Влияние лекарств-мутагенов на частоту появления резистентных к флуконазолу штаммов у дрожжей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние лекарств-мутагенов на частоту появления резистентных к флуконазолу штаммов у дрожжей

Мазанко М.С.

Празднова Е.В.

Чурилов М.Н.

Длительное и бесконтрольное применение антибиотиков в медицине, промышленности и сельском хозяйстве привело к появлению большого количества резистентных штаммов патогенных микроорганизмов: как бактерий, так и грибов. В литературе широко описаны мультирезистентные штаммы микроорганизмов и последствия, которые они вызывают, однако резистентность патогенных грибов представляет собой не меньшую проблему, чем резистентность патогенных бактерий.

Одним из решений проблемы устойчивости организмов к антибиотикам является контроль за возникновением новых резистентных штаммов.

Некоторые используемые в медицине лекарственные препараты обладают мутагенными свойствами. Как было показано в наших предшествующих работах, подобные препараты способны усиливать экспрессию бактериальных оперонов SOS-системы (Prazdnova и др., 2015), увеличивая уровень мутаций резистентности к антибиотикам (Чурилов и др., 2015). Целью данной работы было изучение влияния лекарств-мутагенов на частоту возникновения штаммов, устойчивых к антимикробным препаратам.

В качестве модельного организма был использован гаплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae W303. В качестве лекарств-мутагенов были выбраны препараты, вызывавшие в наших предыдущих исследованиях ответ бактериальных оперонов SOS-системы репарации, а именно: антимикробные препараты диоксидин (предполагаемый механизм действия: активация свободнорадикальных процессов в клетке (Дурнев и д.р., 1989)) в концентрации 5000 мкг/мл и фурацилин (механизм действия: восстановление нитрогрупп молекулы за счет ферментных систем и ДНК клетки (Коноваленко и др., 2005)) в концентрации 50 мкг/мл, а также противораковый препарат цисплатин (интеркалирующий агент, вызывает формирование внутрицепочечных аддуктов в ДНК (Novak et al., 2015)) в концентрации 50 мкг/мл. В качестве положительного контроля был использован N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG, алкилирующий агент, приводит к точковым мутациям в ДНК: транзициям GC-AT) в концентрации 147 мкг/мл. Подобный разброс в концентрациях был нужен для достижения сходных показателей выживаемости клеток.

Дрожжи инкубировали двое суток в жидкой среде YPD с добавлением вышеперечисленных индукторов мутагенеза, на шейкере при температуре 25°С. После инкубации дрожжи высевали на твердую YPD (AYPD), содержащую 64 мкг/мл флуконазола. Согласно протоколу M-44P NCCLS дрожжи, растущие на такой концентрации флуконазола, следует считать устойчивыми к данному препарату (Balows, 2010).

Частота спонтанного мутагенеза у данного штамма составила 3*10^-3, что является достаточно высоким показателем для дрожжевых клеток. Столь высокий уровень образования устойчивости к флуконазолу может быть связан с тем фактом, что мишенью данного антигрибкового препарата является фермент ланостерол-14-б-деметилаза, и даже небольшие изменения в строении этого фермента, не снижающие жизнеспособности клеток, приводят к образованию устойчивых форм.

Выживаемость во всех исследованных случаях составляла 20-25%. Для диоксидина она составила 18%, фурацилина - 22,2%, цисплатина - 25,3%. Только в случае положительного контроля выживаемость была ниже и составила 12,5%.

Положительный контроль (MNNG) представляет собой сильный мутаген, и в использованной концентрации приводил к увеличению уровня мутагенеза в четыре раза - до 1,2*10^-2 клеток.

Присутствие в среде фурацилина увеличивало частоту образования штаммов, резистентных к флуконазолу, более, чем в два раза: до 7*10^-3 клеток. Влияние цисплатина так же увеличивало частоту образования устойчивых штаммов: до 7,1*10^-3. Однако эти значения были ниже, чем полученные при внесении в среду MNNG. Диоксидин увеличивал частоту мутаций устойчивости к флуконазолу в шесть раз - до 1,8*10^-2 клеток, что превысило значение, полученное при внесении положительного контроля. Это объясняется как значительной мутагенной активностью препарата (Сычева и др., 2004), так и высокой его концентрацией в среде.

Из представленных данных следует, что лекарства-мутагены способны увеличивать частоту мутаций клеток грибов, приводящих к появлению штаммов, резистентных к флуконазолу. Это может привести к тому, что лечение заболеваний, не связанных с патогенными и условно-патогенными грибами (например, онкологических или бактериального генеза) способно индуцировать возникновение устойчивых форм грибков и затруднить последующее лечение грибковых заболеваний человека.

Литература

мутагенный дрожжи штамм флуконазол

1. Balows A. Manual Of Clinical Microbiology. (10th edn) / Philadelphia: Churchill Livingstone - 2000. - 143 p.

2. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М. и др. Изучение мутагенного действия диоксидина полиорганным микроядерным методом // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2004. - Т. 138. № 8. - С. 188-190.

3. Prazdnova E.V., Chistyakov V.A., Mazanko M.S., Chmyhalo V.K., Churilov M.N. Determination of the specificity of ROS generation by the action of platinum-based drugs in SOS-lux test // Proceedings of the III International Sciences Congress “Problems and Prospects of Research in the Americas and Eurasia” (Buenos Aires, Argentina, 3-5 December 2014) . Buenos Aires, 2015. - P. 256-262.

4. Чурилов М.Н., Мазанко М.С., Празднова Е.В. Накопление мутаций антибиотикоустойчивости под действием лекарств-мутагенов // Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов: сборник докладов IX международной научной конференции аспирантов и студентов / ДонНТУ, ДонНУ - Донецк: ГУВЗ “ДонНТУ”, 2015. - С. 405-407.

5. Дурнев А.Д., Дубовская, О.Ю., Нигарова, Э.А., Середенин, С.Б. Роль свободных радикалов кислорода в механизме мутагенного действия диоксидина // Хим.-фарм. журн. - 1989. - Т. 23. № 11 - С. 89-91.

6. Коноваленко А.Б., Новиков О.О. Аналитическая характеристика лекарственных соединений группы 5-нитрофурана // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармакология. - 2005. - № 1 (21), вып. 4. - С. 13-19.

7. Novak M, Ћegura B, Baebler Љ, Љtern A, Rotter A, Stare K, Filipiи M. Influence of selected anti-cancer drugs on the induction of DNA double-strand breaks and changes in gene expression in human hepatoma HepG2 cells // Environ Sci Pollut Res Int. - 2015 Sep 22. - pp 1-11.

Размещено на Allbest.ru