Патогенетические факторы модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких

Размещено на http://www.allbest.ru/

Патогенетические факторы модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

туберкулез апоптоз химиотерапия

Актуальность проблемы. Туберкулез остается серьезной и актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [Краснов В.А., 2008; Jeong Y.J., Lee K.S., 2008]. Изучение эпидемиологической ситуации за последние годы показало, что прогноз относительно ликвидации туберкулеза не оправдался. Данные Европейского регионального бюро ВОЗ свидетельствуют о том, что распространение туберкулеза приобрело угрожающие масштабы. Так, например, в России заболеваемость туберкулезом в 2007 г. достигала 83,2 случаев на 100 тыс. населения, а в Томской области в 2007 г. - 102,5, в 2008 г. - 101,4. Серьезную эпидемиологическую проблему представляют группы риска - лица с асоциальным поведением, иммигранты, наркоманы, дезадаптированные подростки, среди которых имеют широкое распространение лекарственно-устойчивые формы туберкулеза, включая полирезистентные варианты инфекции. Прогрессирующее увеличение числа случаев заражения антибиотико-рефрактерными штаммами микобактерий, устойчивых к двум, трем и более туберкулостатическим препаратам, является отрицательной тенденцией последних лет. Об этом свидетельствует рост частоты развития остропрогрессирующих форм лекарственно-резистентного туберкулеза с тяжелым клиническим течением и значительной распространенностью патологического процесса [Каминская Г. О. и соавт., 2006; Исакова Ж.Т. и соавт., 2007; Маркелов Ю.М., Дородная И.А., 2007; Фирсова В.А. и соавт., 2007] .

Согласно современным представлениям, наиболее тяжелое течение туберкулеза отмечается при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа [Масленников А.А. и соавт., 2007]. Ведущая роль в обеспечении противотуберкулезной защиты организма, как известно, принадлежит тканевым и циркулирующим фагоцитам - альвеолярным макрофагам, моноцитам и полиморфно-ядерным нейтрофилам, а также индукторам иммунного воспаления - лимфоцитам. Между тем, наиболее характерными признаками дизрегуляции иммунных процессов при туберкулезе, по данным ряда авторов, являются, прежде всего, нарушения структурно-метаболического и функционального статуса лимфоцитов и моноцитов [Комогорова С.Э. и соавт., 2005; Пичугин А.В., 2005; Фирсова В.А. и соавт., 2007].

Установлено, что патогенез иммунной гипо- и анергии при инфекционном процессе во многом обусловливается индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата иммунокомпетентных клеток и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. Основную функцию гомеостатической регуляции в организме выполняют система ДНК-репарации, обеспечивающая внутриклеточное восстановление генетических структур, и апоптоз, обусловливающий поддержание баланса между делением и гибелью клеток и элиминацию аберрантных клеточных форм и инфицированных клеток. В то же время показано, что цитогенетические повреждения и дисфункция ДНК-репаративной системы могут служить своего рода индукторами апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006; Camenisch U., Naegeli H., 2009].

Выяснение путей запуска и молекулярных механизмов дизрегуляции запрограммированной гибели отдельных клеток в многоклеточном организме является одной из нерешенных задач медико-биологических наук. Актуальность этой проблемы определяется тем, что срыв (угнетение или, наоборот, усиление) апоптозной программы в организме обусловливает развитие и прогрессирование ряда заболеваний, в том числе инфекционных. Так, например, установлено, что дефект Fas-индуцированного апоптоза моноцитов/макрофагов и стимуляция экспрессии на макрофагальных клетках антиапоптозного гена bcl-2 при туберкулезе являются ключевыми факторами латентной микобактериальной инфекции [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Вместе с тем, многие вопросы относительно дизрегуляторных нарушений естественной гибели клеток и участия апоптоза в патогенезе иммунной дестабилизации при туберкулезном процессе остаются открытыми. До сих пор нет патогенетического обоснования роли перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и ионного дисбаланса в реализации апоптозных потенций иммуноцитов и формировании бактериальной иммунорезистентности при туберкулезе.

В свете изложенного представляется важным изучение молекулярно-биологических механизмов, определяющих развитие и характер течения туберкулезного процесса. Это, несомненно, расширит имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой для создания более совершенных методов диагностики и прогнозирования туберкулеза, выявления групп риска по развитию тяжелых прогрессирующих форм заболевания, а также для разработки более эффективных методов профилактики и коррекции иммунопатологических изменений, сопровождающих туберкулез и противотуберкулезные мероприятия.

Цель исследования: выявить общие закономерности и факторы модуляции апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном туберкулезе легких до и в условиях противотуберкулезной химиотерапии.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных 18-55 лет с распространенным деструктивным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией).

2. Оценить роль нарушений макро- и микроэлементного состава, цитогенетического статуса, структурных свойств мембраны, перекисного окисления липидов в индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких.

3. Провести сравнительную оценку апоптоз-модулирующих факторов мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных легочным туберкулезом (лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и казеозной пневмонией) и у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.

