Дисбаланс цитокинов при синдроме диабетической стопы и подходы к его коррекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ДИСБАЛАНС ЦИТОКИНОВ ПРИ СИНДРОМЕ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ И ПОДХОДЫ К ЕГО КОРРЕКЦИИ

БАКОТИНА АННА ЕВГЕНЬЕВНА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

14.01.02 - эндокринология

Москва - 2010

ПЕРЕЧЕНЬ ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации

ПВЧ - порог вибрационной чувствительности

ПЛИ - плече-лодыжечный индекс

ТФР - трансформирующий фактор роста

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Ковальчук Леонид Васильевич

кандидат медицинских наук,

профессор Потемкин Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Черноусов Александр Дмитриевич

доктор медицинских наук,

профессор Петунина Нина Александровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский медико-стоматологический университет Росздрава

Защита диссертации состоится «20» сентября 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «30» июня 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения в настоящее время в мире насчитывается около 180 миллионов больных сахарным диабетом (СД). Расчеты показали, что, в случае увеличения средней продолжительности жизни до 80 лет, количество больных СД может достигнуть 17% от численности всего населения. В развитых промышленных странах заболеваемость СД колеблется от 1% до 6% от общего количества населения, а среди лиц старше 65 лет около 10%. Россия входит в пятерку стран с наибольшей заболеваемостью СД. Учитывая хроническое неизлечимое течение заболевания и увеличивающуюся среднюю продолжительность жизни пациентов, все большую актуальность приобретают исследования, направленные на разработку методов диагностики, профилактики и лечения поздних осложнений СД. Одним из осложнений СД, наиболее часто приводящим к инвалидизации и снижению качества жизни пациентов, является синдром диабетической стопы (СДС) [Дедов И.И. и соавт. 2005].

Синдром диабетической стопы наблюдается у 10-30% больных СД. Ампутации нижних конечностей у данной группы пациентов производятся в 20-40 раз чаще, чем у остального населения. Число больших ампутаций при гнойно-некротических осложнениях диабетической стопы снижается медленно и составляет 30 - 35% из всех больных СД. Прогноз еще более удручает, если учесть, что почти у каждого второго больного после ампутации через 3-4 года приходится ампутировать и другую конечность. 85% высоких ампутаций при СДС возможно было бы предотвратить [Токмакова А.Ю. и соавт. 2003; Lobmann R. Et al., 2002].

В последние годы появились новые данные о патогенезе диабетической микро- и макроангиопатии, нейропатии [Токмакова А.Ю. и соавт. 2003]. Если традиционно считали пусковым механизмом и основным фактором данных процессов нарушения углеводного обмена, то с современных позиций, в патогенезе СДС существенную роль стали отводить иммунным механизмам. По немногочисленным данным, для СДС характерны разноплановые по точкам приложения и глубине изменения в иммунной системе - снижение количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, нарушение фагоцитарного звена, дисиммуноглобулинемия, а также дисбаланс цитокинов [Amery CM. et al., 2005; Efton P.A. et al., 2004]: повышение провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов. Цитокины, являясь универсальными регуляторами клеточных функций, секретируются всеми типами клеток: лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, клетками эпителия, эндотелия, фибробластами, их высокоспецифические рецепторы на связывающих клетках образуют единую клеточно-медиаторную цепь, участвующую в развитии иммунного ответа, а также процессов воспаления и регенерации, однако, практически не изучено содержание цитокинов в отделяемом раны при синдроме диабетической стопы.

Развитие методов иммунодиагностики и появление новых иммуномодуляторов позволяет на сегодняшний день не только выявить уровень дефекта в иммунной системе, но и провести направленную иммунокоррекцию.

Большой интерес в последние годы вызывает использование цитокинов и различных факторов роста в лечении хронических ран у больных СД. Факторы роста регулируют синтез коллагена и компонентов соединительнотканного матрикса, рост сосудов и реэпителизацию.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность проблемы и целесообразность выполнения исследования с целью изучения возможности применения цитокинов и факторов роста у больных с СДС.

Цель исследования: оптимизация лечебной тактики больных с синдромом диабетической стопы путем локальной цитокинотерапии на основе коррекции цитокинового дисбаланса.

Задачи исследования:

1. Провести исследование уровней про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-в) в сыворотке крови и экссудате раневого отделяемого больных с синдромом диабетической стопы. Изучить взаимосвязь уровней данных цитокинов с длительность сахарного диабета, уровнем гликированного гемоглобина (HbA1c).

2. Оценить влияние выявленных нарушений цитокинового статуса на течение и исход различных форм диабетической стопы.

3. Сравнить эффективность лечения больных с синдромом диабетической стопы при использовании традиционной терапии и комплексной терапии с применением природного комплекса цитокинов (Суперлимфа).

4. Исследовать влияние локальной цитокинотерапии на заживление язвенных дефектов у больных с синдромом диабетической стопы.

Научная новизна исследования.

Впервые исследован системный и локальный цитокиновый статус у больных с разными формами диабетической стопы и показана более высокая клиническая значимость показателей цитокинов в экссудате раневого отделяемого. диабетический стопа провоспалительный сыворотка

Впервые определены уровни про- и противовоспалительных цитокинов в экссудате раневого отделяемого из трофических язв больных с синдромом диабетической стопы и выявлен дисбаланс с преобладанием провоспалительного цитокина.

Впервые показана эффективность применения иммунотропного препарата Суперлимф в комплексном лечении больных с синдромом диабетической стопы, коррелирующая с повышением концентрации ТФР-в и снижением концентрации ИЛ-8 в раневом отделяемом.

Практическая значимость полученных результатов.

Выявленные нарушения цитокинового дисбаланса (повышение провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов) у больных с различными формами синдрома диабетической стопы обосновывают необходимость применения методов иммунокоррекции в комплексной терапии при СДС.

