Количественный прогностический мониторинг эффективности радиотерапии злокачественных опухолей (экспериментальные исследования)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное Учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Количественный прогностический мониторинг эффективности радиотерапии злокачественных опухолей (экспериментальные исследования)

14.00.14. - онкология

Григорьева Елена Юрьевна

Москва 2009

Работа выполнена в Государственном Учрежлении Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные консультанты: доктор биологических наук Р.А. Спрышкова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Ю.Барышников;

доктор биологических наук С.Е.Ульяненко;

доктор химических наук В.Н.Кулаков.

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗСР РФ.

Защита диссертации состоится 2009г. на заседании специализированного совета (Д.001.17.01) ГУ Россицского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан 2009г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин.

Характеристика работы

Актуальность проблемы. Современная онкология располагает большим арсеналом средств, позволяющих в зависимости от гистологии, темпов роста опухоли, иммунологического и гормонального статусов выбрать оптимальные способы лечения злокачественных новообразований. Среди этих способов одним из основных является лучевое лечение. Примерно 70% от общего числа больных с онкологическими заболеваниями назначают лучевую терапию либо в виде самостоятельного курса лечения, либо в сочетании с другими методами лечения.

Эффективность лучевой терапии во многом зависит от возможности раннего прогнозирования реакции опухоли на воздействие. Важным аспектом проведения терапии является также наличие методов, способных обеспечить оптимальное индивидуальное планирование и контроль ее проведения. Кроме того, для выработки оптимального индивидуального плана лечения злокачественных опухолей и коррекции ранее намеченной схемы в процессе курса терапии большое значение имеет возможность ранней оценки реакции опухоли на облучение. Однако в клинической практике нет метода, с помощью которого можно было бы быстро получить надежную количественную информацию.

Разработка методов прогнозирования на основе цитокинетических параметров (общего числа клеток, фракции роста, распределения клеток по фазам клеточного цикла), а также таких биологических параметров, как скорость пролиферации, репопуляции, фракции выживших клеток и др., позволяющих осуществлять количественную оценку и прогнозирование ответа опухоли на воздействие в экспериментальной радиобиологии, в клинических условиях затруднено в силу различных причин. Большая вариабельность данных параметров даже для опухолей одного и того же типа, а также необходимость частых биопсий в процессе лечения практически не позволяют использовать эти важные параметры для раннего прогноза реакции опухоли. Применяющиеся в клинике рентгенологические, томографические, эндоскопические и другие методы позволяют получить ответ о реакции опухоли на терапевтическое воздействие лишь через некоторое время после курса лечения, когда оптимальное индивидуальное планирование уже исключено. Таким образом, терапевтическое воздействие на организм больного продолжают даже тогда, когда оно не приносит никакого положительного эффекта (в силу радио - или химиорезистентности опухоли), но приводит к тяжелым побочным эффектам. В этой связи создание, в первую очередь, раннего, простого, нетравматичного, информативного метода получения надежных количественных параметров, характеризующих ответ опухоли на воздействие, является актуальной задачей современной онкологии. Мы считаем весьма перспективным для оценки эффективности лучевой терапии использование радионуклидных методов. В частности, применяя йод-дезоксиуридин (ЙДУР), меченный гамма-излучающими изотопами йода, можно с помощью внешних детекторов неинвазивно проследить за включением радиоактивной метки (РМ) в опухоль и оценить уровень синтеза ДНК в ответ на противоопухолевое воздействие. Основанием для использования скорости выведения ЙДУР из опухоли в качестве прогностического показателя эффективности терапии послужили особенности фармакокинетики ЙДУР, который включается в ДНК, особенно, активно пролиферирующих клеток, претерпевает в основном все биохимические превращения в течение 15 минут после введения и покидает эти клетки только после их гибели. Измерение включения ЙДУР в ДНК опухоли, т.е. количественная оценка пролиферативной активности опухоли неинвазивным способом, может стать инструментом для подбора оптимальных схем лечения опухолевых больных и обеспечить более раннюю и, возможно, более точную оценку реакции опухоли на проводимую терапию, а также предоставить информацию для составления клинического прогноза.

Цель настоящей работы - повышение эффективности лучевой терапии на основе индивидуального количественного прогнозирования реакции опухоли на противоопухолевое воздействие.

Задачами работы являются:

1. Оценка эффективности лучевой терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.