4. Установить патогенетические факторы индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови при отдельных клинических формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких до и в процессе противотуберкулезной полихимиотерапии.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных с различными клиническими формами (инфильтративный, диссеминированный, фиброзно-кавернозный, казеозная пневмония) распространенного деструктивного туберкулеза легких в связи с чувствительностью возбудителя к терапии до начала лечения и на фоне проведения противотуберкулезной химиотерапии. Установлено, что течение распространенного деструктивного лекарственно-чувствительного и лекарственно-устойчивого туберкулеза легких сопровождается активацией спонтанного и Н₂О₂-индуцированного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, уровень которого после курса интенсивной противотуберкулезной терапии становится еще выше, а после курса поддерживающей химиотерапии проявляет тенденцию к нормализации. При этом уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов наиболее значителен при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного (в лимфоцитах) и лекарственно-резистентного (в моноцитах) туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии имеет наименее выраженный характер. Охарактеризована роль нарушений цитогенетического статуса, структурной организации мембраны и макро- и микроэлементного состава (Ca²⁺, Na⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺) клеток и плазмы в модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких до и на фоне противотуберкулезной терапии. Установлены дифференциальные факторы индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови. Наиболее значимыми из них при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких оказались увеличение числа предуготовленных к апоптозу СD95+-клеток, хромосомные аберрации на фоне подавления ДНК-репарации (как фактор апоптоза лимфоцитов), повышение текучести мембраны и изменения макро- и микроэлементного состава клеток и плазмы (как фактор апоптоза моноцитов); при лекарственно-резистентном туберкулезе легких - нарушения липидного спектра мембраны и катионного состава внутриклеточной среды и плазмы. По результатам исследования сделано предположение о том, что апоптоз мононуклеарных лейкоцитов крови может быть реализован по Fas-опосредованному, а также (в связи с накоплением в клетках кальция) митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Показано, что спектр факторов активации апоптоза при туберкулезе легких существенно отличается от такового при хронической обструктивной болезни легких; при этом перекисное окисление липидов опосредует повышенный уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких и не оказывает апоптогенный эффект при множественной лекарственной резистентности. Установлено, что на фоне специфической противотуберкулезной терапии спектр апоптоз-стимулирующих факторов варьирует, выраженность составляющих его изменений (равно как и непосредственно уровень активации апоптоза) возрастает после интенсивного курса лечения, в то время как после завершения фазы поддерживающей терапии уровень гибели клеток проявляет тенденцию к нормализации.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания о роли апоптоза в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, факторах активации программированной гибели лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных туберкулезом легких. Результаты исследования могут служить основой новых методологических подходов к иммунокоррекции, направленной на повышение жизнеспособности и регуляцию численности клеток крови, формирующих реакции доиммунного воспаления (моноциты) и адаптивного противотуберкулезного иммунитета (лимфоциты), а также быть использованы в качестве информативных критериев для оценки прогнозирования течения и исхода заболевания. Это позволит проводить своевременную профилактику осложнений легочного туберкулеза, в том числе вызванных иммунотоксическим действием применяемых в терапии туберкулеза фармакологических средств.

Положения, выносимые на защиту:

1. Течение туберкулеза легких сопровождается активацией апоптоза лимфоцитов и моноцитов периферической крови. Степень выраженности и спектр факторов индукции программированной гибели клеток зависят от клинической формы заболевания. При этом они наиболее значительны при инфильтративной и фиброзно-кавернозной формах лекарственно-чувствительного и лекарственно-резистентного туберкулеза легких, в то время как при казеозной пневмонии являются минимальными.

2. К общим факторам индукции апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при туберкулезе легких относятся повышенное содержание холестерина и фасфатидилинозитола в клеточной мембране в сочетании с уменьшением микровязкости ее липидного бислоя, а также увеличение внутриклеточной концентрации Ca²⁺, Al³⁺ и (при снижении содержания в плазме) Mg²⁺, Cu²⁺. При этом степень активности апоптоза моноцитарных клеток в связи со стимуляцией эксцизионной ДНК-репарации ниже, чем уровень программированной гибели лимфоцитов.

3. При лекарственно-чувствительном туберкулезе, наряду с активацией перекисного окисления липидов, в структуре апоптогенных факторов лимфоцитов превалируют гиперэкспрессия CD95/Fas на фоне повышения количества хромосомных аберраций и подавления ДНК-репарации в клетках, а в числе факторов апоптоза моноцитов - повышение текучести мембраны и изменения внутриклеточной и плазменной концентрации макро- (Na⁺, Mg²⁺) и микроэлементов (Al³⁺, Cu²⁺). При лекарственно-резистентном туберкулезе апоптоз лимфоцитов и моноцитов индуцируют нарушения липидного спектра мембраны (увеличение концентрации холестерина и легкоокисляемых фракций липидов) и катионного (Fe²⁺, Na⁺, Mg²⁺, Cu²⁺) состава клеток и плазмы крови.

4. К факторам модуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, отличающим специфическую (туберкулез) и неспецифическую (хроническая обструктивная болезнь) патологию легких, относятся сопровождающие течение туберкулезного воспаления хромосомные аберрации (обмены, разрывы), изменения активности ДНК-репарации (подавление в лимфоцитах и стимуляция в моноцитах), катионного состава и повышение содержания холестерина в мембране клеток.

