Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Центральные холинергические механизмы регуляции половой функции (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

14.00.40 - урология

доктора медицинских наук

Байрамов Алекбер Азизович

Санкт-Петербург, 2008

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (академическая группа академика РАМН Ф.Г.Углова)

Научные консультанты:

З.д.н. РФ, член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук профессор Сапронов Николай Сергеевич

доктор медицинских наук профессор Комяков Борис Кириллович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Дьячук Георгий Иванович

доктор медицинских наук профессор Крауз Владислав Алексеевич

доктор медицинских наук профессор Новиков Андрей Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П.Павлова»

Защита состоится «__» «________» 2008 года в 13.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Богомолов Борис Николаевич

нейрохимический регуляция пубертатный холинергический

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Половая функция является важнейшим компонентом репродуктивной системы организма. В развитых странах мира частота половых расстройств у мужчин неуклонно повышается, что определяет актуальность изучения механизмов нормальной и измененной половой функции (ВОЗ, 2004). Большинство исследований механизмов регуляции мужской половой функции сосредоточено на его завершающей фазе (коитус), тогда как начальная, мотивационная фаза, регулируемая центральными механизмами, остается малоизученной (Pfaus et al., 2001, 2003; Agmo et al., 2004, Амстиславская Т.Г., 2002, 2006). Поскольку именно с активации определенных структур мозга запускается половая функция самцов, исследование мотивационного обеспечения адекватного полового поведения является актуальной современной задачей.

Половая функция является сложной интегративной функцией организма и координируется на разных уровнях с вовлечением нейрональных структур, нейромедиаторных и нейроэндокринных систем. Механизмы, регулирующие половую функцию, в значительной степени обеспечиваются нейрональными структурами, которые локализованы в преоптической зоне гипоталамуса. Они активируются различными нейромедиаторными системами (Bitran, 1987; Dorner, 1989; Gladkova, 2000). Холинергическая активация преоптической области, по мнению многих исследователей, является критической для нормального коитуса, а введение М-холиноблокатора скополамина в эту область задерживает инициирование копуляции (Hull, 1988; Retana, 1993). Несмотря на большое число исследований, посвященных роли нейромедиаторных систем в обеспечении половой функции, в литературе очень мало сведений об участии холинергической системы мозга в центральных механизмах регуляции мужской половой функции во взаимосвязи с функциональным состоянием нейроэндокринных систем. Также не исследована роль холинергических механизмов в реализации половой функции при различных видах стресса. Известно, что репродуктивная функция организма подвержена модификации различными факторами, в частности, стрессорным воздействием. В основе таких модификаций лежат нарушения центральных регуляторных механизмов, играющих ключевую роль в возникновении половой мотивации, от которой, в конечном счёте, зависит реализация половой функции.

Нормальная экспрессия мужской половой функции во взрослом состоянии зависит от функциональной целостности нейрональных цепей и нейромедиатор-ных систем, вовлеченных в этот процесс в течение раннего развития мозга в пренатальном периоде. Особое значение приобретают неблагоприятные воздей-ствия в период раннего онтогенеза, когда развитие функциональных систем про-текает наиболее быстрыми темпами и может быть легко изменено или модифи-цировано внешними воздействиями (Cabrera et al., 1999; Gerardin et al., 2005). Неблагоприятное воздействие многих химических факторов (никотин, барбиту-раты и др.) на развивающийся мозг опосредовано изменением активности холин-ергической системы с последующим проявлением когнитивно-поведенческих дефицитов у взрослых потомств (Slotkin, 1992, 2004; Avital Beer, 2005). Несмотря на эти факты, в литературе отсутствуют сведения о нейрохимических и поведен-ческих эффектах пренатального воздействия селективных агонистов и антагонис-тов М- и Н-холинорецепторов, а также их влияние на динамику развития нейро-медиаторных систем мозга на этапах онтогенеза и на половую функцию у взрослых потомств. Изменение активности холинергических механизмов головного мозга в критические сроки пренатального развития может оказать воздействие на целостность формирования медиаторных систем мозга, дифференцирующего эффекта гонадных гормонов на развивающийся мозг, и тем самым, на проявления половой активности и адекватного полу сексуального пове-дения у взрослых потомств. Актуальность исследования пренатальных эффектов холинергических факторов на центральные механизмы полового поведения и гор-мональный статус при половом развитии обусловлена необходимостью профи-лактики и лечения последующих половых дисфункций и аномального полового поведения.

Важную роль в механизмах формирования половой функции, в особенности ее аппетентных или мотивационных аспектов играет взаимодействие нейромедиа-торных систем мозга, интегрирующее моторные, вегетативные и эндокринные компоненты половой функции. Ацетилхолин является медиатором, опосредую-щим передачу неспецифической информации к неокортексу из подкорковых структур (ретикулярная формация, гипоталамус) и участвует в функционировании корковой активирующей системы (Krnjevic, 1967; Кожечкин С.Н., 1982). Не-смотря на широкую роль холинергической системы в различных аспектах дея-тельности ЦНС (Аничков С.В., 1958, 1962; Голиков С.Н., 1956, 1965; Денисенко П.П., 1965; Сапронов Н.С. 1968; Лосев Н.А., 1968), очень мало исследовано её значение в формировании нейрофизиологических коррелятов биоэлектрической активности мозга в зависимости от эндокринного статуса организма, в изменении возбудимости и подвижности нервных процессов в структурах мозга при дис-балансе гонадных гормонов.