Получено улучшение результатов лечения больных с трофическими язвами стоп при СД 2 типа с помощью иммунотропного препарата Суперлимф. У больных, леченных Суперлимфом наблюдалась положительная динамика субъективной симптоматики, быстрое купирование признаков эндогенной интоксикации, быстрая компенсация СД, наиболее полная эрадикацией микроорганизмов из очага воспаления, интенсивная положительная динамика раневого процесса и нормализация баланса про- и противовоспалительных цитокинов.

Положения, выносимые на защиту.

1.Изменение локального цитокинового статуса в виде снижения противоспалительных и повышения провоспалительных цитокинов характерно для больных с СДС.

2.Уровни цитокинов экссудата раневого отделяемого зависят от длительности СД, уровня НвА1с, ЛИИ и не зависят от формы СДС.

3.Применение Суперлимфа в комплексной терапии больных с СДС способствует нормализации иммунного статуса, что в свою очередь обеспечивает эффективное заживление язвенных дефектов стоп при СДС.

Личный вклад соискателя. Автор лично участвовала в отборе больных, проводила клинический осмотр пациентов для научного исследования, активно участвовала в их комплексном лабораторно-инструментальном обследовании, самостоятельно проводила забор материала из гнойно-некротического очага, участвовала в определении цитокинов в сыворотке крови и раневом отделяемом из язвенных дефектов методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем, проводила локальную цитокинотерапию, оценивала эффективность проводимого лечения. Интерпретация полученных результатов и их статистическая обработка также осуществлена автором.

Внедрение результатов работы. Результаты данной работы используются в клинической практике эндокринологического отделения, отделения гнойно-септической хирургии ГКБ №68.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции кафедры иммунологии МБФ и кафедры эндокринологии лечебного факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, врачей эндокринологического отделения ГКБ №68 17.05.2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в отечественной печати, в том числе 2 статьи в ВАК рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель включает 163 ссылки (на 77 отечественных и 86 зарубежных публикаций). Диссертация иллюстрирована 33 таблицами, 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее исследование были включены 72 больных сахарным диабетом 2 типа с СДС, составившие две группы: исследуемую группу и группу сравнения. В исследуемую группу (группа 1) включены 38 пациентов, у которых наряду со стандартным лечением СДС, проводились местные аппликации с раствором иммуномодулятора Суперлимф по общепринятой схеме. Группу сравнения (группа 2) составили 34 больных, у которых применялась традиционное для данной патологии лечение.

Из 72 пациентов, включенных в исследование, женщин было - 43 (63,5%), мужчин - 29 (36,5 %). Возраст пациентов колебался от 52 до 78 лет, средний возраст пациентов группы 1 66±7,9 лет, группы 2 - 65,4±6,6 лет. Длительность СД 2 типа у пациентов 1 группы составила в среднем 11,5±6,2 года, группы 2 - 12±6,3 лет. У всех пациентов проводилась до госпитализации медикаментозная терапия СД: инсулинотерапию получал 31 больной (43%), пероральные сахароснижающие препараты (ПССП)- 17 человек (23,6%), комбинированную терапию - 24 человека (33,4%). Средний уровень гликированного гемоглобина в исследуемой группе составил 10,5±1,4 %, в группе сравнения - 10,5±1,2 %.

Из сопутствующих заболеваний преобладали ИБС у 63 (87,5%), гипертоническая болезнь у 55 (76,5%) человек, хронический пиелонефрит у 43 (60%). У 54 (75%) пациентов выявлено наличие ожирения 1-3 степени. ИМТ у пациентов 1 группы составил 32,5±4,4, у 2 группы - 32,7±5 (р>0,05). Выявлены также другие осложнения СД: диабетическая ретинопатия у 29 (40,3%), диабетическая нефропатия у 26 (36%).

Учитывая специфику стационара и в соответствии с целями и задачами нашего исследования, в исследование были включены больные с нейропатической и нейро-ишемической формами СДС и с 3 степенью поражения стоп по Вагнеру.

Критериями исключения из исследования были пациенты с другими формами и стадиями диабетической стопы, тяжелые сопутствующие заболевания (острая недостаточность кровообращения, деменция, онкология, инфаркт миокарда), необходимость экстренного хирургического лечения.

В исследуемой группе у 25 (34,7 %) пациентов диагностирована нейро-ишемической форма и у 13 (18,1 %) - нейропатическая форма СДС, в группе сравнения у 23 (30,6 %) - нейро-ишемическая формой, у 11 (16,6%) - нейропатическая форма.

Длительность персистирования СДС составила 18,4±12 месяцев у пациентов 1 группы и 21±10,5 месяцев во второй группе (р>0,05). Наличие язвенного дефекта впервые диагностировано в сроки от 2 до 20 месяцев после появления симптомов СДС у пациентов 1 группы, от 1 до 21 месяцев - у больных в группе сравнения.

Площадь язвенного дефекта у пациентов 1 группы составляла в среднем 2,7±1,9 см², а в группе 2 - 2,9±1,4 см², глубина язвенного дефекта в 1 группе составила в среднем 2,9±1,8 мм, во 2 - 3,1±1,4 мм.

Клиническая характеристика обследованных больных представлена в таблице 1.

Табл.1. Клиническая характеристика обследованных больных.

Показатель	1группа (n=38) топическая иммунотерапия	2 группа(n=34) традиционное лечение
Пол, (м/ж) (n)	16 (22%) 22 (31%)	13 (18%) 21 (29%)
Возраст, (годы)	66±7,9	65,2±7,3
Длительность СД (годы)	11,5±6,2	12±6,3
Глюкоза крови натощак/глюкоза крови после еды (ммоль/л)	11,1±1,6 13,5±1,9	11,3±2 13,2±2,3
НВА1С (%)	10,5±1,4	10,8±1,2
ОХс, ммоль/л ТГ, ммоль/л	5,95±1,3 2,3±1,1	5,7±1,2 2,02±0,7
Нейропатическая форма (n)	13 (18,1%)	11 (16,6%)
Нейро-ишемическая форма (n)	25 (34,7%)	23 (30,6%)
Длительность СДС (мес.)	18,2±12	21±11,1

Методы клинического исследования

- Стандартный опрос с учетом анамнеза жалоб, анамнестических данных.

