, продолжается поиск новых причин, способствующих возникновению заболевания [Bunyavanich S., 2015]. В результате многочисленных исследований было выяснено, что предполагаемый общий генетический вклад в развитие БА составляет 50-60% [Holloway J. W., 2010; Duru S., 2014; Mathias R. A., 2014].

Количество изученных генетических предикторов постоянно возрастает [Смирнова А.Ю. и соавт., 2014], что дает право говорить о генетическом полиморфизме БА. Остается неясным, какие гены и их сочетание способствуют развитию БА, в том числе в различных этнических группах [Чучалин А. Г., 2011].

В настоящее время внимание исследователей обращено на ассоциацию БА с однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП) генов: rs1804470 трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-в1), rs231775 цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (CTLA4), rs4129267 рецептора интерлейкина 6 (IL6R), rs1051730 никотинового рецептора 3 (CHRNA3). Полиморфизмы этих генов воспроизведены на популяции жителей Азии [Che Z. et al, 2014; Hawkins G. A. еt al, 2012; Nie W. et al, 2012; Wilk J. B. et al, 2012]. Литературные данные об ассоциации БА с такими генами, как: rs1828591 белкового гена регуляции тканей (HHIP), rs1799895 гена внеклеточной супероксиддисмутазы (SOD3) полностью отсутствуют. Поэтому представляется актуальным изучение влияния полиморфизмов генов tgf-в1, ctla4, hhip, il6r, chrna3, sod3 на развитие БА, что позволит проводить раннюю диагностику, даст возможность формировать группы риска развития БА, оптимизировать первичную профилактику, а в дальнейшем, возможно, и терапию данного заболевания.

Цель исследования

Изучить влияние полиморфизмов генов tgf-в1, ctla4, hhip, il6r, chrna3, sod3 на развитие БА для осуществления генетического прогноза и оптимизации первичной профилактики данной патологии.

Задачи исследования

1. Оценить половозрастные, клинические и функциональные характеристики у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.

2. Определить вклад полиморфизмов генов (rs1804470 гена трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-в1); rs231775 гена цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (CTLA4); rs1828591 белкового гена регуляции тканей (HHIP); rs4129267 гена рецептора интерлейкина 6 (IL6R); rs1051730 гена никотинового рецептора 3 (CHRNA3); rs1799895 гена внеклеточной супероксиддисмутазы (SOD3)) в развитие аллергической БА.

3. Исследовать участие полиморфизмов генов (rs1804470 гена трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-в1); rs231775 гена цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (CTLA4); rs1828591 белкового гена регуляции тканей (HHIP); rs4129267 гена рецептора интерлейкина 6 (IL6R); rs1051730 гена никотинового рецептора 3 (CHRNA3); rs1799895 гена внеклеточной супероксиддисмутазы (SOD3)) в развитии неаллергической БА.

Научная новизна результатов исследования

В результате выполнения данной работы впервые у больных БА, жителей г. Красноярска, изучена частота встречаемости генотипов и аллелей ряда генов (трансформирующего фактора роста бета-1 (rs1800470 TGF-в1), цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (rs231775 CTLA4), рецептора интерлейкина 6 (rs4129267 IL6R) и никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3)) и определены ассоциации с риском развития БА. бронхиальный астма ген аллель

Впервые установлено, что носительство аллеля А rs1800470 гена TGF-в1 в гомозиготном (АА) и гетерозиготном (AG) вариантах является предиктором развития неаллергической БА, а гомозиготный генотип GG и носительство аллеля G rs1800470 гена TGF-в1 играют протективную роль в отношении неаллергической БА.

Впервые показано, что гомозиготный генотип GG и носительство аллеля G rs231775 гена CTLA4 является фактором риска развития аллергической БА, а носительство аллеля А в гомозиготном (AA) и гетерозиготном (AG) rs231775 гена CTLA4 вариантах играет протективную роль в отношении данного заболевания.

Наличие аллеля С полиморфизма rs4129267 гена IL6R является предиктором развития неаллергической БА независимо от пола и аллергической БА у мужчин. Аллель Т rs4129267 гена IL6R выполняет протективную роль в отношении БА, независимо от ее генеза.

Носительство аллеля А полиморфизма rs1051730 гена CHRNA3 может быть маркером повышенного риска развития БА, как аллергического, так и неаллергического генеза, независимо от пола. Аллель G гена rs1051730 CHRNA3 определяет защитную функцию в отношении БА.

Практическая значимость работы

Полиморфизмы генов трансформирующего фактора роста бета-1 (rs1800470 TGF-в1), цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (rs231775 CTLA4), рецептора интерлейкина 6 (rs4129267 IL6R), никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3) являются генетическими предикторами развития БА и определяют риск развития данного заболевания.