5. В условиях интенсивной противотуберкулезной терапии усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов обусловлено более выраженными (чем до лечения) перестройками их клеточной мембраны, повышением активности перекисного окисления липидов, а также (в направлении гибели лимфоцитов) числа хромосомных аберраций и концентрации макро- и микроэлементов (Fe²⁺, Al³⁺, Cu²⁺, Mg²⁺ в клетках и Ca²⁺, Na⁺ в клетках и плазме). При этом после курса поддерживающей химиотерапии восстановление активности процессов липопероксидации и ДНК-репарации, структуры и катионного состава клеток и плазмы определяет тенденцию к нормализации апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию противотуберкулезной службы Томской области, 75-летию кафедры фтизиатрии и пульмонологии СибГМУ «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), Третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005), IV Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), XIII Российском научном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Второй международной Германо-Российской конференции Форума им. Коха и Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), Internationaler Kongress Fachmesse: moderne aspekte der prophylaxe, behandlung und rehabilitation (Ганновер, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2003-2009).

Результаты исследования используются в курсе лекций по патологической физиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление») и фтизиатрии (раздел «Иммунитет и аллергия при туберкулезе») на лечебном и педиатрическом факультетах ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Исследования проведены при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (ГК №02.445.11.7419 «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы»; ГК №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма») и Совета по грантам при Президенте РФ (НШ-1051.2003.04 «Молекулярные механизмы нарушений структуры, метаболизма и функций клеток крови при патологии»; НШ-4153.2006.7 «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы»).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 29 работ, из них 12 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 366 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 96 таблицами. Библиографический указатель включает 382 источника, из них 225 отечественных и 157 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 298 больных с распространенным деструктивным туберкулезом легких. Пациенты находились на стационарном лечении в Томской областной противотуберкулезной больнице (гл. врач - Янова Г.В.) во фтизиотерапевтических отделениях №1 (зав. отд. - Новосельцева О.И.), №2 (зав. отд. - Малиновская Т.З.), №3 (зав. отд. - Янов А.А.). На завершающем этапе лечения больные наблюдались на базе Томского областного противотуберкулезного диспансера (гл. врач - Мишустин С.П.).

Клинический осмотр и обследование пациентов, сбор анамнеза, постановку диагноза и назначение соответствующих схем лечения осуществляли врачи-фтизиатры Томской областной туберкулезной клинической больницы (чл.-корр. РАМН, профессор Стрелис А.К., к.м.н. Янова Г.В., к.м.н. Филинюк О.В., к.м.н. Лещев А.С., к.м.н. Петрова Л.Е., Мельникова Т.И., Янов А.А., Щегерцов Д.А.). Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких. Диагноз инфильтративного туберкулеза легких был выставлен 117 (39,26%) больным, диссеминированного - 103 (34,56%), фиброзно-кавернозного - 61 (20,47%), казеозной пневмонии - 17 (5,71 %).

В ходе исследования все больные с туберкулезом легких были разделены на две основные группы в зависимости от чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам: в первую группу вошли 188 больных, выделяющих M. tuberculosis, чувствительные к основным противотуберкулезным препаратам, во вторую - 110 больных, выделяющих M. tuberculosis с первичной множественной лекарственной устойчивостью (устойчивость к изониазиду, рифампицину и стрептомицину). Каждая группа дополнительно была разделена на подгруппы в зависимости от клинической формы заболевания. Для видовой идентификации и определения чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Лечение больных туберкулезом легких проводилось в соответствии со стандартными схемами противотуберкулезной химиотерапии, включающими в себя интенсивную и поддерживающую фазы лечения.

Обследование больных туберкулезом легких проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии, после окончания курса интенсивной химиотерапии и после курса поддерживающей противотуберкулезной терапии.

Группы сравнения составили 17 здоровых мужчин и женщин в возрасте от 18 до 50 лет и 17 пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Все лица, входящие в группу здоровых доноров, прошли медицинский осмотр в МЛПМУ «Поликлиника №5» (главный врач - Коваленко С.И.). В анамнезе не было обнаружено хронических инфекционных заболеваний, аллергических реакций. Частота заболеваемости острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не превышала 3 раз в год.

Материалом исследования служила венозная кровь.

Определение общего количества лейкоцитов, абсолютного и относительного числа их отдельных морфологических форм проводили общепринятыми гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].

Выделение лимфоцитов и моноцитов периферической крови осуществляли на градиентах плотности фиколл-урографина (1,077 г/см³ и 1,083 г/см³ соответственно) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Определение апоптотических лимфоцитов и моноцитов проводили методом люминесцентной фотометрии на основе индикации annexin V+ клеток («BD Biosciences», США). Апоптоз стимулировали путем добавления в клеточную суспензию Н₂О₂ с последующим культивированием клеток в течение 24 ч. Оценку экспрессии Fas/APO-1 (CD95+) на лимфоцитах периферической крови проводили методом иммунофлуоресценции с использованием набора моноклональных антител «Клоноспектр» (МедБиоСпектр, Россия).