- Физикальное обследование. ИМТ рассчитывали как величину отношения массы тела в килограммах к квадрату роста в метрах (за норму считали ИМТ до 25 кг/м2)

При осмотре нижних конечностей обращали внимание на цвет кожных покровов, наличие отеков, температуру кожных покровов, наличие гиперкератоза и деформаций. При поступлении и в динамике измеряли площадь и глубину язвенного дефекта, фиксировали наличие локальных признаков инфицирования.

Лабораторные методы исследования

-Уровень глюкозы в капиллярной крови определяли с помощью стандартных тест-полосок на глюкометре «Glucotrend» (Boehringer Mannheim Roche) (Австрия)

- Уровень гликированного гемоглобина определяли на приборе DCA 2000-методом латексного ингибирования иммуноагглютинации с помощью «Hemoglobin A1c Reagent kit.

- Токсичность крови изучали при помощи вычисления лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), который рассчитывается по Я. Я. Кальф-Камфу и С.Н. Захарову и соавт. (1982):

ЛИИ= (4 Ми + 3 Ю + 2 П + С) Ч (Пл + 1)

(Мон + Лимф) Ч (Э + 1)

Ми - миелоциты, Ю - юные формы, П - палочкоядерные, С - сегментоядерные нейтрофилы, Пл - плазматические клетки, Мон - моноциты, Лимф - лимфоциты, Э - эозинофилы. В норме ЛИИ=1,3±0,5.

Всем больным, проводили иммунологическое исследование уровня про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-в) в сыворотке крови и экссудате раневого отделяемого язвенного дефекта до и после лечения. Забор материала из гнойно-некротического очага производили фильтровальной бумагой 1,0*1,0 см., которую затем помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл в 100 мкл стерильного физиологического раствора, через 30 минут фильтровальную бумагу изымали и содержимое пробирки замораживали для дальнейшего хранения в течение месяца.

Определение уровня цитокинов осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем, выпускаемых фирмой BIOSOURCE (Бельгия). Тест-системы представляют собой микропланшеты, покрытые антителами к антигену - исследуемой структуре цитокина, в нашем случае к ИЛ-8 и ТФР-в.

Всем пациентам проводили бактериологическое исследование локальной микрофлоры язвенного дефекта и ее чувствительность к антибиотикам с определением количественного содержания в 1 г тканей.

Для диагностики периферической сенсомоторной нейропатии проводили общепринятое комплексное неврологическое клинико-инструментальное обследование, включающее оценку шкалы неврологических симптомов - NSS (Neuropathy Symptom Score или нейропатический симптоматический счет) и шкалы признаков - NDS (Neuropathy Disability Score или нейропатический дисфункциональный счет) (Young M.J., 1993, Dyck P.J., 1992).

Cтепень тяжести периферической сенсомоторной нейропатии оценивали на основании исследования порогов 4 видов чувствительности (тактильной, болевой, температурной и вибрационной) и исследования рефлексов (ахилловых и коленных) на основании стандартизированных тестов, принятых в международной практике для исследования периферической сенсомоторной нейропатии.

Порог вибрационной чувствительности исследовали при помощи градуированного неврологического камертона, вибрирующего с частотой 128 Гц. Вибрационная чувствительность определялась на верхушке I пальца стопы и на медиальной лодыжке. Оценка температурной чувствительности проводилась с помощью устройства Тип-темп (Tip-term). Для определения тактильной чувствительности применяли стандартный монофиламент для обследования нижних конечностей, создающий на коже давление в 10 г. Для исследования болевой чувствительности использовалась «английская» булавка, для распознавания пациентом прикосновения острого и тупого предмета.

Для исследования ахилловых и коленных рефлексов использовался неврологический молоточек, с оценкой их, как нормальные, ослабленные, отсутствующие.

Ультразвуковая допплерография (УЗДГ) проводилась на аппарате HITACHI фирмы EUB. Степень нарушения гемодинамики сохранившейся конечности определялась по величине плече-лодыжечного индекса (ПЛИ). ПЛИ вычисляли как отношение величины систолического давления в артерии нижней конечности к величине систолического давления в плечевой артерии.

Всем больным проводилась рентгенографическое исследование стоп и голеностопных суставов в двух проекциях.

Методы лечения и критерии оценки их эффективности.

Всем пациентам проводилась инсулинотерапия под контролем показателей гликемии, антибактериальная терапия.

У пациентов, имеющих язвенные дефекты с грубыми гиперкератозными краями, проводилось очищение раны механическим путем при помощи скальпеля, затем язвенный дефект промывали жидким антисептиком (0,5% раствором диоксидина, 0,01% раствором мирамистина, либо раствором хлоргексидина). После обработки язвенного дефекта на рану накладывали атравматическую повязку. Так как наблюдаемые нами пациенты находились в первой стадии раневого процесса, у пациентов группы сравнения (группы 2) использовали перевязки с водорастворимыми мазями (левомиколь либо диоксиколь). Пациентам исследуемой группы (группы 1) выполняли перевязки с Суперлимфом, с новым иммуномодулятором разработанным на кафедре иммунологии РГМУ (регистрационный № 000516/01 - 2001), который представляет собой стандартизированный комплекс цитокинов, среди которых определена активность ИЛ - 1, 2, 6, фактора некроза опухоли-б (ФНО-б), фактора, ингибирующего миграцию фагоцитов (МИФ), ТФР-в.