Таким образом, предпосылкой для проведения настоящего исследования яви-лась недостаточная изученность роли холинергической системы в регуляции по-ловой функции самцов. Для понимания механизмов холинергической регуляции необходимо исследование способности самцов реализовать половую функцию в условиях фармакологической модуляции активности центральных М- и Н-холи-норецепторов и других нейрохимических регулирующих механизмов в зависи-мости от эндокринного статуса и факторов внешней среды, действующих в разные периоды онтогенеза.

Цель исследования состояла в экспериментальном изучении роли холинергической системы в нейромедиаторных, эндокринных и нейрофизиологических механизмах регуляции половой функции самцов в разные периоды онтогенеза.

Задачи исследования:

1. На экспериментальной модели полового поведения самцов крыс изучить закономерности поведенческих изменений, обусловленных введением М- и Н-холинергических средств, в зависимости от гормонального статуса животных.

2. Исследовать нейрохимические и нейроэндокринные механизмы регуляции половой функции в условиях модуляции активности центральной холинергической системы.

3. Изучить особенности полового поведения гипогонадных самцов крыс после введения холинергических, дофаминергических средств и андрогенов.

4. Оценить влияние неблагоприятных факторов (стрессовое воздействие, введение холинергических веществ), действующих в разные периоды онтогенеза, на половую функцию и нейроэндокринный статус самцов крыс.

5. Исследовать нейрональные механизмы центральной холинергической регуляции в интегративной деятельности мозга по данным спонтанной и вызванной электрической активности некоторых структур головного мозга кроликов в условиях дефицита и избытка стероидных гонадных гормонов в организме.

6. Изучить участие М- и Н-холинергических механизмов в становлении полового поведения в пубертатном периоде онтогенетического развития потомства и в метаболизме основных нейромедиаторов в структурах мозга самцов крыс.

7. Изучить отдаленные поведенческие, нейрохимические и гормональные эффекты у потомства крыс, подвергнутого воздействию М- и Н-холинолитиков в пренатальном периоде.

Научная новизна. В работе впервые исследована роль холинергической системы в становлении половой функции самцов крыс в онтогенезе в зависимости от нейроэндокринного статуса. Доказано, что действие М- и Н-холинергических средств на половое поведение самцов зависит от гормонального статуса организма. В условиях индуцированного гормонального дефицита активация М-холинер-гической системы полностью восстанавливает нарушенную половую функцию самцов. Кроме того, показано, что в нейрохимических эффектах холинергических средств на половую функцию помимо прямой активации М-холинергических структур мозга важную роль играет активация дофаминергических механизмов лимбических образований мозга.

Влияние холинергических средств на половую активность самцов связано с изменением возбудимости нейрональных структур лимбической системы мозга, что наиболее ярко проявляется в условиях дефицита андрогенов. При этом актив-ность М-холинорецепторов играет важную роль для реализации эффектов поло-вых стероидов, их взаимодействия со стероидчувствительными ядрами головного мозга. Показано, что нарушение рецепции андрогенов при гонадэктомии вызыва-ет изменение характера действия холинергических средств на биоэлектрическую активность нейронных популяций центральных нервных структур и, тем самым, обусловливает дальнейшее изменение поведенческого ответа на внешний сексуальный стимул.

Выявлена высокая значимость активности холинергической медиаторной системы для стрессреактивности организма в тестах изучения полового поведения. Стресспротекторное свойство антихолинэстеразного препарата галантамина зависит от вида стресса; при этом наиболее значительный потенцирующий эффект от применения холинергических средств наблюдается при иммобилизационном стрессе с эмоциональным компонентом в сравнении со стрессом, обусловленным воздействием физического фактора. Показано, что механизм действия галантамина при стрессе, помимо прямой М-холинергической активации нейрональных структур мозга, включает также нейроэндокринную и дофаминергическую системы, участвующие в реализации половой функции.

Установлена высокая чувствительность медиаторных систем головного мозга эмбрионов к воздействию селективных антагонистов М- и Н-холинергической системы в пренатальном периоде, особенно в ранние сроки гестации. Вызванные ими нарушения сохраняются в ходе постнатального онтогенеза и проявляются при реализации поведенческих реакций, в частности, полового поведения у взрослых особей. Пренатальное воздействие Н-холинолитиком ганглероном и в меньшей степени М-холинолитиком метамизилом приводит к отдаленным поведенческим нарушениям, характеризуемым низкой половой активностью и структурными нарушениями половой функции у половозрелых потомств самцов.

Выявлено разное участие М- и Н-холинергических механизмов в эффектах холинергических средств на половую функцию самцов на этапах онтогенеза. Оно состоит в том, что половая активность взрослых самцов в пределах холинергичес-кой системы регулируется М-холинергическими механизмами, а в период прена-тального развития в большей степени зависит от активности Н-холинергической системы.

Доказано, что механизм нарушения половой функции у половозрелых потом-ств связан с дисбалансом содержания нейромедиаторов дофамина и серотонина в мозге плодов. Так, отдаленным последствием пренатального воздействия холино-литиков на организм беременной самки является снижение дофаминергической активности в лимбических структурах мозга плода в постнатальном периоде. Блокада Н-холинорецепторов ганглероном ингибирует выброс дофамина, нор-адреналина и серотонина. Медиаторная дисфункция у половозрелых самцов, как отдаленный эффект пренатального воздействия холинолитиков, предопределяет поведенческие нарушения и половую дисфункцию у потомства.