Активность УФО-индуцированной ДНК-репарации в лимфоцитах и моноцитах исследовали методом сцинтилляционной радиометрии. Обработку культур лимфоцитов крови и приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead et al. [1960]. Для стимуляции клеточного деления использовали 0,01% раствор колхицина («Fluka», Швейцария). У каждого обследуемого анализировали не менее 100 метафазных пластинок, учитывая общее количество клеток с хромосомными нарушениями, количество аберраций хромосом (на клетку), количество клеток с изменением числа и нарушениями структуры хромосом.

Концентрацию железа, меди, марганца, цинка, магния, алюминия в лимфоцитах, моноцитах и плазме крови определяли методом эмиссионного спектрального анализа по спектру излучения атомов, а концентрацию натрия, калия и натрия - плазменно-фотометрическим методом, основанным на измерении интенсивности излучения атомов элементов, возбуждаемых в пламени [Кузяков Ю.Я. и соавт., 1990].

Оценку микровязкостных свойств плазматической мембраны мононуклеарных лейкоцитарных клеток крови осуществляли путем флуоресцентного зондирования с использованием флуоресцентного зонда пирен [Добрецов Г.Е., 1989]. Выделение плазматических мембран мононуклеарных лейкоцитов проводили путем разделения клеточных компартментов в двухфазной системе декстран (500 000)-ПЭГ 6000 [Финдлей Дж., Эванс С., 1991]. Изучение липидного спектра мембран мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли поэтапно с использованием метода тонкослойной хроматографии: выделение липидного экстракта [Folch J et al., 1957]; определение содержания общих фосфолипидов [Колб В.Г., 1982]; разделение основных классов фосфолипидов и нейтральных липидов [Жухоров Л.С., 1984]; определение процентного содержания фракций липидов; количественное определение фосфолипидов [Жухоров Л.С., 1984]; количественное определение холестерина [Карпищенко А.И, 2002]. Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов фирмы «Sigma» (США).

Исследование содержания ТБК-активных продуктов [Арутян А.В. и соавт., 2000] и диеновых конъюгатов [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983] в мононуклеарах периферической крови проводили методом спектральной фотометрии. Активность супероксиддисмутазы (адренохромовый методод) и каталазы (по убыли перекиси водорода) в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови определяли спектрофотометрически [Арутян А.В. и соавт., 2000].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 12. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро-Вилка. Так как сформированные выборки не подчинялись нормальному закону распределения, то использовали непараметрические статистические критерии. Для определения достоверности различий при сравнении трех выборок и более применяли непараметрический аналог дисперсионного анализа - критерий Крускала-Уоллиса. Для множественных сравнений двух независимых выборок использовали критерий Данна. Для повторных измерений применяли критерий Фридмана. Для множественных сравнений двух зависимых выборок применяли критерий Даннета. Зависимости между переменными вычисляли с помощью коэффициента корреляции Спирмена R. Результаты представляли в виде выборочных средних (М), а также в виде медианы, верхнего (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Ме (Q1-Q2)). Для выявления значимых показателей (р<0,005) в запуске программы программируемой клеточной гибели у больных туберкулезом легких был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся спонтанный апоптоз лимфоцитов и моноцитов крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Туберкулез развивается и протекает наиболее тяжело при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа, в первую очередь со стороны макрофагов и лимфоцитов [Сахарова И.Я. и соавт., 2003]. Исследования показателей клеточного иммунитета выявили, что течение туберкулезной инфекции ассоциировано с развитием синдрома вторичного иммунодефицита [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Комогорова Е.Э. и соавт., 2005]. Наличие иммунодепрессии обусловливает нарастание частоты быстропрогрессирующих форм туберкулеза.

Проведенные нами исследования показали, что у больных туберкулезом легких (ТЛ) до начала химиотерапии имеются достоверные нарушения количественных показателей белой крови по сравнению с соответствующими значениями у здоровых доноров, проявляющиеся увеличением ОКЛ (исключение составили пациенты с казеозной пневмонией и инфильтративной формой лекарственно-чувствительного ТЛ), лимфоцитопенией и моноцитозом.

Основными механизмами, способствующими формированию лейкоцитоза, являются ускоренный выход лейкоцитов из костного мозга в кровь, стимуляция костномозгового кроветворения, выход клеток в циркуляцию из маргинального пула [Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Ляшенко В.А., 1995; Фрейдлин И.С., 1995; Гольдберг Е.Д. и соавт., 1997; Кашкин К.П., 1998]. Выявленная нами при ТЛ лимфоцитопения могла быть связана с истощением пула ранних и гибелью циркулирующих лимфоцитарных клеток [Черных Е.Р. и соавт., 2002; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005], в том числе в связи с прямым действием туберкулезных токсинов [Чернов А.П., и соавт., 1998; Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Свой вклад в развитие лимфоцитопении, вероятно, может вносить дисбаланс со стороны эндокринной системы [Баласанянц Г.С. и соавт., 2000; Мишин В.Ю., 2004].