Определение данных полиморфизмов генов позволит формировать группы риска лиц, угрожаемых по развитию БА, и совершенствовать меры первичной профилактики среди них.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования апробированы и внедрены в лечебно-диагностическую практику специализированного пульмонологического отделения КГБУЗ «КМКБ№20 им. И. С. Берзона» г. Красноярска, приемно-диагностического отделения КГБУЗ «КМКБ№4» г. Красноярска.

Теоретические и практические положения, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе при подготовке студентов на кафедре внутренних болезней №1 КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Генетическими предикторами развития аллергической БА являются: гомозиготный генотип GG по редкому аллелю и аллель G гена цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (rs231775 CTLA4), аллель С гена рецептора интерлейкина 6 (rs4129267 IL6R) среди мужчин, аллель А гена никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3).

2. Гомозиготный генотип АА по распространенному аллелю и аллель А гена трансформирующего фактора роста бета-1 (rs1800470 TGF-в1), аллель С гена рецептора интерлейкина 6 (rs4129267 IL6R) и аллель А гена никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3) являются генетическими факторами риска развития неаллергической БА.

3. Протективное влияние в формировании предрасположенности к развитию аллергической БА оказывает аллель А в гомозиготном и гетерозиготном вариантах гена цитотоксического Т-лимфоцит - связанного иммуноглобулина 4 (rs231775 CTLA4), аллель Т гена рецептора интерлейкина-6 (rs4129267 IL6R), аллель G гена никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3).

4. Гомозиготный генотип GG и аллель G гена трансформирующего фактора роста бета-1 (rs1800470 TGF-в1), аллель Т гена рецептора интерлейкина-6 (rs4129267 IL6R), аллель G гена никотинового рецептора 3 (rs1051730 CHRNA3) выполняют протективную функцию в отношении риска развития неаллергической БА.

Личный вклад автора

Диссертация является самостоятельным научным трудом, выполненным на базе кафедры внутренних болезней №1 Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого и лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний ФГБУ «НИИ терапии и профилактической медицины» СО РАМН (г. Новосибирск).

Автор лично принимал участие во всех этапах выполнения работы: осуществлялось обследование больных БА и оценка их клинического состояния, постановка диагноза, проведение клинико-инструментальной и молекулярно-генетической диагностики. Автором проведен поиск и анализ литературы по теме диссертации, статистическая обработка результатов, анализ полученного материала, написание публикаций и диссертации.

Апробация основных положений работы

Основные положения исследования доложены и обсуждены на краевой конференции «Актуальные вопросы пульмонологии, аллергологии, иммунологии» (Красноярск, 2015 г.), а также на заседании проблемной комиссии по терапии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения Российской Федерации» 29.06.2015 г.

Публикации

Опубликовано по теме диссертации 4 работы в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы

Материал диссертации изложен на 192 страницах, иллюстрирован 9 рисунками и 72 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы исследования; результатов исследования: клинико-функциональная характеристика больных бронхиальной астмой; генетический полиморфизм кандидатных генов у больных бронхиальной астмой и лиц контрольной группы; а также заключения; выводов; практических рекомендаций; списка литературы. Библиографический указатель включает 269 источников: 85 отечественных и 184 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В соответствии с Хельсинской декларацией, для проведения диссертационного исследования получено разрешение Локального этического комитета (протокол исследования № 36/2011 от 22.12.2011г.) при «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России и было подписано информированное согласие на проведение молекулярно-генетического исследования всеми участниками.

Материалы и методы исследования

Согласно целям и задачам, с учетом критериев включения и исключения, было проведено обследование 100 человек с БА, которые составили основную группу исследования.

Критериями включения были: наличие подтвержденного диагноза БА; больные БА европеоидного происхождения, проживающие в г. Красноярске; способность больных выполнять необходимые процедуры; согласие больных на исследование. Критериями исключения были: больные с неуточненным диагнозом БА; больные БА с другими хроническими и острыми заболеваниями легких (ХОБЛ, рак легких, туберкулез, пневмония, ТЭЛА и др.); больные БА с тяжелой сопутствующей и сочетанной патологией (инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, застойная сердечная недостаточность и др.); больные, не способные правильно выполнять дыхательный маневр при определении функции внешнего дыхания.

Диагноз БА был установлен в соответствии с критериями «Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы» 2011 г. [GINA 2011]. Диагноз БА у всех больных был ранее установлен, о чем свидетельствовала представленная медицинская документация. Больные БА при включении в исследование находились в стабильном состоянии, вне обострения заболевания в течение последних двух месяцев.

Все больные БА были подразделены на 2 подгруппы: 1-ю подгруппу составили больные аллергической БА в количестве 68 чел.; 2-ю подгруппу - больные неаллергической БА в количестве 32 чел.