Научно-практическая значимость. Теоретическая значимость работы заключается в обосновании положения, что половая функция самцов в значительной степени определяется состоянием холинергической медиаторной системы мозга и уровнем андрогенов, регулирующих возбудимость нейрональных структур лимбической системы мозга. При индуцированном гормональном дефиците активация М-холинергической системы полностью восстанавливает нарушенную половую функцию самцов. Нейрофизиологические механизмы реализации половой функции у гипогонадных самцов связаны с активацией М-холинорецепторов, которые обусловливают высокоамплитудную возбудимость нейрональных структур и более длительную потенциацию этого возбуждения по сравнению с нормальным гормональным фоном. В процессе холинергической регуляции половой функции решающая роль принадлежит непосредственной активации М-холинергических механизмов мозга и опосредованной активации дофаминергической системы лимбических структур. В пренатальном периоде, особенно в ранние сроки гестации, существенную роль играет высокая чувствительность медиаторных систем головного мозга эмбрионов к воздействию селективных антагонистов М- и Н-холинергической системы, приводящих к отдаленным нарушениям половой функции у половозрелых потомств самцов. Важным практическим выводом работы является доказательство, что дефицит половой активности половозрелых потомств самцов может быть компенсирован с помощью агонистов дофамина и ацетилхолина. Полученные данные будут способствовать разработке новых методов лечения половых расстройств, в том числе и наследственно обусловленных и решению проблемы коррекции половых расстройств с целью гармонизации межполовых отношений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. М-холинергическая система мозга является важным звеном в центральной регуляции полового поведения самцов крыс, регулирует количественные и качественные параметры половой функции. Действие холинотропных средств на половую активность зависит от гормонального статуса организма, в частности, от уровня андрогенов.

2. Холинергические механизмы активации половой функции самцов взаимосвязаны с активностью дофаминергических механизмов лимбических структур мозга. При этом агонисты М-холинергической и дофаминергической медиаторных систем мозга активируют половую функцию посредством разных механизмов, часто усиливая эффекты друг друга. Усиление половой функции зависит от баланса нейромедиаторов дофамина, норадреналина, серотонина и уровня стероидов в мозге.

3. Холинергическая система головного мозга эмбрионов крыс уязвима для действия селективных М- и Н-холинолитиков. Их введение в период раннего он-тогенеза (пренатальный) вызывает дисбаланс в функционировании нейромедиа-торных систем (преимущественно дофаминергической) в лимбической системе мозга и подавление продукции тестостерона. Нарушение нейромедиаторного об-мена в пренатальном мозге самцов сохраняется в ходе постнатального онтогенеза и проявляется изменениями половой функции. Основной причиной пониженной половой активности у потомств самцов является низкая дофаминергическая активность и низкий уровень продукции тестостерона в организме.

4. Устойчивость к стрессу в тестах изучения полового поведения у самцов зависит от состояния холинергической и дофаминергической активности структур лимбической системы мозга и уровня тестостерона в крови. Действие холинергических средств на половую активность самцов крыс более выражено в условиях дефицита андрогенов (в гипогонадном состоянии).

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на 22-м ежегодном конгрессе по нейропсихофармакологии (Брюссель, Бельгия, 2000), на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2000), в 21-м региональном конгрессе по психонейроэндокринологии (С.-Петербург, 2001), на 23-м конгрессе международного общества психонейроэндокринологии (Пиза, Италия, 2003), на международной конференции «Нейрохимия. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на 8-м конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии (Москва, 2005), 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), на 4-м региональном конгрессе по психонейроэндокринологии «Стресс и психоэндокринные изменения в жизненном цикле» (Вильнюс, Литва, 2006), на международной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности ЦНС» (Пенза, 2006), VII международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2006), 1-й конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологов (Санкт-Петербург, 2008), 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Китай, Харбин, 2008).

Апробация диссертации состоялась в мае 2008 г. на совместном заседании академической группы академика РАМН Ф.Г.Углова при НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта, кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова и кафедры урологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова.

По теме диссертации опубликована 31 работа, из них 19 статей (10 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 3 подраздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 304 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель содержит 603 наименований, в том числе 74 отечественных и 539 иностранных.

Материалы и методы исследования

Опыты выполнены на 1609 половозрелых беспородных крысах и крысах линии Вистар массой 200-250 г и 47 кроликах породы Шиншилла массой 3,5-4 кг, полученных из питомника Рапполово РАМН, Ленинградская область. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище.

Экспериментальные модели. Использовали модель гипогонадных самцов крыс и кроликов с пониженным уровнем тестостерона. С этой целью проводили одно- и двухстороннюю гонадэктомию под эфирным наркозом. Тестирование оперированных самцов крыс на половую активность осуществляли через 3 недели, изучение нейрофизиологических параметров мозговой активности у гонад-эктомированных кроликов проводили через 1 месяц после операции. В тесте полового поведения использовали модель индуцированной рецептивности у самок (De Jonge et al., 1986; Albonetti et al., 1993). Проявление рецептивности у самок определяли непосредственно перед тестом по наличию лордозной реакции.