В нашем исследовании мы использовали лиофилизированный порошок Суперлимфа: 1 ампулу сухого вещества препарата разводили в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора и применяли локально на рану в виде аппликаций 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Критериями оценки эффективности терапии служили клинические (динамика субъективной и неврологической симптоматики, эрадикация возбудителей из очага воспаления, динамика раневого процесса и локального статуса, сроки пребывания в стационаре), лабораторные (изменения в формуле периферической крови, ЛИИ, изменения в биохимических показателях) и иммунологические показатели (уровни цитокинов). Оценка эффективности лечения осуществлялась сразу после лечения.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием статистического пакета программы Statistica vers. 6 и электронных таблиц MS EXCEL версия 2003 с применением стандартных параметрических методов вариационной статистики. Статистические данные приведены как средняя арифметическая М±д, где д - среднеквадратичное отклонение. В случае нормального распределения признака о достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента t. При невыполнении условия нормальности распределения признака применяли непараметрические критерии Уилкоксона (для сравнения признака до и после лечения), Манна-Уитни (для сравнения признака между группами) и критерий Спирмена (r) (для расчета коэффициента корреляции). Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности «2х2» с использованием критерия ч² (хи - квадрат); если ожидаемая частота признака составляла меньше 5, применялся точный двухсторонний критерий Фишера. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты клинического и лабораторно-инструментального обследования.

У всех больных до проведения лечебных мероприятий выявлялись следующие жалобы: боли в стопах (97%), слабость в ногах и утомляемость (94%), парестезии(98%), судороги в икроножных мышцах (87%). При оценке клинических симптомов по Шкале Неврологических симптомов (NSS) подавляющее большинство пациентов (76,4%) имели тяжелую степень нейропатии (7-9 баллов). Анализ выраженности объективных проявлений диабетической нейропатии по шкале NDS показал, что значительное число пациентов 63 (87,5%) имели выраженную нейропатию, что подтверждает наличие у всех наблюдаемых нами пациентов язвенных дефектов стоп.

У всех больных до проведенных лечебных мероприятий отмечены изменения клинико-лабораторных данных (табл.2).

Табл.2 . Клинико-лабораторные показатели, лейкоцитарная формула и ЛИИ.

Показатель	1 группа(n=38)	2группа(n=34)
Температура (єС)	37,3±0,5	37,2±0,4*
Пульс (уд/мин)	83,3±5,9	83,1±5,1*
Лейкоциты (тыс.)	10,4±1,6	10,9±1,3*
Нейтрофилы (%)	69,5±4,1	70,6±3,4*
ЛИИ	4,2±0,4	4,1±0,4*
СОЭ (мм/час)	35,1±7,2	38±9,5*

* р>0,05 - при сравнении признака 1 и 2 группы.

Все пациенты наблюдаемых групп с сахарным диабетом находились в стадии декомпенсации, о чем свидетельствуют значительные увеличения глюкозы крови натощак (10,8±1,1 ммоль/л в 1 группе и 11,3±1,7 во 2 группе) и уровня гликированного гемоглобина (HbA1c) (10,5±1,4 % в 1 группе и 10,5±1,2 во 2 группе). Кроме того, у 52 (72,2%) больных при исследовании мочи определялась глюкозурия, у 11 (15,3%) больных была выявлена кетонурия.

У всех пациентов наблюдаемых групп было проведено бактериологическое исследование локальной микрофлоры гнойно-некротического очага. Данные о наиболее часто выявленных микроорганизмах представлены в таблице 3.

Табл.3. Микроорганизмы, выделенные из раневого отделяемого обследованных пациентов.

Название микроорганизма	Всего (n=72)
	абс.	%
Staphylococcus aureus	31	43
Staphylococcus epidermid.	25	34,7
Enterococcus durans	10	13,9
Enterococcus cloacae	6	8,3
Peptococcus spp	23	32
Pseudomonas aeruginosa	25	34,7
E. сoli	4	5,6

При рентгенологическом исследовании стоп и голеностопных суставов диффузный остеопороз был выявлен у 41 пациента (57%), очаговый остепороз - у 12 (16,7%), деформирующий остеоартроз у - 12 (16,7%), очаговая и краевая деструкция у - 18 (25%), у 7 пациентов (9,7%) костно-деструктивных изменений не выявлено.

Всем больным с целью получения информации о наличии стенотического поражения артерий нижних конечностей было произведено исследование ПЛИ. При нейро-ишемической форме СДС среднее значение ПЛИ составило 0,8±0,1, что совпадает с данными большинства авторов, указывающее на снижение ПЛИ до 0,8-0,7 при ишемическом повреждении артерий нижних конечностей. Мы не выявили ни одного пациента со значением ПЛИ менее 0,6, которое расценивалось бы как критическая ишемия и требовало бы хирургического вмешательства. При нейропатической форме СДС среднее значение ПЛИ составило 1,1±0,2, что также совпадает со значениями характерными для этой формы СДС (1,1-1,3). У 13 (19%) больных с нейропатичекой формой СДС ПЛИ находился в пределах нормы (ПЛИ=1).

УЗГД было произведено всем наблюдаемым нами пациентам. Изменения были выявлены у всех 47 (66%) пациентов, у которых была диагностирована нейро-ишемическая форма СДС и только у 7 (9,7%) больных с нейропатической формой СДС. У пациентов с нейропатической формой СДС было выявлено увеличение скорости ретроградного кровотока, что является характерным для данной формы СДС. У 25 (53%) человек с нейро-ишемической формой СДС было выявлено снижение средней скорости кровотока по магистральным сосудам нижних конечностей, у 32 (68%) больных выявили окклюзию периферических артерий различного калибра: на уровне a. femoralis у 2 ( 7,7 %) больных, на уровне a. poplitea у 19 (61 %), на уровне a. tibialis post. у 11 ( 31%). У 5 (7%) пациентов с нейропатической формой СДС также выявили стенозы артерий голени и стопы, практически не нарушающие магистральный кровоток.

Анализ содержания цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-в) в сыворотке крови и экссудате раневого отделяемого у больных с СДС.