Среди больных, включенных в исследование было 25 мужчин, медиана возраста для них составила 37,0 [21,5;54,5] лет, и 75 женщин, для них медиана составила - 51,0 [41,0;59,0] год. В качестве контроля использовали популяционную выборку относительно здоровых лиц без бронхолегочной патологии жителей Октябрьского района г. Новосибирска, n = 645, медиана возраста - 51,00 лет [30,01; 60,00], обследованных в рамках международных проектов MONICA и HAPIEE. Данные генотипирования предоставил ФГБУ «НИИТПМ» СО РАМН (г. Новосибирск) в рамках договора о сотрудничестве от 01.12.2008 г. Больные основной и контрольной групп по полу и возрасту были сопоставимы.

Методы обследования

Всем больным БА было проведено клинико-инструментальное исследование по следующей программе: клинический осмотр, лабораторное обследование (ФЛГ, ЭКГ), оценка атопического статуса, оценка ФВД (СПГ с пробой) и молекулярно-генетические исследования.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось в ФГБУ "НИИТПМ" СО РАМН г. Новосибирска. Всем больным после венепункции кубитальной вены производился забор 10,0 мл венозной крови в одноразовые стерильные вакуумные пробирки с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (BD Vacutainer®). Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из лейкоцитов крови проводилась методом фенол-хлороформной экстракции [Смит К.и соавт., 1990; Шабалина В.Н., 1994].

При статистической обработке материала применяли стандартный алгоритм статистических процедур, при этом методы статистической обработки использовались в зависимости от характера учетных признаков и числа групп сравнения [Афифи А., Эйзен С., 1982].

Для определения характера распределения количественных показателей применялся критерий Шапиро-Уилкса. При отсутствии нормального распределения описательная статистика представлялась в виде медианы и квартилей. Для определения значимости различий при множественных сравнениях использовали критерий Крускала-Уоллиса, для парных сравнений - критерий Манна-Уитни. При нормальном распределении показателей описательная статистика представлена в виде средней арифметической и среднеквадратического отклонения. Статистическая значимость различий нормально распределенных показателей в сравниваемых группах определялась с использованием критерия Стьюдента (t-критерия) [Шабалина В.Н., 1994]. Качественные критерии представлены в виде процентных долей со стандартной ошибкой доли [Флейс Дж., 1989]. Расчет ошибок для 0% производился по методике А.М. Меркова [Мерков А. М., Поляков Л. Е.,1974].При сравнении качественных показателей с целью оценки статистической значимости различий между группами использовали метод хи-квадрат (ч²), с поправкой на непрерывность. При ожидаемых значениях признака 5 и менее в таблицах «2Ч2» использовался точный критерий Фишера. Различия во всех случаях оценивали, как статистически значимые при р?0,05. Сила связи между изученными признаками определялась при помощи коэффициента корреляции Пирсона и при непараметрическом распределении - коэффициента корреляции Спирмена. Сила корреляционной связи между признаками оценивалась по коэффициенту r (таблица 1).

Таблица 1

Распределение значений коэффициента корреляции

Статистическая значимость коэффициента корреляции устанавливалась по величине средней ошибки () вычислялась по формуле:

где n - число наблюдений, r - коэффициент корреляции.

Если отношение коэффициента корреляции (r) к его средней ошибке (m_r) составляло 3 и более, коэффициент корреляции считали статистически значимым (р?0,05).

Подсчитывали отношение шансов (ОШ - odd ratio) для оценки ассоциации между определенными генотипами и риском развития заболевания по стандартной формуле ОШ = (aЧd)/(bЧc), где a - частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b - частота аллеля (генотипа) в контрольной группе, c - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке больных, d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке. OШ указан с 95%-ным доверительным интервалом (Confidence interval CI).

ОШ считали статистически значимым, если в его доверительный интервал не попадала единица. Статистическая обработка материала проведена с использованием пакета прикладных программ «Excel 2010», «Statistica for Windows 7.0» и «SPSS», версии 19.0 [Боровиков В.П., 2001; Поллард Д., 1982].

Репрезентативность выборки:

Объем выборки определялся по стандартной формуле:

где, (1)

р - величина показателя изучаемого признака;

q - (100-p); t - доверительный коэффициент, показывающий какова вероятность того, что размеры показателя не будут выходить за границы предельной ошибки (обычно берется t = 2, что обеспечивает 95% вероятность безошибочного прогноза); ? -- предельная ошибка показателя [Зайцев В.М., 2003].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Работа была проведена в рамках комплексной научной темы ГБОУ ВПО КрасГМУ: «Клинико-генетические аспекты мультифакториальных заболеваний», номер гос.регистрации - 01200807479 (РК№479-02).

Сравнительный анализ показателей клинического течения астмы продемонстрировал различия по течению болезни, стажу заболевания и причинам обострения. Отмечено преобладание раннего дебюта заболевания у больных аллергической БА и более позднего начала заболевания среди лиц с неаллергической БА (таблица 2).

Таблица 2