Стрессорные воздействия, примененные к взрослым животным. В качестве стрессора у крыс использовали ограничение подвижности животного разной продолжительности (1, 3 и 6 ч) в пластиковых отсеках с ограниченным объемом при ярком освещении. Иммобилизацию осуществляли либо непосредственно перед тестом полового поведения при остром опыте, либо за 4 ч до тестирования при 7-дневном хроническом стрессировании.

Холинергические воздействия в пренатальном периоде. Беременным самкам на 9-11, 12-14 и 17-19 сутки гестации производились троекратные внутримышечные инъекции (1 раз в день) Н-холиноблокатора ганглерона в дозе 10 мг/кг или М-холиноблокатора метамизила в дозе 2 мг/кг. Опытные группы формировались по срокам пренатального воздействия и по фармакологическим препаратам. Бере-менные самки интактных крыс являлись группой контроля, которым вводили в эти же сроки 0,9% физиологический раствор NaCl. Помёты родившихся крысят самцов редуцировали до 6-8 детенышей. Пометы из каждой группы смешивали и случайным образом делили на 3 части для нейрохимических, эндокринных исследований в 2-х месячном возрасте и поведенческих исследований в 3,5-4 месячном возрасте.

Тест «половое поведение». В эксперименте использовали половозрелых самцов крыс с приобретенным половым опытом, содержавшихся в комнате с реверсивным светом. Для определения компонентов полового поведения тестируемый самец помещался в испытательную камеру (размером 40х40х30 см) из прозрачного плексигласа за 5 мин до предъявления сексуально восприимчивой самки в темную фазу суточного цикла при тусклом красном освещении. Компо-ненты половой активности у самцов регистрировали визуально в течение 15 минут. Измеряли латентные периоды и число садок (ЛПС и САД соответственно) интромиссий (ЛПИ и ИМС) и эякуляций (ЛПЭ и ЭЯК), а также рассчитывали два вторичных параметра: период восстановления (ПВ) - время от первой эякуляции до следующей интромиссии и межэякуляторный интервал (МЭИ) - время между первой и второй эякуляторной сессиями.

Нейрохимические методы. Исследование обмена нейромедиаторов и их метаболитов в мозге выполняли на 20-суточных зародышах крыс и 2-месячных потомствах. В криостате (- 20⁰С) мозг зародыша отделялся от черепной коробки и мозжечка. У 2-месячных крыс (также в криостате), используя координаты по атласу Kцnig (1967), выделяли структуры гипоталамуса, гиппокампа, амигдалы, которые хранились в жидком азоте до хроматографического анализа.

Концентрацию дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (5-ГТ) и их метаболитов в структурах мозга определяли методом ВЭЖХ в системе Beckman System Gold с электрохимическим детектором LC-4C. Для хроматографического анализа использовали ткани целого мозга зародыша и структуры мозга у 2-месячных потомств, которые гомогенизировали в охлажденной 0,1Н хлорной кис-лоте, центрифугировали при 14000 g в течение 7 мин при 4^oC. Полученный супернатант фильтровали и вводили в систему ВЭЖХ-ЭД. Разделение пиков проходило в хроматографической колонке SphereClone 5м ODS 2 (250x4,60 mm) с предколонкой. Аналитическое время пробега пробы в колонке составляло 18 мин при изократической скорости 1,0 мл/мин. Подвижная фаза состояла из цитрат-фосфатного буфера (рН=3,5), ацетонитрила (88 мл/л) и октансульфоновой кислоты (0,18 ммоль/л). Идентификацию и чистоту хроматографических пиков, а также их количественную оценку осуществляли по отношению к пикам, полученным от внешних стандартов. Для оценки оборота ДА, НА и 5-ГТ в структурах мозга были рассчитаны отношения 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) к дофамину (ДОФУК/ДА), 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля (МГФГ) к норадреналину (МГФГ/НА) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты к серотонину (5-ГИУК/5-ГТ) от их измеренных концентраций.

Иммуноферментный метод определения гормонов. Уровень тестостерона, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов определяли в сыворотке крови с помощью гормональных тест-наборов для иммуноферментного ана-лиза (Хема-Медика, Access) согласно прилагаемой инструкции, с предварительной раститровкой всех наборов и подбором оптимального разведения сывороток крови.

Нейрофизиологические методы исследования. Для регистрации частотных ритмов ЭЭГ и вызванных потенциалов (ВП) с помощью стереотаксической установки в ядра головного мозга кроликов (n.basalis amygdalaris, hippocampus p.dorsalis, substantia nigra, n.preopticus hypothalami, n.caudatus) имплантировали моно- и биполярные золотые и нихромовые электроды в силиконовой оболочке и поверхностный хлорсеребряный электрод в area opticus против индифферента от лобной кости (координаты A, H, P рассчитывали по атласу Kцnig (1967). Все электроды были присоединены к мультиканальному разъему, закрепленному на черепе кролика акрилоксидом. Регистрацию ЭЭГ и ВП проводили в экранированной камере. Для вызова зрительных ВП использовали электрический фотостимулятор с яркостью вспышки 600 люкс. Амплитуда и латентность ВП при каждой регистрации представляли собой усредненную величину 50 потенциалов от монополярных отведений. Для регистрации и записи ЭЭГ использовали биполярные электроды от каждой структуры головного мозга, частотный анализ ЭЭГ осуществляли в нормированных и абсолютных величинах. Сбор и обработку информации проводили в программной среде «LabView 6.0».