- оценка уровня потери, включившегося ¹²⁵I-ЙДУР в опухолевые клетки (перевиваемая опухоль мышей меланома В-16 и культура клеток HеLа), после рентгеновского облучения;

- оценка влияния локального рентгеновского излучения на уровень включения в опухоль (перевиваемые опухоли мышей меланома В-16 и саркома-180) ¹²⁵I-ЙДУР после ее облучения.

2. Разработка параметров количественной оценки реакции опухоли индивидуального животного на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР.

Для этого:

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения ¹²⁵I-ЙДУР из зоны опухоли при различных дозах ее локального рентгеновского облучения, облучения тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в присутствии введенного Na₂¹⁰B₁₂H₁₁SH (¹⁰BSH);

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения из зоны опухоли ¹³¹I-ЙДУР, введенного до облучения опухоли, и ¹²⁵I-ЙДУР, введенного тому же животному после рентгеновского облучения опухоли;

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения ¹²⁵I-Na⁺I^- и ¹²⁵I-ЙДУР из зоны опухоли после ее локального облучения в различных дозах рентгеновского излучения;

- разработать количественные параметры, характеризующие включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток на основе анализа кинетических кривых выведения радиоактивной метки ЙДУР из меланомы В-16 и саркомы-180;

- определить количественную зависимость между изменением параметров включения ЙДУР в опухоль и уровнем изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении, при облучении тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в присутствии введенного ¹⁰BSH;

3. Оценка эффективности использования разработанной модели для раннего индивидуального неинвазивного мониторинга лучевой терапии опухоли.

Для этого:

- оценить противоопухолевый эффект (меланома В-16 и саркома-180) действия рентгеновского излучения, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в присутствии введенного ¹⁰BSH;

- определить количественную взаимосвязь между разработанными параметрами включения ЙДУР, параметрами роста опухоли и дозой облучения опухоли для отдельных животных;

- разработать схему оценки индивидуального количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ЙДУР.

Научная новизна

Все исследования выполнены в нашей стране впервые, часть исследований выполнена впервые в мире.

· Разработаны критерии ранней неинвазивной оценки эффективности лучевой терапии индивидуальных опухолей на основе параметров, характеризующих скорость выведения из опухоли ¹³¹I-ЙДУР, введенного в организм до облучения опухоли, и ¹²⁵I-ЙДУР, введенного тому же животному после облучения опухоли.

· Определены количественные параметры зависимости включения ЙДУР в опухолевые клетки от уровня изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении в различных дозах, а также при облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии с ¹⁰BSH - W1(d/0).

· Показано, что отношения угловых коэффициентов (К) начального участка (до 48 часов) кривых, построенных по регистрируемой над зоной опухоли радиоактивности после введения ¹³¹I-ЙДУР до облучения и ¹²⁵I-ЙДУР после облучения опухоли одному и тому же животному, коррелируют с параметрами роста опухоли.

· Определены функциональные зависимости между параметрами выведения радиоактивной метки ЙДУР (К), параметрами роста опухоли и дозой облучения для отдельных животных.

· Для оценки биологической эффективности разработаны в наших экспериментах и применены биологические критерии:

- параметр К, рассчитываемый по скорости выведения из опухоли радиоактивной метки введенного в организм ЙДУР, регистрируемой внешним детектором над зоной опухоли и функционально связанный с показателем W1(d/0), характеризующим зависимый от дозы облучения уровень синтеза ДНК в опухоли после ее облучения;

- параметр М, характеризующий зависящую от дозы долю объёма опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность после облучения. Он вычисляется на основании анализа закономерностей роста опухоли в ответ на облучение, позволяет нетравматично получать оценку реакции опухоли на облучение и заменить во многих случаях сложный метод изучения выжившей после облучения фракции опухоли клеток.

Научно-практическая значимость работы

Разработана система индивидуального количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченного гамма-излучающими радиоактивными изотопами ЙДУР, что позволяет неинвазивно прогнозировать эффективность как лучевого воздействия на опухоль, так и других видов консервативного лечения в онкологии в течение первых двух суток.