Большинство заболеваний органов дыхания сопровождаются общими клиническими симптомами, среди которых преобладают синдром интоксикации и бронхолегочные нарушения. При этом оценка специфичности изменений, характерных для туберкулезного процесса, является необходимым условием дифференцированного подхода к углубленному изучению данной патологии, разработке прогностических ее критериев и лечебно-реабилитационных программ. В результате при сравнении гематологических параметров у больных ТЛ и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) было установлено, что моноцитоз и лимфоцитопения характеризуют развитие туберкулезной инфекции, но отсутствуют при неспецифическом воспалении легких.

Лимфоциты и циркулирующие моноциты являются одними из главных эффекторов противотуберкулезного иммунитета [Маянский А.Н., 2001; Каминская Г.О. и соавт., 2006]. Их численность в крови зависит от многих факторов, в том числе от активности апоптоза. Повышенная готовность лейкоцитов к апоптозу в настоящее время рассматривается в качестве одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа не только при туберкулезе, но и при других инфекциях бактериальной и иной природы [Уманский Ю.А., 1996]. В связи с этим, важным представлялось провести комплексную оценку апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при ТЛ.

Проведенные исследования показали, что при разных формах ТЛ и у больных ХОБЛ отмечается сходная динамика изменений активности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов. Так, у пациентов с ТЛ до начала лечения было выявлено увеличение количества аnnexin V-положительных лимфоцитов и моноцитов относительно соответствующих параметров у здоровых доноров и больных с обострением ХОБЛ (табл. 1). Кроме этого, было обнаружено, что содержание предуготовленных к апоптозу CD95⁺-лимфоцитов при ТЛ превышает аналогичные значения у здоровых доноров и при ХОБЛ.

При оценке действия перекиси водорода, как неспецифического индуктора апоптотической гибели клеток, было установлено, что у больных ТЛ и ХОБЛ она опосредовала более выраженное, нежели у здоровых доноров, увеличение числа аnnexin V+ лимфоцитов и моноцитов in vitro по сравнению с уровнем спонтанной гибели клеток, не обработанных H₂O₂, что служит дополнительным свидетельством повышенной предрасположенности мононуклеарных лейкоцитов к апоптозу. Показано, что основной тип повреждений, который индуцирует перекись водорода - однонитевые разрывы. В свою очередь, возникающие повреждения увеличивают экспрессию белка р53, что приводит к активации проапоптотических белков (Bax, Bcl-x_S, Bfl₁), репрессии антиапоптотических факторов (Bcl-2, Bcl-x_L) и апоптозу [Жукова О.Б. и соавт., 2006].

Вместе с этим, среди ученых до сих пор нет единого мнения о механизмах индукции апоптоза при ТЛ. Неизвестно насколько они специфичны для данной патологии. Учитывая вышеизложенное, нами было проведено сравнительное исследование, позволяющее выявить наиболее значимые показатели в запуске программы клеточной гибели у больных ТЛ и ХОБЛ. Для решения поставленной задачи был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.

Предполагается, что чрезмерная экспрессия Fas-антигена является следствием дисбаланса активационных сигналов, обусловливающего включение программы гибели клеток при их стимуляции [Салина Т.Б., Худзик Л.Б., 2001]. В частности, Т. Hertoghe et al. [2000], А. Soruri et al. [2002] показали увеличение числа CD95+-Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Этот феномен был зафиксирован также и в других научных публикациях [Бойчук С.В. и соавт., 2003; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005]. Вместе с тем, некоторыми исследователями было продемонстрировано, что механизм ассоциированного с ТЛ апоптоза опосредован подавлением bcl-2 [Klinger K. et al., 1997]. В последние годы появились данные о совместной роли CD95 и bcl-2-репрессии в индукции апоптоза [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Роль CD95+ в запуске апоптоза подтверждается также результатами нашего исследования. Так, согласно данным ковариационного анализа, у больных с инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным ТЛ гиперэкспрессия СD95+ на лимфоцитах явилась значимым фактором, инициирующим их апоптотическую гибель (табл. 2).

Таблица 1Уровень апоптотических мононуклеаров в периферической крови у здоровых доноров, больных хронической обструктивной болезнью (ХОБЛ) и туберкулезом легких до начала лечения (М)

Примечание: ЛЧ ТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУ ТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких; p₁ - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров; p₂ - по сравнению с аналогичными показателями у больных ХОБЛ; p₃ - по сравнению с показателями при инфильтративной форме; p₄ - по сравнению с показателями при диссеминированной форме; p₅ - по сравнению с показателями при фиброзно-кавернозной форме; p₆ - по сравнению с показателями у больных лекарственно-чувствительным ТЛ (для каждой формы и этапа исследования).

Таблица 2 Факторы, оказывающее влияние на апоптоз лимфоцитов у больных туберкулезом легких до начала терапии

Здесь и далее: ЛЧ ТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких, ЛУ ТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких; ИС - индекс стимуляции, ТБК-а - ТБК-активные продукты, ДК - диеновые конъюгаты, СОД - супероксиддисмутаза, СФМ - сфингомиелин, ФИ - фосфатидилинозитол, ФС - фосфатидилсерин, ЛФЛ - лизофосфолипиды.

