Противоишемическое и эндотелиопротективное действие потенцированных антител к эндотелиальному фактору роста сосудов

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Специальность 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЕ И ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОЕ

ДЕЙСТВИЕ ПОТЕНЦИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ К ЭНДОТЕЛИАЛЬНОМУ ФАКТОРУ РОСТА СОСУДОВ

Арустамова Анна Александровна

Белгород - 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема изучения возможностей фармакологической коррекции сердечно-сосудистых заболеваний является одной из важнейших задач современной медицины. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) является одним из ведущих патогенетических звеньев атеросклероза, артериальной гипертензии (АГ), легочной гипертензии, дилатационной кардиомиопатии, гипергомоцистеинемии и др. (Laufs U., 1998; Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2006).

Оксид азота II (NO) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилатации. Фактор вырабатывается эндотелиоцитами (Dzau V.J., 2001). Основ-ным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и био-доступности NO и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005).

Лечение хронической артериальной недостаточности нижних конечностей остаётся одной из центральных проблем в ангиотерапии вследствие широкой распространённости данной патологии, неуклонно прог-рессирующего течения, высокой степени инвалидизации (Чичерин И.Н., 1996).

В последние 30 лет целью многих исследований стало изучение возможности нормализации кровообращения нижних конечностей путем стимуляции ангиогенеза - процесса развития капиллярной сети от уже существующих сосудов.

Эндотелиальный фактор роста сосудов VEGF индуцирует экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и образование NO, который является регулятором функции эндотелия и медиатором ангиогенеза. VEGF - это гликопротеин, связывающийся только с эндотелиоцитами и стимулирующий их пролиферацию. Этот фактор усиленно продуцируется клетками некоторых опухолей человека, способствуя их неоваскуляризации (Ferrara N., 1999).

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции. Одной из важных точек приложения терапевтического воздействия при ЭД является восстановление дефицита NO, которое возможно путем активации фермента eNOS (Бабак О.Я., 2004).

В настоящее время большое внимание уделяется препаратам на основе сверхмалых доз антител (потенцированных антител) к эндогенным регуляторам. Данные препараты обладают выраженной фармакологической активностью при содержании действующего вещества в сверхмалых дозах (менее 10^-24 моль/л) (Сергеева С.А., Эпштейн О.И., 2003).

В гомеопатии применяют сверхразбавленные растворы, подвергшиеся особому процессу - потенцированию, представляющему собой последо-вательное разведение исходного раствора в сочетании с внешним физическим воздействием (механическое встряхивание, обработка с помощью звукового генератора и др.). Не подвергшиеся процессу потенцирования растворы, содержащие сверхмалые дозы антител (при разбавлении выше числа Авогадро), биологической активностью не обладают (Эпштейн О.И., 2000).

Антитела в сверхмалых дозах (СМД) к эндогенному регулятору не подавляют активность молекулы, а модифицируют ее. Этот феномен, открытый О.И. Эпштейном, М.Б. Штарком, воспроизведен в экспериментальных исследованиях, проведенных в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАН, как на молекулярном, так и на системном уровнях с рядом антител.

Как свидетельствуют литературные данные, перспективность в фарма-кологической коррекции ЭД отводится препарату «Импаза», представителю универсальных регуляторов гомеостаза, в состав которого входят потенци-рованные антитела к eNOS. Способ лечения данным препаратом заключается в активизации по механизму «обратной связи» выработки контрантител для ликвидации дисбаланса при сниженном количестве еNOS.

Учитывая вышеприведённые данные и свойства VEGF как индуктора экспрессии eNOS и медиатора ангиогенеза, можно предположить, что потенцированные антитела к фактору роста эндотелия VEGF будут обладать противоишемическим и эндотелиопротективным действием вследствие активации ими по принципу «обратной связи» выработки VEGF.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиотропного и противоишемического действия смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF.

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардиотропного действия при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции потенцированных антител к VEGF в сравнении с потенцированными антителами к eNOS и их влияния на ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Разработать комплекс методических подходов для оценки эндотелиотропного действия фармакологических агентов с изменением режима введения N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12, 5 мг/кг однократно внутрибрюшинно ежедневно в течение 28-ми суток.

2. Изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД.

3. В сравнительном аспекте изучить эндотелиопротективную активность смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) (ООО «НПФ Материа-Медика Холдинг», Россия) при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД.

4. Исследовать влияние смеси растворов гомеопатичесикх разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

5. В сравнительном аспекте изучить влияние смеси растворов гомеопатичесикх разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS - С12, С30, С200 на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов СМД антител к eNOS (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии на лабораторных крысах оказывают эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД, выражающееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).

Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов СМД антител к eNOS (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии оказывают кардиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME - индуцированной патологией.

В работе впервые показано, что смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. и смесь растворов СМД к eNOS (С12, С30, С200) в дозе 9 мл/кг/сут. интрагастрально в качестве монотерапии позволяют компенсировать признаки хронической ишемии конечности. Результаты, полученные при проведении ЛДФ, подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались. У всех животных этих групп отмечалось усиленное новообразование капилляров.

Подано 3 заявки на изобретения по результатам проведенных экспериментальных исследований:

- Способ коррекции L-NAME - индуцированной эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200;

- Способ фармакологической коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений;

- Способ фармакологической коррекции ишемии конечности.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) и смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) в качестве монотерапии для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД в 3 раза, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Тоtal NO), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания исследуемых гомеопатических разведений при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией, и хронической артериальной недостаточности нижних конечностей.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиотропной и противоишемической активности стимулятора VEGF и стимулятора eNOS, используются в «Материа Медика Холдинг» с целью формирования представ-ления о фармакологической активности данных гомеопатических разведений.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2010 г., XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО, анатомии и гистологии человека, биохимии и фармакологии, фармацевтической химии и фармакогнозии, фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения, акушерства и гинекологии, медико-биологических дисциплин БелГУ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном интрагастральном введении оказывают в качестве монотерапии эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированной ЭД, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME - индуцированной патологией.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. при ежедневном интрагастральном введении в качестве монотерапии увеличивают показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает (р<0, 05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 152 источника, из них 79 отечественных и 73 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 10, рисунков - 39, схем - 1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ишемия эндотелиальный антитело кардиотропный

Материалы и методы исследования

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 12, 5 мг/кг/сут. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997), эндотелийнезависимая вазодилатация - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP100, производства Biopac System регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), ЧСС и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение ЧСС и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд. мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0, 9 % раствора NaCl, из расчёта 0, 4 мл на 100 г) (Тюренков И.Н., 2005).

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 10^-5моль/л, из расчёта 0, 1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

4. 3-минутную гипоксию (Пашин Е.Н., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2005).

Моделирование хронической ишемии задней конечности. Осуществляли под наркозом хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг после соответствующей подготовки кожи. Затем производили разрез по внутренней поверхности области бедра. Рассекали собственную фасцию. Выделяли элементы основного сосудисто-нервного пучка бедра. Бедренную артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали. Затем накладывали лигатуры на артерию в месте ее начала и пересекали. Перевязывали и пересекали a. saphena. Выделяли подко-ленную артерию и начальные отделы артерий голени, которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Рану на бедре послойно ушивали непрерывным швом.

Данная модификация модели приводит к развитию ишемии более тяжёлой степени. Методика моделирования описана в работах S. Takeshita et. al.

Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс осуществлялась методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазерный доплеровский флоуметр «Biopac-systems MP 100» и датчика «TSD-144». Исследование проводили под наркозом хлоралгидрат (300 мг/кг). После наступления наркотического сна иссекали участок кожи в передне-наружном участке области правой голени до собственной фасции. Датчик вплотную приставляли к мышце и проводили запись кривой микроциркуляции. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы, точка на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее, 5) медиальнее относительно первой. Запись кривой микро-циркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данного животного.

Методы морфологического исследования. Для морфологического исследования после выведения животных из эксперимента производили забор материала органов: сердце, почки, участок мышцы голени. Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Сердца рассекали через середину во фронтальной плоскости в виде пластин толщиной 2 мм, в которых содержались оба предсердия, правый и левый желудочки, межжелудочковая перегородка. Кусочки почек вырезали в поперечном направлении строго через центральную часть, включающую почечный сосочек. Окраску срезов гематоксилином и эозином производили в автоматическом режиме в автостейнере HMS 740 (Microm Int. GmbH, Германия). Определяли диаметры кардиомиоцитов левого желудочка, кровеносных сосудов, в почках измеряли диаметры почечных клубочков. Просмотр, анализ и морфометрию осуществляли с помощью программы просмотра и анализа изображений Mirax Viewer 1.12.

Дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная и противоишемическая активность потенцированных антител к эндотелиальному фактору роста сосудов VEGF в сравнении со СМД антител к eNOS.

Данные разведения крысы получали внутрижелудочно из расчёта 9 мл/кг/сут. В хроническом эксперименте при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита NO смеси растворов гомеопатических разведений вводились ежедневно в дозе 4, 5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней через 30 минут после введения L-NAME.