Регистрацию спонтанных и вызванных импульсов осуществляли спустя 4 недели после имплантации электродов. В течение 10 дней записывали фоновые уровни спонтанной биоэлектрической активности и ВП исследуемых структур мозга. Оценивали динамику изменения латентного периода, амплитуды компонентов первичного ответа ВП, нормированные величины и мощности частотных спектров спонтанного потенциала (СП). При двусторонней гонадэктомии СП и ВП мозга регистрировали на 5, 10, 15, и 30 сутки после гонадэктомии.

Фармакологические препараты. Холинотропные средства: ганглерон (эфир г-диэтиламино-1,2-диметилпропил пара-изобутоксибензойной кислоты гидрохло-рид), селективный Н-холиноблокатор; никотин (пиридинметилпирролидон), Н-холиномиметик; метамизил (хлоргидрат 1,2-диэтиламиноизопропилового эфира бензоловой кислоты), селективный M-холиноблокатор; галантамин, обратимый ингибитор холинэстеразы, М- и Н-холиномиметик; ареколин (эфир 1,2,5,6-тетрагидро-1-метилникотиновой кислоты метиловый), М-холиноми-метик.

Дофаминергические средства: галоперидол, блокатор Д1/Д2-дофаминовых рецепторов; апоморфин, полусинтетический алкалоид морфина, селективный дофаминомиметик.

Стероидные гормоны: тестостерон (17в-гидрокси-4-андростен-3-он), эндогенный адрогенный гормон; дегидроэпиандростерон (3в-гидрокси-5-андрост-17-он), надпочечниковый андроген, нейростероид.

Статистическую обработку результатов проводили методом дисперсионного анализа ANOVA с использованием t-критерия Стьюдента с помощью пакета программ Origin^® 7,0 и Microsoft Excel 97^®.

Результаты собственных исследований

Роль М- и Н-холинергических систем в регуляции половой функции самцов. Влияние холинотропных препаратов на структуру полового поведения интактных самцов крыс

У самцов крыс, выращенных в однополых и одновозрастных сообществах, содержавшихся в полной внутривидовой изоляции с 15-18 дня жизни, определяли компоненты полового поведения в 2-х последовательных тестах после воздействия холинотропными соединениями. Результаты поведенческих исследований показали, что холинотропные препараты вызывают достоверное изменение структуры ПП. Отмечается изменение копуляторных, эякуляторных компонентов и временных характеристик (табл.1 и 2).

Таблица 1. Влияние М- и Н-холинотропных препаратов на параметры половой функции у интактных самцов крыс (M±m)

* - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной группе.

Активация Н-холинергической системы никотином (табл.1) и комбинацией препаратов галантамина с метамизилом (табл.2) приводила к небольшому усилению эякуляторного компонента полового поведения, о чем свидетельствует сокращение временного показателя эякуляции. Блокада Н-холинергических рецепторов ганглероном в 20 мг/кг вызывала некоторую активацию эякуляторной функции, что можно объяснить растормаживанием М-холинергических механизмов в ответ на блокаду Н-холинергической системы. Согласно принципу реципрокности функционирования М- и Н холинергических систем мозга (Лосев Н.А., 2001), снижение активности одной холинореактивной системы инициирует увеличение активности другой холинореактивной системы, и наоборот. Незначительность результатов модификации половой функции при активации и блокаде Н-холинергической системы свидетельствует, что никотиночувствительные механизмы мало причастны к центральной регуляции половой функции.

У самцов крыс, активация М-холинергической системы ареколином достоверно увеличивала мотивационные и копулятивные показатели половой поведения: САД, ИМС, ЭЯК и время МЭИ и ЛПС по сравнению с контролем, что свидетельствует об усилении половой функции. Активация М-холинергических механизмов мозга комбинацией препаратов галантамин и ганглерон (табл. 2) приводила к умеренному усилению половой активности, а именно к изменению мотивационного компонента полового поведения при стабильном уровне эякуляторных показателей.

Таблица 2. Влияние галантамина и его комбинаций с М- и Н-холиноблокаторами на параметры полового поведения у интактных самцов крыс (M±m)

* - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной группе.

Премедикация антихолинестеразным препаратом галантамином в дозе 0,5 мг/кг достоверных изменений в структуре половой функции не вызывала, увеличение дозы препарата до 2,0 мг/кг способствовало усилению половой функции. Комбинация галантамина с Н-холиноблокатором ганглероном показывала более выраженный стимулирующий эффект, чем введение только галантамина. Нейтрализация Н-холиномиметического эффекта галантамина ганглероном снижала его периферический эффект - отмечалось небольшое повышение показателя ЭЯК.

Рис. 1. Доза-зависимое влияние метамизила и ганглерона на половую активность у интактных крыс (n=15). Исходная активность принята за 100%.

Прим.: В эксперименте использовали самцов с приобретенным половым опытом.