Таким образом, течение ТЛ характеризуется увеличением содержания аnnexin V- и CD95-положительных лимфоцитов в крови, что имеет место при всех вариантах заболевания и, вероятно, служит одним из факторов лимфоцитопении. Однако, несмотря на высокий уровень апоптоза моноцитов крови, при ТЛ, как показали полученные результаты, имеет место моноцитоз, что, вероятно, объясняется включением перераспределительного и продуктивного механизмов компенсации с замещением погибших моноцитов не только зрелыми (резервными), но и молодыми, функционально неполноценными формами клеток. При этом повышение содержания аnnexin V-положительных мононуклеаров и CD95+-лимфоцитов у пациентов с обострением ХОБЛ, аналогичное таковому при ТЛ, указывает на типовой характер нарушений апоптоза.

Одной из причин нерепарируемых повреждений ДНК является патология ДНК-восстановительных систем, что в итоге приводит клетку к апоптозу. В связи с этим было проведено исследование активности ДНК-репарации в мононуклеарных лейкоцитах и хромосомный анализ лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ.

У больных с инфильтративным и фиброзно-кавернозным лекарственно-чувствительным (ЛЧ) и лекарственно-устойчивым (ЛУ) ТЛ до начала терапии выявлялось достоверное снижение индекса стимуляции (ИС) ДНК-репарации в лимфоцитах относительно аналогичных показателей у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у пациентов с диссеминированной формой ТЛ, казеозной пневмонией (КП) и ХОБЛ данный показатель не отклонялся от нормы.

Эксцизионная репарация ДНК, как известно, обеспечивает защиту геномной ДНК от повреждений генотоксическими факторами [Василенко Н.Л., Невинский Г.А., 2003]. Инфильтративный туберкулез не возникает в интактных зонах легочной ткани, а развивается, как правило, в тех участках легких, которые способны ответить бурной гиперергической воспалительной реакцией на возбудитель. Центральным звеном иммунопатогенеза инфильтративного туберкулеза легких является длительная циркуляция в организме сенсибилизированных к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитов [Хоменко А.Г., 1998]. Фиброзно-кавернозный ТЛ - наиболее неблагоприятная, прогрессирующая форма туберкулезной инфекции. Столь продолжительный контакт лимфоцитов с инфектогеном при инфильтративной форме и усугубляющаяся тяжесть процесса при фиброзно-кавернозном варианте ТЛ может служить, на наш взгляд, фактором «истощения» резервных ресурсов системы восстановления ДНК. При диссеминированном туберкулезе легких и КП патогенетическая роль лимфоцитов реализуется на более поздней стадии развития заболевания, в связи с чем клетки в меньшей степени подвергаются инфекционному повреждению [Норейко Б.В., 2003; Мишин В.Ю., 2004].

При анализе полученных данных обращало на себя внимание то, что снижение активности ДНК-репарации в лимфоцитах выявлялось при тех формах ТЛ, при которых регистрировалась значительная активация апоптоза и, напротив, нормальная величина ИС ДНК-репаративных процессов обнаруживалась при тех вариантах ТЛ, при которых увеличение числа апоптотических лимфоцитов было минимальным. Наиболее ярким примером служит КП: при этой форме ТЛ индекс стимуляции репарации ДНК не отличался от нормальных значений, в то время как уровень annexin V-положительных лимфоцитов был наиболее низким. Данный факт подтверждает связь программированной клеточной гибели клеток с состоянием ДНК-репаративных процессов при ТЛ.

При анализе состояния ДНК-восстановительных процессов в моноцитах периферической крови только у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ регистрировалось снижение ИС относительно его значений у здоровых пациентов и больных ХОБЛ, в то время как в других группах исследования (за исключением больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) он был выше нормы. У больных ХОБЛ изменений ИС ДНК-репарации моноцитов не регистрировалось.

Общеизвестно, что продукт тканевой трансформации моноцитов - макрофаги формируют «первую линию защиты» в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ), проникших в организм, участвуют в синтезе медиаторов и обладают цитотоксической активностью по отношению к МБТ [Маянский А.Н., 2001; Еремеев В.В., Майоров К.Б., 2002; Чучалин А.Г., 2004]. Таким образом, повышение активности системы ДНК-репарации в моноцитах, являющихся не только мишенью отрицательного воздействия МБТ, но и важным звеном в противотуберкулезном иммунитете, можно рассматривать как защитно-приспособительную реакцию, направленную на восстановление поврежденных участков цепи ДНК и, тем самым, повышение выживаемости клеток.

При этом результаты ковариационного анализа показали, что снижение активности ДНК-репаративных процессов имеет статистически достоверное значение в запуске программы апоптоза лимфоцитов крови у больных инфильтративным ЛЧ ТЛ до начала терапевтических мероприятий, в то время как активация ДНК-репарации, по всей видимости, оказывает протективный эффект в отношении апоптоза моноцитов у пациентов с диссеминированным ЛЧ ТЛ и инфильтративным ЛУ ТЛ (табл. 2, 3).