С целью коррекции экспериментальной ишемии конечности исследуемые гомеопатические разведения вводили в дозе 4, 5 мл/кг 2 раза в сутки в течение 28 дней. Доза 9 мл/кг/сут. внутрижелудочно ежедневно в виде смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200 выбрана нами в сотрудничестве с «Материа Медика», исходя из максимально допустимого объёма жидкости при внутрижелудочном введении лабораторному животному.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на лабораторных крысах.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0, 05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 28 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 12, 5 мг/кг привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийза-висимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в отличие от интакт-ных животных. На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением АД и брадикардией. После окончания миокардиального компонента АД восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления АД рассматривался как площадь эндотелиальной реакции.

На рис. 2б представлена реакция на ацетилхолин при моделировании L-NAME-индуцированной ЭД. При этом видно, что площадь эндотелий-зависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).



Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1, 2, при L-NAME-индуцированном дефиците NO - в 3 раза больше: его значение составило 3, 5 (рис. 1). L-NAME-индуцированный дефицит NO привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1). У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 93, 9%, а у животных с L-NAME-индуцированной патологией значительно сильнее - до 67, 5%.

Характерная динамика биохимических маркеров L-NAME-индуцированного дефицита NO представлена на рис. 1. Обнаружено, что моделирование L-NAME-индуцированной патологии приводило к снижению содержания нитрит-ионов в 3 раза.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие L-NAME-индуцированной ЭД, явились результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах, рис. 4а - интактные миокардиоциты, рис. 4б - миокардиоциты животных на 28-е сутки с L-NAME-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9, 91 мкм, а у животных, получавших L-NAME, - 15, 14 мкм (рис. 1).

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артерий (рис. 5). У интактных животных (а) - клетки эндотелия расположены плоско, при L-NAME-патологии (б) - сосуд спазмирован, стенки утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 28-ми суток внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 12, 5 мг/кг массы тела животного вызывает развитие ЭД, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности, характерными биохимическими сдвигами и гистоло-гической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

2. Исследование эндотелиопротективной активности потенциро-ванных антител к VEGF и потенцированных антител к eNOS при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

Наши исследования показали, что потенцированные антитела к VEGF и потенцированные антитела к eNOS обладают выраженным эндотелио-протективным эффектом. Так, КЭД у интактных животных составил - 1, 2, с L-NAME патологией - 3, 5, L-NAME + потенцированные антитела к VEGF - 1, 7, L-NAME + потенцированные антитела к eNOS - 1, 8 (рис. 6).

Отмечено, что данные гомеопатические разведения слабо предотвращали повышение адренореактивности, вызванное L-NAME-индуцированной патологией. У интактных животных показатели сократимости левого желудочка сердца составили 199, 8 мм рт.ст., у L-NAME - 281, 1 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к VEGF - 273, 9 мм рт.ст., в группе с коррекцией потенцированными антителами к eNOS - 269, 4 мм рт.ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением приём исследуемых растворов гомеопатических разведений предотвращал падение сократимости с 5 на 25 секунду пережатия аорты (рис. 6). Сократимость на 25 сек нагрузки составила у интактных животных - 93, 9% к 5-й сек, взятой за 100%. L-NAME-индуцированная патология - 67, 5%, с коррекцией потенцированными антителами к VEGF - 97, 1%, с коррекцией потенцированными антителами к eNOS - 105, 6%.



Результаты исследования функционального состояния миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие смеси растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) и СМД антител к эндотелиальной NO-синтазе (смеси гомеопатических разведений С12+С30+С200) (9 мл/кг/сут.), выражающееся в предотвращении падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением и увеличении сократимости на пике реоксигенации по сравнению с животными у которых моделировали L-NAME - индуцированный дефицит NO (для потенцированных антител к eNOS).

Концентрация нитрит-ионов под влиянием исследуемых гомеопатических разведений увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей интактных животных (рис. 6).

Исследуемые гомеопатические разведения статистически достоверно предотвращали увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов (рис. 6). Одновременно более благоприятная картина морфологических изменений под влиянием коррекции обнаруживалась в почках.

Таким образом, смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.) и смесь растворов сверхмалых доз антител к eNOS (гомеопатические разведения С12, С30, С200) (9 мл/кг/сут.) проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

3. Исследование влияния потенцированных антител к VEGF и потенцированных антител к eNOS на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

Данная экспериментальная работа проведена на 50 крысах-самцах линии «Wistar», половозрелых, массой 250-350 г. У лабораторных животных оценивали уровень микроциркуляции методом лазерной доплеровской флоуметрии и морфологическую картину в мышцах задней конечности.

Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в интактной группе крыс составило 525, 7±9, 8 п.е. (перфузионных единиц). Уровень микроциркуляции в правой и левой мышцах голени животных не отличался друг от друга (р>0, 05). Данное значение было принято в качестве исходной нормы. Среднее значение уровня микроциркуляции в наружной группе мышц правой голени в группе ложнооперированных крыс составляет на 28 сутки 531, 8±12, 8 п.е. Результаты достоверно не отличается от данных, полученных в группе интактных животных (р>0, 05).

При морфологическом изучении мышц голени интактной группы животных получена следующая картина. Мышечные волокна в препарате располагаются плотно друг к другу, соединительная ткань (строма) между волокнами не выражена. Присутствуют сосуды микроциркуляторного русла, иногда в препарате оказываются более крупные сосуды (артериолы, мелкие артерии, венулы) (рис. 7).

При осмотре контрольной группы животных после операции моделирования ишемии у всех животных были отмечены признаки острой ишемии оперированной конечности. Имели место ишемический отёк, боль в конечности, что проявлялось неучастием конечности в передвижении, а также агрессивной реакцией крысы на касание инструментом до больной конечности.

С течением времени появлялись признаки формирующейся хронической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как перемежающаяся хромота, трофические расстройства в дистальных участках конечности.

В контрольной группе животных на 28-е сутки мышца выглядела несколько гипотрофичной. При гистологическом исследовании наблюдаются участки резорбируемого некроза (рис.8), а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров.

Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных на 28 сутки при моделировании ишемии конечности и ее коррекции смесью растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. и смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. представлены в таблице 1. Уровень микроциркуляции после операции моделирования ишемии задней конечности составил на 28 сутки 361, 3 ±8, 7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных (р<0, 001) и ложнооперированных животных (р<0, 001).

На фоне коррекции патологии потенцированными антителами к VEGF уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486, 1 ±18, 8 п.е. ( р<0, 05).

При коррекции патологии потенцированными антителами к эндоте-лиальной синтазе оксида азота уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490, 3±18, 6 п.е. ( р<0, 05).

Таблица 1 Результаты оценки уровня микроциркуляции в мышцах голени на 28 сутки (М±m), п.е. (перфузионные единицы)

Интактные (n=10)	525, 7 ±9, 8
Ложнооперированные (n=10)	531, 8±12, 8
Ишемия конечности (n=10)	361, 3 ±8, 7*
Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к eNOS - С12, С30, С200 (n=10)	490, 3±18, 6**
Ишемия конечности + смесь р-ров потенцированных антител к VEGF - С12, С30, С200 (n=10)	486, 1 ±18, 8**

Примечание: * - р<0, 05 в сравнении с интактными; ** - р<0, 05 в сравнении с группой с ишемией конечности

При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени в группах с фармакологической коррекцией патологии не отличались по цвету и виду от мышц интактных крыс. При гистологическом исследовании в данных группах некротические изменения и остаточные явления в виде очагов грануляционной или рубцовой ткани не выявлены. Мышечные волокна имели сохранную общую структуру. Саркоплазма характеризовалась однородной окраской, ядра расположены равномерно и типично на периферии. При визуальной оценке степени васкуляризации мышц выявляется относительно равномерное кровенаполнение сосудов различного диаметра. В обеих группах животных очагово выявлена большая концентрация ядер эндотелиальных клеток, что отражает картины формирования капиллярных почек новообразующихся капилляров (рис. 9).

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать эффективность фармакологической коррекции ишемии конечности исследуемыми растворами гомеопатических разведений антител за счет стимуляции неоангиогенеза.



ВЫВОДЫ

1. Ежедневное введение N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12, 5 мг/кг в течение 28-ми суток однократно внутрибрюшинно вызывает у крыс-самцов развитие эндотелиальной дисфункции, выражающейся в увеличении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза по сравнению со значениями в интактной группе животных; развитие артериальной гипертензии (204, 8 / 164, 2 мм.рт.ст.); вызывает снижение содержания нитрит-ионов, снижение показателей сократимости при проведении пробы «нагрузка сопротивлением» и гипертрофию кардиомиоцитов.

2. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO в течение 28-ми суток, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Результаты нагрузочных проб выявили улучшение показателей сократимости в пробе «нагрузка сопротивлением». Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием данных гомеопатических разведений увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с L-NAME - индуцированной патологией. Монотерапия данными гомеопатическими разведениями в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений АД.

3. Смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. проявляет эндотелиопротективное действие на 28-дневной модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, достоверно не отличающееся от действия потенцированных антител к VEGF по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Значения КЭД, АД, поперечного диаметра миокардиоцитов, содержания нитрит-ионов не показали достоверных отличий по сравнению с соответствующими значениями в группе животных, получавших смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. В пробе на адренореактивность коррекция потенцированными антителами к VEGF в меньшей степени предотвращала развитие гиперадренореактивности, чем коррекция потенцированными антителами к eNOS.

4. Смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. увеличивает показатели микроцикуляции в ишемизированной конечности на 28-е сутки за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоангиогенеза. На фоне фармакологической коррекции ишемии мышцы голени уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 486, 1 п.е. (р<0, 05) по сравнению со значениями в контрольной группе животных (361, 3 п.е.).

5. При коррекции ишемии конечности смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к eNOS - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут. уровень микроциркуляции достоверно возрастает до 490, 3 п.е. (р<0, 05) по сравнению с данными контрольной группы (361, 3 п.е.) и достоверно не отличается от уровня микроциркуляции в группе с коррекцией потенцированными антителами к VEGF (486, 1 п.е.). Результаты подтверждаются данными морфологического исследования: в мышцах ишемизированной голени некротические изменения не обнаруживались, отмечалось усиленное новообразование капилляров, что подтверждает положительное влияние исследуемых гомеопатических разведений на ангиогенез в ишемизированной мышце. Достоверных различий в эффективности противоишемического действия исследуемых гомеопатических разведений не обнаружено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потенцированные разведения антител к эндотелиальному фактору роста / А. С. Белоус, О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Материалы IV международной научной конференции молодых учёных-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г.: 3 т. / Курск. гос. мед. ун-т, Воронеж. гос. мед. акад. [и др.] ; под ред. В. А. Лазаренко. - Курск, 2010. - Т. 1. - С. 88-89.

2. Актуальность создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к эндотелиальному фактору роста / А. С. Белоус, О. С. Гудырев, А. А. Арустамова [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В. В. Пичугина и 75-летию КГМУ, Курск, 25 дек. 2009 г. / Курск. гос. мед. ун-т. Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, РАЕН, Всерос. об-во фармакологов-токсикологов. - Курск, 2009. - С. 108-109.

3. Перспективы создания нового препарата на основе потенцированных разведений антител к VEGF / А. С. Белоус, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Человек и лекарство: XVII Рос. нац. конгр., Москва, 12-16 апр. 2010 г.: сб. материалов конгр. (тез. докл.). - М., 2010. - С. 578-579.

4. Коррекция гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции препаратом импаза в комплексе с эналаприлом и лозартаном / А. С. Белоус, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. - 2010. - Т. 14, № 4. - С. 3-6. (Перечень ВАК)

5. Способ коррекции гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека - С12, С30, С200 / А. А. Арустамова, А. С. Белоус, М. В. Покровский [и др.] // Инновации в медицине: материалы 3 междунар. дистанц. науч. конф. / КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, Общерос. обществ. орг. «Рос. союз молодых учёных» ; под ред. В. А. Лазаренко, П. В. Калуцкого. - Курск, 2010. - С. 12-16.

6. Воспроизведение стрептозотоцин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс / А. И. Маяков, М. В. Покровский, А. А. Арустамова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22, вып. 12. - С. 56-63. (Перечень ВАК)

7. Эндотелиопротективные, кардиопротективные эффекты аторвастатина и его комбинаций с L-аргинином и резвератролом в эксперименте / Т. В. Долженкова, В. И. Якушев, А. А. Арустамова [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 7. - С. 61-65. (Перечень ВАК)

8. Устройство для дистантного прекондиционирования: пат. на полезную модель 97615 Рос. Федерация: МПК А61В17/12. / О. О. Новиков, М. В. Покровский, В. И. Кочкаров [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Белгор. гос. ун-т». - № 2010110708/22 ; заявл. 23.03.2010 ; опубл. 20.09.2010, Бюл. № 26. - 6 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия

АД - артериальное давление

АХ - ацетилхолин

ДАД - диастолическое артериальное давление

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия

ЛЖД - левожелудочковое давление

НП - нитропруссид

САД - систолическое артериальное давление

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота II

L-NAME - N-нитро-L-аргинин метиловый эфир

NO - оксид азота II

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

+dp/dt - максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления

- dp/dt - максимальная скорость снижения левожелудочкового давления

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

р - уровень статистической значимости

* - достоверность различий, p<0, 05

Размещено на Allbest.ru