Блокада М-холинорецепторов метамизилом вызывала доза-зависимое угнетение половой функции самцов. Метамизил в дозе 3,0 и 7,0 мг/кг оказывал угнетающее влияние как на центральные, так и на периферические параметры полового поведения. У 7 животных из 15, тестированных на ПП после премедикации метамизилом 3,0 мг/кг, полностью отсутствовала половая активность (рис. 1). При увеличении дозы до 7,0 мг/кг препарат полностью угнетал половую функцию интактных самцов крыс.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что центральная холинергическая система мозга посредством М-холинергических механизмов участвует в регуляции половой функции на различных уровнях - модифицируются как центральные мотивационные, так и периферические копулятивные компоненты половой функции.

Влияние М- и Н-холинолитиков на половую активность в зависимости от гормонального статуса самцов

Таблица 3. Параметры полового поведения у половозрелых потомств крыс после односторонней (ГГЭ) и двусторонней гонадэктомии (ДГЭ) (M±m)

* - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной группе.

После гемигонадэктомии (ГГЭ) отмечали снижение количественных парамет-ров полового поведения у самцов с сохраненной половой активностью и увеличе-ние временных показателей. Двусторонняя гонадэктомия (ДГЭ) вызывала полное угнетение половой функции у 65% самцов, у остальных 35% сохранились компо-ненты копулятивной активности (табл. 3), наличие которых объясняется выработкой андрогенов надпочечниками и влиянием нейрональных механизмов. Однократная инъекция галантамина и тестостерона вызывала достоверное изменение структуры полового поведения, динамика которого напоминает восстановление исходной половой активности (табл.4). Кроме того, отмечался достаточно длительный отсроченный эффект введения этих препаратов, который может объясняться запуском медленных геномных механизмов действия этого стероида в пределах ЦНС, с последующим синтезом рецепторов андрогенов (McEwen, 1981).

Таблица 4. Половая функция ГГЭ самцов после однократной инъекции галантамина (2 мг/кг), тестостерона (3 мг/кг), их комбинаций (по 0,5 мг/кг) (M±m)

* - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной группе.

Галантамин демонстрировал высокие активирующие свойства в отношении половой функции у гипогонадных самцов (табл.4). Усиление половой активности после инъекции галантамина прослеживалось также при введении значительно меньшей дозы галантамина (0,5 мг/кг) и тестостерона (0,5 мг/кг). Результаты исследования свидетельствует, что Тс потенцирует действие галантамина на половую активность гипогонадных самцов в достаточно низкой терапевтической дозе.

Длительный активирующий эффект галантамина при его комбинированном применении с тестостероном можно объяснить активацией нейрональных механизмов в структурах мозга, в том числе в лимбической системе и гипоталамусе. Ведущую роль в данном процессе, вероятно, играет активация нейромедиаторных систем этих структур, что подтверждается дальнейшими исследованиями. Показано, что для реализации эффекта галантамина на половую активность необходимо наличие Тс: инъекция галантамина самцам крыс с ДГЭ не оказывала существенного влияния на параметры половой функции, в то время как у самцов с ГГЭ эффект галантамина был ярко выражен (рис. 2)

Рис. 2. Влияние однократной инъекции галантамина (2 мг/кг), тестостерона (3 мг/кг) и их комбинаций (по 0,5 мг/кг) на проявление половой активности у гемигонадэктомированных (ГГЭ) и гонадэктомированных (ДГЭ) самцов крыс. Контролем (фон) являются исходные данные до премедикации

В эксперименте с использованием тестостерона в качестве заместительной терапии у ГГЭ самцов показано полное восстановление половой активности. У самцов с ДГЭ однократная инъекция тестостерона (3,0 мг/кг) восстанавливала только компоненты копуляторной активности, без проявления эякуляторной составляющей половой функции. Комбинированная инъекция значительно меньшей дозы галантамина (0,5 мг/кг) и тестостерона (0,5 мг/кг) оказывала такой же эффект (рис. 2). Таким образом, у гипогонадных ГГЭ самцов применение галантамина, так же как и тестостерона, восстанавливало половую функцию до уровня, сопоставимого с активностью интактных самцов, что свидетельствует о взаимной потенциации эффекта стероидного гормона и холиномиметика в реализации нарушенной половой функции.

Взаимодействие препаратов холинергической и дофаминергической систем в реализации половой функции самцов

Гипогонадным самцам с низкой половой активностью перед тестированием вводили комбинацию галантамина в дозе 2 мг/кг и блокатора Д1/Д2 рецепторов галоперидола в дозе, вызывающей 100% подавление половой функции - 1,5 мг/кг за 30 мин до опыта (рис.3А). Во втором эксперименте гипогонадным самцам вводили агонист Д1/Д2 дофамнергических рецепторов апоморфин (0,1 мг/кг) и М-холинолитик метамизил в дозе, вызывающей 100% подавление полового поведения - 7,0 мг/кг за 45 мин до тестирования на ПП (рис.3Б).

А

Б

Рис 3. Влияние холинергических и дофаминергических средств на половую активность гипогонадных самцов крыс

А - Влияние однократной инъекции галантамина и галоперидола на половую активность ГГЭ крыс. Б - Влияние однократной инъекции апоморфина и метамизила (7,0 мг/кг) на половую активность ГГЭ крыс. Контролем являются данные половой активности до премедикации.