Практическая значимость экспериментальных результатов заключается в возможности получить дополнительные сведения об индивидуальной чувствительности опухоли на терапевтическое лучевое воздействие с элементом предсказания дальнейшего развития опухоли, и, соответственно, позволит более точно выбирать для каждого пациента оптимальный режим облучения. Результаты данного исследования могут быть инструментом, дающим возможность обеспечить более раннее распознавание ответа опухоли на проводимую терапию, то есть позволяют количественно оценить индивидуальную чувствительность опухоли и прогнозировать эффективность лучевого воздействия на нее через 48 часов после облучения

Принципиально важно отметить, что разработанная и предлагаемая методика может быть использована не только при оценке лучевого воздействия, но и при других видах противоопухолевой терапии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и докладывались на следующих международных и отечественных конференциях и совещаниях:

Х1 International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine (Riga, 2-4 October, 1990); Всероссийский съезд онкологов (Ростов-на-Дону, 10-12 октября 1995); 2-я Национальная конференция «Медицинская физика-95 с международным участием» (г. Москва, 4-8 декабря, 1995); совещание с международным участием «Применение нейтронов ядерных реакторов в лучевой терапии, состояние и перспективы» (г. Обнинск, 17-19 октября, 1995); Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (Zurich, Switzerland, 4-7 September, 1996); Сателлитный симпозиум «Актуальные вопросы радиобиологии нейтронов и нейтронной терапии» в рамках 3 Съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Обнинск, 16 октября, 1997; Международный коллоквиум по проблеме INTAS (Москва, ИОНХ РАН, 4 июня 1998); Международное совещание по проблеме INTAS-96-1114 (г.Обнинск, 14 ноября 1998); Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A.); ХY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, «Научная сессия по проектам INTAS» (25-29 мая 1998г., Санкт-Петербург); Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium (April 17-19, 2002, The Department of Radiology and Radiological Sciences of Vanderbilt University Medical Center, Nashvilli, TN); Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics (22-26.09 2004, Zvenigorod, Russia; III-й съезд онкологов и радиологов СНГ (Минск, 24-28.05 2004); Семинар «Радионуклидные технологии в физике и медицине» (Москва, ГУ РНЦ «Курчатовский институт», 28 октября, 2004г); IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 16-18 марта, 2005); Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 19-20 апреля, 2005); VI Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 24-26 марта, 2007).

Отдельные разделы настоящих исследований вошли в работы, отмеченные премией имени И.В. Курчатова за лучшую научную работу 2004 года и премией ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в области клинической онкологии за лучшую прикладную научную работу (2005 г.).

Личный вклад автора состоял в постановке целей и задач исследования, выполнении основного обьема экспериментальной работы. Автором проведены обработка и анализ полученных результатов, формулировка общих выводов и основных положений, выносимых на защиту.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 210 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и техники экспериментов, трех глав, содержащих собственные экспериментальные данные с обсуждением их результатов, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 267 наименований отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками, фотографиями и 11 таблицами.

Основное содержание работы

Во «Введении» обоснованы актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи работы. Освещены научная новизна и практическая значимость результатов исследований.

В главе «Обзор литературы» обобщены и проанализированы литературные данные по теме «Оценка эффективности лучевой терапии опухолей».

Глава «Материалы и методы исследований» состоит из 8 разделов.