В отличие от ТЛ, в патогенезе ХОБЛ важная роль отводится нейтрофильным гранулоцитам. Полагают, что макрофаги регулируют воспаление при ХОБЛ за счет высвобождения хемокинов, которые привлекают в очаг воспаления, прежде всего, нейтрофилы и во вторую очередь - моноциты и Т-лимфоциты, высвобождающие факторы (протеазы), приводящие к разрушению эластина и последующему формированию эмфиземы [Шмелев Е.И., 2007]. Таким образом, лимфоциты и моноциты играют второстепенную роль в патогенезе ХОБЛ. Вероятно, именно поэтому в них не происходит значимой активации ДНК-репарации.

При изучении метафазных пластинок лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ было обнаружено достоверное увеличение общего количества клеток с хромосомными нарушениями в сравнении с аналогичными показателями в группах сравнения. При этом увеличение общего количества клеток с хромосомными аберрациями происходило в основном за счет возрастания доли лимфоцитов с нарушениями структуры хромосом. У больных ХОБЛ также обнаруживалось увеличение числа клеток с аберрациями, но за счет изменения числа хромосом.

При анализе структурных аберраций хромосом в лимфоцитарных клетках у больных легочным туберкулезом учитывались хромосомные разрывы и обмены (парные фрагменты, разрывы хромосом по центромере, кольцевые и дицентрические хромосомы), а также хроматидные разрывы и обмены (одиночные фрагменты и «кресты»).

Было зарегистрировано повышение содержания хромосомных разрывов в лимфоцитах у больных с инфильтративным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ относительно группы здоровых доноров. Одновременно у всех обследуемых пациентов (за исключением больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) отмечалось достоверное повышение числа хромосомных обменов в клетках относительно такового в группах сравнения. У всех пациентов с ЛУ ТЛ, инфильтративным и фиброзно-кавернозным вариантами ЛЧ ТЛ отмечалось также увеличение частоты регистрации хроматидных разрывов в лимфоцитах в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ число хроматидных разрывов в клетках оказалось больше, чем при чувствительной к терапии его форме. В остальных группах обследованных данный показатель не отличался от нормальных значений.

Таблица 3Факторы, оказывающее влияние на апоптоз моноцитов у больных туберкулезом легких до начала терапии

Здесь и далее: ФЭА - фосфатидилэтаноламин, ХС - холестерин, ХС/ФЛ - холестерин-фосфолипидное отношение.

Возрастание в клетке числа хроматидных разрывов и обменов при действии различного рода мутагенных факторов указывает на синтетический или постсинтетический периоды возникновения хромосомных нарушений, повышение же уровня хромосомных разрывов и обменов - на чувствительность к повреждающему воздействию G₁-фазы клеточного цикла [Плотникова Н.Н., 1992]. По всей видимости, M. tuberculosis посредством индукции образования токсических продуктов клеточного и тканевого распада, стимуляции секреции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами, макрофагами и свободнорадикальных реакций [Каминская Г.О., 1996; Mitsuyama M., 1995] может вызывать возникновение нарушений в хромосомном аппарате лимфоцитов. Можно также сделать вывод о том, что при КП и диссеминированном варианте ЛЧ ТЛ хромосомные аберрации лимфоцитов возникают преимущественно в G₁-фазе, при остальных формах ТЛ как в G₁, так и S- и G₂-фазах клеточного цикла.

Интересным представляется также тот факт, что уровень апоптоза лимфоцитов был максимальным при тех формах ТЛ, при которых отклонения параметров цитогенетического статуса являлись наиболее выраженными. Так, при инфильтративном и фиброзно-кавернозном ТЛ было зарегистрировано наибольшее количество лимфоцитов с хромосомными аберрациями, была пониженной активность ДНК-репарации и высоким уровень апоптотических лимфоцитов. При диссеминированном ТЛ и КП, напротив, было выявлено незначительное повышение числа клеток со структурными нарушениями хромосом, annexin-позитивных клеток и нормальный уровень ДНК-репаративного синтеза. Кроме этого, при инфильтративном ЛУ ТЛ была отмечена положительная корреляционная связь между показателем спонтанного апоптоза лимфоцитов и количеством хромосомных (r=0,892; p=0,041) и хроматидных (r=0,892; p=0,041) обменов. Данный факт демонстрирует роль цитогенетических изменений в запуске апоптоза. При проведении ковариационного анализа также была подтверждена роль нарушений числа и структуры хромосом, количества хроматидных разрывов и хромосомных обменов в инициации апоптотической гибели лимфоцитов у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ (табл. 2).

Таким образом, ТЛ сопровождается угнетением эксцизионной ДНК-репарации и накоплением хромосомных аберраций в лимфоцитах. Наряду с этим, в моноцитах регистрируется повышение индекса ДНК-репарации (за исключением больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ). У пациентов с ХОБЛ, равно как и у больных ТЛ, уровень лимфоцитов с хромосомными нарушениями выше, чем у здоровых добровольцев, однако только за счет числовых аберраций хромосом при отсутствии выраженных отклонений со стороны активности ДНК-репаративных процессов, что указывает на специфический характер цитопатического действия возбудителя туберкулезной инфекции.