Результаты исследования, представленные на рисунке 3 показали, что галантамин, как и апоморфин проявляют стимулирующий эффект на половую активность самцов. При этом антагонист дофаминергической системы галоперидол ингибировал активирующий эффект агониста холинергической медиаторной системы галантамина, но не блокировал полностью половую функцию. И наоборот, антагонист М-холинергической системы метамизил блокировал активирующий эффект агониста дофаминергической системы апоморфина. Это означает, что центральные регуляторные механизмы этих медиаторных систем на половую функцию самцов мало зависимы друг от друга. При этом, холинореактивная система по степени стимулирующего действия на половую функцию у гипогонадных самцов была сравнима с эффектом дофаминергической системы.

Вышеизложенные данные не исключают возможность реализации эффекта холинергической системы на половую активность через активацию дофаминергической системы структур мозга, участвующих в регуляции половой функции, поскольку известно, что холинергические механизмы мозга посредством М-холинорецепторов модулируют метаболизм многих нейромедиаторов, включая дофамин, которые непосредственно регулируют процессы мотивации и компоненты коитуса (Marshall, 1977; McGehee, 1997; Grady, 2001).

Взаимодействие галантамина с дегидроэпиандростероном в усилении половой функции у гипогонадных самцов

Нейростероиды обладают способностью воздействовать на активность различных нейромедиаторных систем мозга и вызывают значительное разнообразие биологических эффектов (Flood, 1988, Baulieu, 1996).

Таблица 5 Количественные показатели полового поведения у гемигонадэктомированных самцов после инъекций галантамина, ДГЭА и их комбинации (M±m)

* - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной группе.

В хроническом эксперименте исследовали доза-зависимое влияние ДГЭА на половую функцию ГГЭ самцов (табл.5). Комбинированное применение галантамина с нейростероидом ДГЭА значительно модифицировало структуру полового поведения самцов. Инъекции только ДГЭА в течение 7-и дней усиливали половое поведение гипогонадных самцов по сравнению с контролем. После 7-кратного введения ДГЭА и однократной инъекции галантамина перед тестированием половая функция самцов усиливалась до степени, сравнимой с интактными самцами. Комбинированное введение препаратов усиливало как связанные с мотивацией центральные компоненты, так и периферические копуляторные характеристики половой функции.

C целью изучения механизма действия ДГЭА на половую функцию самцов была проведена оценка его влияния на нейромедиаторный статус в лимбической системе и на концентрацию рецепторов андрогенов (РА) в гипоталамусе в условиях дефицита половых гормонов в хроническом опыте.

Влияние ДГЭА на нейромедиаторный статус гипогонадных самцов крыс. Двусторонняя гонадэктомия у крыс приводила к значительному изменению содержания всех определяемых нейромедиаторов и их метаболитов в структурах лимбической системы и гипоталамуса по сравнению с интактной группой. Инъекции ДГЭА в дозе 0,7 мг/кг способствовали восстановлению исходного уровня моноаминов - 5ГT, ДА, НА и их основных метаболитов 3,4-МГФГ, 5-ГИУК, и ГВК (а также коэффициентов метаболит/медиатор), сопоставимому с аналогичными данными у интактной группы животных (рис. 4).

Рис. 4. Содержание биогенных моноаминов и их метаболитов в гипоталамусе у ДГЭ самцов до и после в/м введения дегидроэпиандростерона

По оси ординат: концентрация моноаминов в пмоль/г сырой ткани. По оси абсцисс: 1- НА, 2- МГФГ, 3- МГФГ/НА, 4- 5-ГТ, 5- 5-ГИУК, 6- 5-ГИУК/5-ГТ, 7- ДА, 8- ДОФУК, 9- ДОФУК/ ДА. Штриховки: темная - интактная группа, точечная - гонадэктомированная группа, горизонтальная - ДГЭ + дегидроэпиандростерон 0,1мг/кг, вертикальная - ДГЭ + дегидроэпиандростерон 0,7мг/кг. * - различия достоверны при р0,05 по отношению к контрольной гонадэктомированной группе.

Результаты исследования свидетельствуют, что ДГЭА, оптимизируя уровень биогенных моноаминов в структурах лимбической системы мозга и гипоталамуса, может оказать существенное влияние на гормонозависимые поведенческие процессы у самцов крыс после гонадэктомии.

Влияние ДГЭА на концентрацию рецепторов андрогенов в гипоталаму-се. У ДГЭ самцов в преоптико-переднем гипоталамусе (ПО-ПГ) по данным радиолигандного связывания (³H)-тестостерона определяли концентрацию РА. Отмечали снижение уровня цитозольной фракции РА и значительное падение количества ядерной фракции РА в ПО-ПГ области через 3 недели после удаления гонад по сравнению с контрольной группой (рис.5). Такая же тенденция была характерна и для ГГЭ крыс, хотя снижение рецепторов было менее значительным. Наиболее выраженные изменения в содержании РА отмечались после 10-днев-ного в/м введения нейростероида в дозе 0,7 мг/кг ДГЭ самцам, что приводило к достоверному повышению уровня как цитозольной, так и ядерной фракции РА в гипоталамусе (р<0,05). При введении низкой дозы нейростероида (0,1 мг\кг) как у ДГЭ, так и у ГГЭ самцов крыс содержание РА меняется незначительно.