2.1. Постановка экспериментов. В разделе описаны два подхода для оценки эффективности лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР, основанные на метаболическом поведении ЙДУР: а) Оценка уровня потери из опухоли радиоактивного ЙДУР, включившегося в ДНК опухоли. б) Оценка уровня включения радиоактивного ЙДУР в ДНК опухоли. 2.2. Экспериментальные животные и опухолевые модели. Эксперименты по оценке ответа опухоли на облучение выполнены на мышах линии С57BL/6 с перевивной опухолью меланома В-16 и на беспородных мышах SHK с перевивной опухолью саркома-180. Средняя масса животных - 20 г. Возраст животных 2 3 месяца. Суспензию опухолевых клеток перевивали внутримышечно в правую заднюю лапку животного в объеме 0,1мл, который содержал 3,5 4 млн. клеток. По достижении опухолью объема 700900 мм3 (10-11 день после перевивки меланомы и 8-9 день после перевивки саркомы) проводили ее локальное облучение. Каждая из групп, сформированных для экспериментальных исследований, включала по 10 12 животных с опухолями приблизительно равных объемов. Объемы опухолей вычисляли как произведение константы 0,56 и размеров трех взаимно перпендикулярных осей эллипсоида. Для каждой временной точки t объем опухоли (Vt) нормализовали к ее объему на момент облучения (V₀) и строили кривые V_t/V₀ в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). Монослой клеток HeLa выращивали в питательной среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, согласно стандартным методикам работы с клеточными штаммами. Сформированные экспериментальные группы составляли по 5-6 флаконов на точку. Каждый флакон содержал 100000 клеток в 2 мл среды. 2.3. Используемые радиоизотопные маркеры. В исследованиях применяли меченый 5-йод-2'-дезоксиуридин (ЙДУР). Для радиоактивной маркировки ЙДУР использовали как ¹²⁵I, так и ¹³¹I. Период полураспада ¹²⁵I - 60 дней, он излучает гамма-кванты с сопровождаемым характеристическим рентгеновским излучением в диапазоне энергий 27 32 КэВ, то есть является источником мягкого фотонного излучения и электронов Оже. Период полураспада ¹³¹I составляет 8 дней, он также является гамма-излучающим изотопом с энергией гамма-квантов 0,364 МэВ. Периоды полураспада ¹²⁵I и ¹³¹I учитывались при обработке результатов исследований. Количество введенного внутрибрюшинно ЙДУР на мышь составляло 7,1 7,3 мкг в объеме 0,2 мл. Выравнивание концентраций ЙДУР в рабочих растворах проводили добавлением рассчитанного количества нерадиоактивного ЙДУР. Общая величина радиоактивности в расчете на одно животное не превышала 0,7 0,9 МБк. Такая активность дает возможность с достаточной точностью регистрировать уровень радиоактивности в зоне опухоли и при этом не вызывает радиотоксичности. Для снижения включения ¹²⁵I и ¹³¹I в щитовидную железу и уменьшения тканевого потребления меченого йодида, образующегося в процессе метаболизма радиоактивного ЙДУР, за 3 дня до введения препарата и до окончания эксперимента в питьевую воду животным добавляли 1% раствор NaI. 2.4. Облучение опухолей. Локальное облучение опухоли проводили тремя видами излучения: рентгеновским, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH, предварительно введенным в организм мышей. Облучение опухолей рентгеновским излучением в диапазоне доз 2 40 Гр проводили на установке «Стабилипан» (мощность дозы 3,7 Гр в минуту, V=200 кВ, I=18 мА, фильтр 2мм Al). Животных неподвижно фиксировали на подложке из оргстекла толщиной 6 мм. Экранировали мышей свинцовым коллиматором толщиной 10 20 мм с отверстием под зоной опухоли, добиваясь тем самым облучения только опухолевой области. Погрешность в определении дозы облучения не превышала 3%. Для контроля дозы, подводимой на опухоль, использовали термолюминисцентные дозиметры ТLD-100. Неравномерность по дозе в пределах объема опухоли и поглощения в нем излучения не превышала 6%. Облучение тепловыми нейтронами проводили на касательном пучке нейтронов реактора ИР-8 РНЦ ФГУ «Курчатовский институт». Мощность флюенса тепловых нейтронов составляла 1,2·108 н/cм² сек. Примесь промежуточных и быстрых нейтронов не превышала 8% от полной мощности флюенса. Вклад фотонного излучения в полную поглощенную дозу был не больше 1,2%. За 11,5-12 ч до облучения нейтронами животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора ¹⁰BSH в дозе 100 мкг/г массы мыши. Животных-опухоленосителей без анестезии помещали в тефлоновую клетку, которая ограничивала движение животных, но не препятствовала физиологическим отправлениям и приему пищи. Лапку, несущую опухоль, оттягивали, фиксировали и проводили локальное облучение опухоли в диапазоне следующих доз: тепловыми нейтронами - 0,51 8,94 Гр, тепловыми нейтронами в сочетании с ¹⁰BSH - 0,21 9,5 Гр. Поскольку из-за невысокой мощности флюенса облучение тепловыми нейтронами было растянуто во времени, то для каждой группы животных или отдельного животного, облучаемых в данный день, использовали свою группу контрольных животных, по отношению к которым и проводили в дальнейшем необходимые расчеты. 