Известно, что при апоптозе мембрана иммуноцитов утрачивает ворсинчатость и образует пузыревидные вздутия, что возможно только в условиях повышенной текучести мембраны. В связи с этим нами была проведена оценка микровязкостных свойств цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов у больных ТЛ до начала химиотерапии и у пациентов с ХОБЛ в фазу обострения с использованием метода флуоресцентного зондирования.

В результате проведенных исследований были получены достоверные данные, позволяющие судить о нарушении микровязкости липидного бислоя мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных ТЛ и ХОБЛ. Так, проведенное спектрофлуориметрическое исследование цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов крови позволило установить достоверное увеличение коэффициентов эксимеризации пирена I₄₇₀/I₃₇₀ и I₄₇₀/I₃₉₀ при длинах волн возбуждающего света (л) 285 нм и 340 нм во всех группах больных ТЛ до лечения (также как и у пациентов с ХОБЛ) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.

Зарегистрированное увеличение коэффициентов эксимеризации пирена у больных ТЛ показывает снижение микровязкости мембраны и/или увеличение ее гидрофобного объема как в зоне белок-липидных контактов, оцениваемой при длине волны возбуждающего света 285 нм, так и в общем липидном бислое (л=340 нм) [Добрецов Г.Е., 1989; Дунаева А.Н. и соавт., 1990]. Повышение текучести мембраны мононуклеаров крови у пациентов с ТЛ, видимо, связано с модификацией ее фосфолипидного спектра в сторону увеличения пула легкоокисляемых фракций липидов, характеризующихся высоким содержанием ненасыщенных жирнокислотных остатков [Кузьмичева Л.В. и соавт., 2005].

Известно, что изменение микровязкости мембраны сопровождается перестройкой сети мембранных белков и приводит к повышению подвижности фосфолипидных молекул [Горошинская И.А. и соавт., 1999; Новицкий В.В. и соавт., 2005]. Данный факт играет важную роль в апоптозе. Одним из этапов реализации программы апоптоза является образование апоптотических телец. По всей видимости, без увеличения текучести мембраны изгибание плазматической мембраны и формирование апоптотических телец невозможно. Кроме этого, при снижении вязкости мембраны устраняется асимметрия фосфолипидов, характеризующаяся переходом фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю поверхность мембраны [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006]. Важная роль свойств мембраны в инициации клеточной гибели подтверждается данными ковариационного анализа, который показал статистически достоверную связь между микровязкостью мембраны и активностью апоптоза лимфоцитов (у больных фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ) и моноцитов (при инфильтративном ЛЧ ТЛ) (табл. 2, 3).

Наличие изменений показателей флуоресценции пирена в мембране лимфоцитов и моноцитов, а также достаточно похожая картина нарушений при ТЛ и ХОБЛ указывает на их типовой характер. Таким образом, изменения параметров флуоресценции липотропного зонда пирен в мембране лимфоцитов и моноцитов не являются специфичными для туберкулезного процесса, не зависят от вида клеток, формы заболевания, устойчивости возбудителя инфекции к действию химиопрепаратов и указывают на снижение микровязкости мембраны, необходимое для реализации апоптоза.

Основными и важнейшими компонентами клеточных мембран являются фосфолипиды. Липиды мембран формируют среду для функционирования мембранных белков, принимающих в ней нативную конформацию [Хышиктуев Б.С. и соавт., 1999]. В связи с этим в настоящей работе было проведено исследование фосфолипидного спектра плазматической мембраны моноцитов и лимфоцитов у больных ТЛ.

В ходе исследований были получены фактические данные, подтверждающие наличие выраженной дезорганизации мембраны мононуклеарных клеток крови у больных ЛЧ ТЛ и ЛУ ТЛ. В частности, у больных ТЛ до начала терапевтических мероприятий показаны изменения абсолютного и процентного соотношения отдельных фракций фосфолипидов на фоне нормального их суммарного содержания. Так, у больных ТЛ было обнаружено снижение количества сфингомиелина (СФМ), фосфатидилхолина (ФХ) и повышение содержания фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в плазматической мембране мононуклеаров крови относительно аналогичных показателей у здоровых доноров. Данные изменения были наиболее выраженными при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ.

Изменения фосфолипидного состава мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных ХОБЛ в целом были аналогичны таковым при ТЛ, что свидетельствует об общности механизмов структурной модификации цитоплазматической мембраны при воспалении легких. Между тем, в период обострения ХОБЛ отмечалось достоверное снижение как абсолютного, так и процентного содержания холестерина (ХС) и тенденция к снижению отношения ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов. В отличие от больных ХОБЛ у всех пациентов с ТЛ в мембране клеток имело место достоверное повышение процентного содержания ХС и снижение концентрации жирных кислот (ЖК) в сравнении со здоровыми добровольцами. Все формы ЛУ ТЛ и фиброзно-кавернозный ЛЧ ТЛ сопровождались дополнительным снижением содержания ЭХС в плазматической мембране мононуклеаров крови. Абсолютное содержание ХС и ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов возрастало при всех вариантах ЛУ ТЛ, однако при ЛЧ ТЛ было в пределах нормы.