Рис.5. Динамика концентраций ядерных (А) и цитоплазматических рецепторов (Б) андрогенов в ПО-ПГ области головного мозга у гонадэктомированных самцов крыс после 10-дневной инъекции дегидроэпиандростерона

По оси ординат - уровень рецепторов в % по отношению к интактным (100%), По оси абсцисс: Инт- интактная группа; Конт - контрольная ГГЭ и ДГЭ группа; гр3- группа, получившая 0,1 мг\кг ДГЭА; гр4- группа, получившая 0,7 мг\кг ДГЭА.

*- различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Можно предположить, что повышение уровня РА в ПО-ПГ области под влиянием ДГЭА связано с изменением гормонального статуса в организме после введения нейростероида посредством 5-редуктазного превращения ДГЭА в 5-дигидротестостерон (El Attar, 1965), который, в свою очередь, может инициировать синтез РА, необходимых для реализации половой функции. В геномном механизме рецепторы ДГЭА действуют как факторы транскрипции, участвуя в регулировании гена с последующим изменением скорости биосинтеза белка, что обеспечивает молекулярную основу широкого спектра их действия на функции нейронов (Evans, 1988; McEwen, 1991).

Таким образом, влияние ДГЭА на усиление половой функции гипогонадных самцов обусловлено как его геномным действием на синтез РА на уровне ПО-ПГ области гипоталамуса, так и негеномным модулирующим влиянием на уровень нейромедиаторов как в самом гипоталамусе, так и в других структурах головного мозга, которые функционально взаимосвязаны с гормон-продуцирующими ядрами гипоталамуса. Эти свойства ДГЭА могут быть использованы для восстановления адекватного полового поведения и половой функции при различных состояниях, ассоциированных с дефицитом андрогенов.

Роль М- и Н-холинергических систем в реализации половой функции в условиях стресса

Некоторые факторы внешней среды, в их числе стрессорные, оказывают повреждающий эффект на баланс нейромедиаторов в структурах мозга, которые, в свою очередь, инициируют нарушение поведенческих состояний организма и полового поведения в том числе. Острый иммобилизационный стресс (ОС). В эксперименте одна из двух испытуемых групп животных за 30 мин до ОС с целью активирования М-холинергических механизмов подвергалась комбинированной премедикации галантамином (1,0 мг/кг) и ганглеронам (5 мг/кг). Животным контрольной группы вводили изотонический раствор хлорида натрия.

Рис. 6. Влияние 6-часового иммобилизационного стресса на структуру половой функции у контрольных крыс, после ОС и животных, предварительно получивших холинотропные препараты - галантамин (1 мг/кг) и ганглерон в дозе 5 мг/кг (ОС+Пр). Показатели контрольной группы приняты за 100%.

Результаты поведенческих исследований показали, что ОС продолжительностью 6 часов вызывает угнетение половой активности - происходит достоверное снижение САД, ИМС и ЭЯК (соответственно на 18,7%, 19,4% и 24,1%, р<0,05) и увеличение временных компонентов в значительных пределах (рис.6). Премедикация препаратами галантамина и ганглерона перед стрессом вызывала изменение показателей половой активности в противоположном направлении: наблюдалось увеличение САД, ИМС и ЭЯК (соответственно на 43,3%, 67,5% и 39,6%, р<0,01) и снижение временных параметров ПП - сокращения времени МЭИ на 36,1% (р<0,01) и ПВ на 29,0% (P<0,01) по сравнению с ОС группой, что свидетельствует о повышении половой активности.

Рис. 7. Влияние 6-часовой иммобилизации на содержание медиаторов в дорсальном гиппокампе у контрольной (К) и стрессированных (ОС) групп, и у самцов, получивших галантамин (1 мг/кг) и ганглерон в дозе 5 мг/кг (ОС+Пр).

*- различия достоверны при р<0,01 по сравнению с ОС группой.

Результаты нейрохимических исследований медиаторного статуса головного мозга у испытуемых групп животных показали, что 6-часовой ОС вызывает резкий дисбаланс в содержании нейромедиаторов и их метаболитов в исследуемых структурах мозга (рис.7). Премедикация холинотропными препаратами значительно изменила баланс медиаторов в головном мозге у испытуемых крыс в период стрессорного воздействия, приближая их статус к значениям интактной группы. Более выраженные изменения наблюдались в содержании ДА в гиппокампе.

Таким образом, результаты нейрохимических исследований свидетельствуют, что влияние холинотропных препаратов на половую активность при стрессе, помимо прямого действия на М-холинергические нейрональные механизмы, обусловлена также модуляцией активности основных нейромедиаторных систем, которые непосредственно регулируют процессы мотивации и компоненты коитуса (Marshall, 1977; McGehee, 1997; Gladkova, 2000), в большей степени, в результате дофаминпротекторного эффекта.

Одним из механизмов стрессорного воздействия, снижающего половую активность, может быть гормональный фактор. Полученные данные свидетельствуют о том, что после 6-часового ОС содержание тестостерона в крови значительно снижалось (рис.8А). Премедикация холинотропными препаратами достоверно предотвращала падение уровня тестостерона во время иммобилизационного стресса. В хроническом опыте холинотропные препараты не оказывали заметного влияния на уровень тестостерона в крови. Защитный эффект холинотропных препаратов, по нашему мнению, основан на блокировании выброса кортикоидных гормонов надпочечниками в результате ганглиоблокирующего действия ганглерона, который прерывал развитие физиологических эффектов стресса на уровне эндокринной системы.