В данной работе мы исследовали уровень содержания провоспалительного цитокина ИЛ-8 и противовоспалительного цитокина ТФР-в, так как именно этим цитокинам отводится особая роль в патогенезе и развитии хронических язвенных дефектов: ИЛ-8 обладает выраженными провоспалительными свойствами, основными биологическими эффектами, которого являются индукция хемотаксиса нейтрофилов, субпопуляций Т-лимфоцитов и базофилов, активация нейтрофилов к выбросу ферментов лизосом, «дыхательному взрыву» и дегрануляции, тем самым усиливая и пролонгируя воспалительный процесс; ТФР-в - цитокин с противовоспалительными свойствами, который подавляет активность естественных киллеров, снижает пролиферацию В- и Т-лимфоцитов и многих типов клеток, стимулирует репаративные процессы, способствуя заживлению раневого дефекта.

При исследовании уровня ИЛ-8 в сыворотке крови у 14 (20%) больных мы выявили крайне низкие его концентрации 5,2±0,5 пг/мл, у 58 (80%) больных значения ИЛ-8 в сыворотке вообще не определялись. При исследовании уровня ТФР-в в сыворотке крови у 46 (64%) больных мы выявили средние концентрации равные 475,5±43,5 пг/мл, в то же время у 26 (36%) больных, как и в случае с ИЛ-8, ТФР-в в сыворотке не определялся.

Средняя концентрация ИЛ-8 в экссудате раневого отделяемого у больных с СДС составила 2127,54±89,3 пг/мл, что более чем в 400 раз превышает концентрацию данного цитокина у этих же больных в сыворотке крови. Средняя концентрация ТФР-в в экссудате раневого отделяемого составила 1360,6± 566,5 пг/мл, что в 3 раза выше концентрации этого цитокина в сыворотке крови. Полученные данные подтверждают, что в экссудате раневого отделяемого трофической язвы при сахарном диабете индуцируется преимущественная выработка провоспалительного цитокина ИЛ-8, в то время как для противовоспалительного ТФР-в характерна более низкая продукция.

Таким образом, мы подтвердили данные о том, что во многих случаях определение местного цитокинового статуса биологических жидкостей (экссудат раневого отделяемого) является более информативным по сравнению с системным его определением в сыворотке крови. Вероятно, цитокины, как молекулы короткодистантного действия, при иммунном ответе практически не поступают в системный кровоток, а выделяются и реализуются непосредственно в очаге воспаления. В связи с этим, перспективным представляется изучение именно локального содержания цитокинов в тканях организма, где в меньшей степени сказывается влияние системных факторов регуляции иммунитета со стороны нервной и эндокринной систем. Известно, что во многих случаях определение цитокинов в биологических жидкостях более информативно по сравнению с его определением в сыворотке крови. В частности, при развитии локального воспалительного процесса, который мы наблюдаем в нашей работе, или при нарушении механизмов тканевой регенерации, когда отсутствуют выраженные изменения в системном иммунном ответе. В связи с этим, в дальнейшем в нашей работе мы исследовали и сравнивали уровни цитокинов только в экссудате раневого отделяемого из трофических язв.

При анализе данных по содержанию исследуемых цитокинов в экссудате раневого отделяемого не выявлено статистически достоверных различий уровней цитокинов при нейропатической и нейро-ишемической формах СДС (р>0,05). Данные о содержание цитокинов при различных формах СДС представлены в таблице 4 .

Табл.4. Уровни цитокинов и формы СДС.

	Нейропатическая форма	Нейро-ишемическая форма
ИЛ-8 (пг/мл)	2121,1±97,7	2085,5±90,4*
ТФР-в (пг/мл)	1486,5±656,9	1407,6,5±649,6*

*р>0,05 при сравнении признака при разных формах СДС.

Нейропатия и ангиопатия при СД способствуют нарушению трофики в тканях, что рано или поздно приводит к формированию язвенных дефектов. Однако, дальнейшее течение язвенного процесса, по-видимому, определяется не только формой СДС, а также состоянием иммунной системы. Изменения в иммунном статусе определяются наличием СД как такого и, следовательно, носят однонаправленный характер при разных формах СДС.

Установлена положительная корреляция между длительностью СД и исходным уровнем провоспалительного ИЛ-8 (r=0,84, р<0,05 в 1 группе (рис. 1), r=0,81 р<0,05 во 2 группе) и отрицательная корреляция между длительностью СД и исходным уровнем ТФР-в (r=-0,77, р<0,05 в 1 группе, r=-0,84 р<0,05 во 2 группе). Аналогичные корреляционные связи были выявлены между уровнями гликированного гемоглобина (НbA1c) и исследуемыми цитокинами: положительная корреляция между ИЛ-8 и НbA1c (r=0,44, р<0,05 в 1 группе, r=0,74 р<0,05 во 2 группе, отрицательная корреляция между ТФР-в и НbA1c (r=-0,38, р<0,05 в 1 группе, r=-0,76 р<0,05 во 2 группе).

Рис.1. Корреляционая связь между исходным уровнем ИЛ-8 (1 группы) и длительностью сахарного диабета.

Таким образом, чем больше длительность СД, а также чем выше уровень гликированного гемоглобина и тем самым выраженнее декомпенсация СД, тем более значительнее у пациентов изменения в иммунной системе, в частности, цитокинового дисбаланс - повышение провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов.

Также был проведен корреляционный анализ между уровнями исследуемых цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-в) и уровнями лейкоцитов, нейтрофилов, СОЭ и ЛИИ и выявлены следующие связи: у всех пациентов наблюдаемых групп до лечения выявлялась положительная связь между уровнем ИЛ-8 и ЛИИ (r=0,85, р<0,05 в 1 группе, r=0,78 р<0,05 во 2 группе), отрицательная связь между уровнем ТФР-в и количеством лейкоцитов и нейтрофилов выявлялась только у пациентов группы 1 (r =-0,78, р<0,05; r =-0,46, р<0,05 соответственно). Связи между уровнями цитокинов и уровнем СОЭ до лечения выявлено не было.

Оценка эффективности Суперлимфа у больных с СДС при СД 2 типа.

Критериями оценки эффективности терапии служили клинические и лабораторные и иммунологические показатели, которые оценивали до и сразу после проведенного лечения.

Коррекция показателей углеводного обмена явилась одной из основных задач проводимой в обеих клинических группах терапии. Назначенная адекватная инсулинотерапия позволила достоверно (p<0,01) снизить уровень гликированного гемоглобина и глюкозы крови натощак обеих клинических группах, глюкоза крови после еды во 2 группе снизилась не достоверно. Сравнивая эти показатели после лечения, мы выявили, что в 1 группе эти показатели достоверно больше снижались, чем во 2 группе. Чтобы исключить положительное влияние компенсации СД на динамику лечения пациентов группы 1 и равноценно сравнивать эффективность проведенной терапии в обеих наблюдаемых группах, не зависимо от показателей углеводного обмена, мы выбрали из 1 группы пациентов, у которых после лечения показатели углеводного обмена не отличались от соответствующих значений пациентов группы 2. Именно у этих пациентов 1 группы мы оценивали клинические, лабораторные и иммунологические показатели в динамике. Таких пациентов в группе 1 оказалось 27. Данные об изменении углеводного обмена до и после лечения представлены в таблице 5.

Таблица 5. Динамика углеводного обмена у сравниваемых групп пациентов.

Показатель	1 группа (n=27)	2 группа (n=34)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Глюкоза крови натощак (ммоль/л)	11,0+1,8	9,8+0,5** #	11,3+1,7	10,1+1,2 *
Глюкоза крови после еды (ммоль/л)	13,8±1,1	10,9±0,7**	13,2±1,9	12,2±1,4"
НbА1С (%)	10,9±1,7	9,6±1 ** #	10,5±1,2	9,7±0,9 **

*р<0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 2 группы. ** р<0,01 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

" р>0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 2 группы.

# р>0,05 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

Динамика субъективной и объективной симптоматики у больных с СДС.

В результате проведенного лечения большинство больных групп 1 и 2 отмечали улучшение самочувствия - уменьшение и исчезновение боли в области язвенного дефекта, исчезновение парестезий, снижение частоты судорог мышц, увеличение выносливости при ходьбе. Достоверных различий в динамике субъективной симптоматики у групп 1 и 2 нами выявлено не было.

При сравнении времени купирования болевого синдрома, нормализации температуры тела и купирования острых явлений в группе пациентов, у которых применялся суперлимф эти показатели достоверно (р<0,01) быстрее купировались, чем в группе сравнения (табл.6)

Табл.6. Динамика купирования острых проявлений у больных СДС в днях.

Клинические показатели	1 группа (n=27)	2 группа (n=34)
Купирование болевого синдрома	4,4±1,0	5,2±0,9*
Нормализация t тела	4,3± 0,8	5,0±0,9*
Купирование острых проявлений воспаления	8,8±1	9,9±1,3*

* р<0,01 при сравнении признака 1 и 2 группы.

Анализ неврологического статуса у групп пациентов после лечения.

Сразу после курса лечения мы исследовали неврологический статус обеих клинических групп: рефлексы (ахиллов и коленный) и чувствительность (тактильную, болевую, температурную, вибрационную). Полученные результаты исследования представлены в таблице 7.

Таблица 7. Неврологический статус у пациентов наблюдаемых групп до и после лечения (среднее по двум ногам).

Неврологический статус	1 группа (n=27)	2 группа (n=34)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Рефлексы (баллы)	6,0±1,5	4,4±1,4*#	5,7±1,9	4,3±1,5*
Болевая чувствительность (баллы)	3,3+0,8	1,7+0,7*##	3,2+0,9	2,9+0,8*
Тактильная чувствительность (баллы)	3,4+0,8	2,4+0,8*#	2,9+1,2	2,1+1,1*
Порог вибрационной чувствительности на 1 пальце (УЕ)	2,5+1,1	3,8+1,0*##	2,4+1,2	2,8+1,1*
Температурная чувствительность (баллы)	4,7+0,6	3,4+0,8*#	4,4+0,7	3,4+0,9*

УЕ - условные единицы вибрации по камертону.

* р<0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

# р>0,05 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

## р<0,01 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

Как видно из таблицы 27 при исследовании неврологического статуса в динамике отмечено достоверное (р<0,05) улучшение практически всех рефлексов и видов чувствительности у пациентов обеих клинических групп. Однако, после лечения показатели болевой чувствительности снизились, а вибрационной чувствительности повысились у пациентов 1 группы достоверно (p<0,01) больше, чем у пациентов 2 группы. Причем, следует отметить, что порог вибрационной чувствительности (ПВЧ) до лечения в обеих группах был ниже возрастной нормы (нижняя граница нормы 60-70 лет 4,0 УЕ), а после лечения в группе 1 ПВЧ приблизился к норме данной возрастной группы - 3,8±1,0 УЕ, в тоже время в группе 2 показатель вибрационной чувствительности остался ниже нормы - 2,8±1,1 УЕ.

Результаты физикального исследования стоп после лечения.

Изменения стоп, такие как сухость и атрофия кожи, гиперкератоз, деформация стопы и пальцев стоп, утолщение ногтевых пластинок, которые выявлялись при внешнем осмотре стоп, сохранились и после проведенной терапии у большинства пациентов наблюдаемых групп, так как являются стойкими и необратимыми изменениями. Отек стоп у пациентов 1 и 2 групп уменьшился достоверно (р<0,05). Однако, в 1 группе, наблюдавшийся в 11 (40%) случаях отек стоп исчез полностью, в то время как в группе 2 наблюдавшийся до лечения отек у 15 (44%) пациентов сохранился после лечения у 8 (23,5 %) больных (р<0,01).

Анализ клинико-лабораторных данных после проведенной терапии.

При анализе клинических и лабораторных признаков интоксикации в обеих клинических группах после лечения были выявлены достоверные (p<0,05) различия в уровне лейкоцитов, палочкоядерных нейтрофилов, СОЭ и ЛИИ (табл.8)

Таблица 8. Показатели лейкоцитарной формулы и ЛИИ

Показатель	1 группа (n=27)	2 группа (n=34)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Температура (єС)	37,1±0,6	36,6±0,2*"	37,2±0,4	36,8±0,2*
Пульс (уд/мин)	82,8±5,2	73,4±5,5*"	83,1±5,1	75±5,3*
Лейкоциты (тыс.)	11,0±1,3	7,8±0,9*##	10,9±1,3	9,6±0,7**
Нейтрофилы (%)	70,5±3,6	61,3±2,5*#	70,6±3,4	65±3,1*
ЛИИ	4,2±0,3	1,9±0,3*##	4,1±0,4	2,6±0,5**
СОЭ (мм/час)	36,7±5,2	11,5±2,3*"	38±9,5	18±3,7*

* р<0,01- при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

** р<0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

" р>0,05 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

# р<0,01 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

## р<0,05 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

В 1 группе произошла нормализация всех параметров, в группе 2 не произошла нормализация уровня лейкоцитов, ЛИИ и СОЭ. Локальная цитокинотерапия привела к снижению общего уровня интоксикации.

Анализ микробной флоры на фоне терапии.

После проведенной терапии, по данным бактериологического исследования эрадикации возбудителей удалось добиться у 22 (81,5%) больных, получавших Суперлимф и у 18 (53%) пациентов группы сравнения. Данные о составе микрофлоры экссудата раневого отделяемого до и после лечения у наблюдаемых групп представленные в таблице 9.

Таблица 9. Результаты бактериологических исследований в обеих клинических группах до и после лечения.

Показатель	1 группа (n=27)	2 группа (n=34)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Staphylococcus aureus	13(48%)	1 (3,7%)** #	14(41%)	4(11,7%)**
Staphylococcusepiderm.	11(40,7%)	2(7,4%)* #	11(32%)	4(11,7%)*
Enterococcus durans	5(18,5%)	1 (3,7%)" #	4(11,7%)	2(5,9%)"
Enterococcus cloacae	2(7,4%)	0" #	3(8,8%)	0"
Peptococcus spp	5(18,5%)	0* #	13(38%)	2(5,9%)**
Pseudomonas aerugin.	8(30%)	1(3,7%)* #	13(38%)	4 (11,7%)*
E. сoli	1 (3,7%)	0 " #	2(5,8%)	0"

* р<0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

** р<0,01 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

" р>0,05 - при сравнении признака до и после лечения у 1 (2) группы.

# р>0,05 - при сравнении признака 1 и 2 групп после лечения.

Как следует из приведенных в таблице данных, при исследовании посева из язвенных дефектов после проведенной терапии, в исследуемой группе выделено 4 вида микроорганизмов у 5 (18,5%) пациентов против 5 микроорганизмов у 16 (47%) больных в группе сравнения. Однако, достоверных различий по количественному значению каждого из выявленных микроорганизмов после лечения в группе 1 и 2 мы не наблюдали.

При анализе рентгенологического исследования стоп и УЗДГ артерий нижних конечностей, мы не выявили изменений в показателях данных исследований после курса проведенного лечения ни в одной из клинических групп, из чего следует, что Суперлимф, являясь иммуномодулятором, не оказывает влияние на ремоделирование костных структур и на стенотические изменения артерий нижних конечностей при нейро-ишемической форме СДС.

Влияние Суперлимфа на раневой процесс.

Всем пациентам наблюдаемых групп до и после лечения мы проводили планиметрию раны и исследовали локальный статус (STATUS LOCALIS): площадь раны, глубину язвенного дефекта.

Площадь раны и глубина язвенного дефекта после лечения были достоверно (p<0,05) меньшими у пациентов 1 группы (рис. 2 и 3).

Рис. 2. Динамика изменения площади раны.

Рис.3. Динамика изменения глубины язвенного дефекта.

Для анализа эффективности локальной цитокинотерапии Суперлимфом мы изучали динамику раневого процесса у наблюдаемых нами пациентов до и после курса терапии. У пациентов группы сравнения заживление раневого процесса происходило медленнее по сравнению с исследуемой группой (табл.10).

Табл.10. Динамика раневого процесса наблюдаемых больных.

Критерии раневого процесса	1 группа (n=27) (дни)	2 группа (n=34) (дни)
Исчезновение отека	7,5±1,6	9,8±2**
Исчезновение гиперемии	9,1±1,5	11,3±1,9*
Сроки очищения от некротических масс	5,9±1,5	8,0±1,5*
Появление активной грануляции	6,0±1	9,2±1,5*
Эпителизация раны на 50%	10,9±1,6	12,6±1,7**
Средние сроки лечения	20,5±1,5	26,2±3*

* р<0,01 - при сравнении признака 1 и 2 группы.

** р<0,05 - при сравнении признака 1 и 2 группы

Из приведенных в таблице 32 данных видно, что динамика течения раневого процесса в 1 группе происходила интенсивнее. По всей видимости, под влиянием экзогенных цитокинов, входящих в состав Суперлимфа, происходит изменение собственного цитокинового фона тканей, запускается локальный цитокиновый каскад с последующим усилением пролиферации Т- и В- лимфоцитов, их миграцией из лимфатической системы в кровь и в очаг воспаления, а также активацией миграции и закреплением в очаге воспаления макрофагов и повышением их фагоцитарной активности. Комплекс цитокинов, входящих в Суперлимф стимулирует синтез коллагена, пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток, нервных образований. Все вышесказанное обуславливает локальный и менее выраженный характер воспалительной реакции. Для соединения цитокинов, находящихся в составе Суперлимфа, с рецепторами клеток-мишеней достаточно 8-10 минут, таким образом, цитокины и факторы роста препарата не успевают инактивироваться протеинкиназами экссудата раневого отделяемого. Все перечисленные свойства Суперлимфа и позволили нам добиться более быстрой положительной динамики раневого процесса.

Оценка уровней цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-в) у больных с СДС после лечения.

Данные об уровнях ИЛ-8 и ТФР-в в экссудате раневого отделяемого до и после лечения представлены на рис.4 и 5.

Рис.4 . Концентрация ИЛ-8 в раневом отделяемом больных с СДС.

Рис.5. Концентрация ТФР-в в раневом отделяемом больных с СДС.

Как видно из представленных рисунков в группе больных, получавших Суперлимф, произошло достоверное снижение провоспалительного цитокина ИЛ-8 и достоверное повышение противовоспалительного цитокина ТФР-в.

По данным проведенного корреляционного анализа по коэффициенту Спирмена в 1группе выявлена отрицательная корреляционной зависимость (r =-0,81, р<0,05) между уровнями ИЛ-8 и ТФР-в после лечения (Рис.6). В группе сравнения не было обнаружено данной корреляционной зависимости.

Рис.6. Корреляционная связь между уровнями исследуемых цитокинов после проведенного лечения (1 группа).

При выявлении корреляционных связей между уровня исследуемых цитокинов и уровнями лейкоцитов, нейтрофилов, СОЭ, ЛИИ после проведенного лечения корреляционные связи были выявлены только у пациентов 1 группы. Выявлена положительная связь между уровнем ИЛ-8 и ЛИИ: r=0,8, р<0,05. А также выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем ТФР-в и уровнями лейкоцитов, нейтрофилов и СОЭ: r=-0,76, р<0,05 и r=-0,47, р<0,05 и r=-0,83 р<0,05 соответственно.

Оценка эффективности лечения больных с СДС по результатам полученных данных.

При оценке эффективности лечения мы отмечали хороший результат, удовлетворительный и неудовлетворительный результаты. Данные по оценке эффективности лечения в наблюдаемых группах представлены на рис.7.

Рис.7. Оценка эффективности лечения разных группах больных.

При традиционном методе лечения больных с СДС хорошего результата лечения удается достичь только у 38,2% больных, в то время, как при применении Суперлимфа такой эффект можно получить у 71 % больных. При использовании Суперлимфа удалось сократить в 2,3 раза количество больных с неудовлетворительным результатом лечения по сравнению с традиционным лечением.

ВЫВОДЫ

1. У больных сахарным диабетом с СДС изменения локального цитокинового статуса в экссудате раневого отделяемого представлены в виде повышения провоспалительного цитокина ИЛ-8 и снижения противовоспалительного цитокина ТФР-в. Установлены положительные корреляционные связи между длительностью СД, уровнем гликированного гемоглобина (НbA1c) и исходным уровнем ИЛ-8 и отрицательные корреляции между длительностью СД, НbA1c и исходным уровнем ТФР-в

2. Анализ данных по содержанию исследуемых цитокинов в экссудате раневого отделяемого не выявлено статистически достоверных различий уровней цитокинов при нейропатической и нейро-ишемической формах СДС.

3. Топическая терапия Суперлимфом способствует повышению уровня противовоспалительных (ТФР-в) и снижению уровня провоспалительных (ИЛ-8) цитокинов в экссудате раневого отделяемого больных с СДС. В связи с чем, после лечения в группе пациентов получавших Суперлимф выявлена отрицательная корреляционная зависимость между уровнями ИЛ-8 и ТФР-в.

4. Локальная терапия Суперлимфом способствует более быстрой нормализации параметров интоксикации, интенсивной положительной динамике раневого процесса, сокращает сроки пребывания в стационаре в среднем с 26 до 20 дней, способствует эрадикации бактериальной флоры из очага воспаления, является особенно эффективным в отношении Staphylococcus aureus.

5.Коррекция цитокинового статуса (повышение ТФР-в и снижение ИЛ-8) Суперлимфом способствует более эффективному заживлению язвенных дефектов стоп у больных СД.

Практические рекомендации

1. В комплексное обследование больных с различными формами СДС при СД 2 типа необходимо включать исследования уровня провоспалительных (ИЛ-8) и противовоспалительных (ТФР-в) цитокинов, играющих особую роль в патогенезе и развитии язвенных дефектов стоп.

2. Определение уровня цитокинов в сыворотке малоинформативно. Наиболее достоверное определение нарушения цитокинового баланса должно осуществляться на локальном уровне (экссудат раневого отделяемого из трофической язвы).

3. В комплексное лечение больных с СДС, при наличии цитокинового дисбаланса, рекомендовано включить местные аппликации с раствором иммуномодулятора Суперлимф по схеме: 1 ампулу, содержащую 100 мкг сухого вещества препарата, разводили в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора и применяли локально на рану в виде аппликаций 1 раз в сутки течение 7 дней.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потемкин В.В., Ковальчук Л.В., Бакотина А.Е. Синдром диабетической стопы: иммунопатогенез и подходы к иммунокоррекции. // Российский медицинский журнал. - 2007. - №5 - с.51-55.

2. Бакотина А.Е., Балдина Т.Н., Потемкин В.В., Ковальчук Л.В. Дисбаланс цитокинов при синдроме диабетической стопы: лечебная эффективность Суперлимфа. // Сборник материалов. VII Всероссийский конгресс иммунологов и аллергологов. - М., 2007 - с.128.

3. Потемкин В.В., Ковальчук Л.В., Бакотина А.Е. Системное и локальное определение цитокинов и топическая иммунокоррекция Суперлимфом у больных с синдромом диабетической стопы. // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2008. - №5 - с. 9-11.

4. Потемкин В.В., Ковальчук Л.В., Бакотина А.Е., Томилова Е.Н. Иммуномодулирующий препарат Суперлимф в комплексной терапии синдрома диабетической стопы. // Материалы Международного симпозиума «Синдром диабетической стопы», 3-5 октября 2008, с.94.

5. Ковальчук Л.В., Потемкин В.В., Бакотина А.Е., Троицкая С.Ю. Сравнительная оценка уровня цитокинов в раневом отделяемом у больных с разными формами синдрома диабетической стопы.// Материалы Международного симпозиума «Синдром диабетической стопы», 3-5 октября 2008, с.95.