2.5. Радиометрия и дозиметрия. Образцы с культурой клеток HеLа для радиометрических измерений готовили следующим образом: меченую среду и 3-х кратные смывные воды собирали во флакон, затем к радиоактивным клеткам добавляли 2 мл свежей среды и вновь проводили радиометрические измерения как флаконов с клетками, включившими ¹²⁵I-ЙДУР, в свежей нерадиоактивной среде, так и флаконов с радиоактивной средой и промывками. Поскольку при замене среды в ней могут содержаться меченые клетки, то для сбора так называемых «плавающих клеток» проводили центрифугирование и фильтрацию среды. Радиометрию зоны опухоли и аналогичного участка интактной лапки животного проводили «in vivo» с помощью детектора со сцинтилляционным кристаллом NaI[TL], многоканального анализатора типа BZ-27 (фирма «Бертольд»), используя набор свинцовых экранов с отверстиями различных диаметров и столика, для фиксации животных. Расстояние от детектора до опухоли рассчитывали, основываясь на двух основных требованиях: 1. необходимость превышения результатов измерений над фоном не менее чем в 45 раз; 2. максимальное уменьшение влияния геометрических факторов на результаты радиометрии. Исходя из вышесказанного, расстояние от детектора до опухоли составляло 8090 мм. Тело животного экранировали свинцовой пластиной толщиной 1020 мм с отверстием, соответствующим размеру опухоли. Для проверки точности показаний детектора (калибровки) радиоактивность эталонного образца измеряли в различных точках столика для фиксации животных. Положение точки над центром детектора определяли с помощью центратора, соединенного с корпусом детектора с точностью 1 мм. Учитывая, что размер эталонного образца (0,5см³) много меньше его расстояния до детектора, различия показаний по отношению к центральной точке должны соответствовать закону обратных квадратов расстояний от них до детектора (статистическая ошибка 5%). При проведении экспериментов животное фиксировали по отношению к детектору так, чтобы зона опухоли не попадала в область, где это условие нарушается. Использование многоканального анализатора позволяло одновременно проводить измерения двух различающихся по энергиям радиоизотопов в двух независимых окнах, настроенных на максимальное отношение образец/фон. Измерение радиоактивного фона проводилось перед началом радиометрии опухоли. Время радиометрии составляло 1мин. По мере уменьшения разницы между значением уровня радиоактивности, измеряемой в зоне опухоли, и значением фона время измерения увеличивали в соответствии с таблицей Белла, чтобы погрешность измерения за счет этого фактора не превышала 10 %. Радиоактивность «N» (имп/мин) измеряли через 0,25 ч, 3 ч, 6 ч, 10 ч, 24 ч и далее ежесуточно до 240 ч от момента введения ЙДУР. Данные (N_t), полученные для каждой временной точки t, после вычитания фона и поправки на распад выражали как процент оставшейся ко времени t радиоактивности от фиксируемой в зоне опухоли через 0,25 ч после введения меченого ЙДУР (N _0,25). Дозиметрия. Поглощенную дозу фотонного излучения измеряли термолюминисцентными дозиметрами ТLD-100. Отклонения от средней дозы не превышали 15%. Поглощенную дозу от тепловых нейтронов контролировали методом нейтронно-радиационной дозиметрии, разработанным в совместных исследованиях с ГУ РНЦ «Курчатовский институт». Средняя мощность дозы в нативной ткани (без введения ¹⁰BSH) cоставляла 0,25 Гр/ч. Суммарная поглощенная доза в опухоли определялась по трем ядерным реакциям, дающим основной вклад в поглощенную дозу при взаимодействии тепловых нейтронов с нуклидами биологической ткани - ¹H (n,г)2H; ¹⁴N (n,p)¹⁴C; ¹⁰B (n,Ь)⁷Li - и составила 95-97%. При этом, вклад в дозу от нейтронно-захватных реакций на нативном ¹⁰B составлял примерно 4%, на ¹H - 30%, на ¹⁴N - 60-65%. Доза от реакции на ¹⁰B, введенном с препаратом ¹⁰BSH, составляла около 25% общей поглощенной дозы. 2.6. Параметры изменения роста опухоли. Для оценки изменения роста опухоли в течение всего эксперимента ежедневно проводили измерение трех взаимоперпендикулярных диаметров опухоли и, принимая форму опухолей эллипсоидальной, их объемы вычисляли по формуле V= р/6·d₁·d₂·d₃, где d₁, d₂, d₃ - линейные размеры трех осей эллипсоида. Ошибка при измерении линейных размеров составляла 2 мм. Для каждой временной точки t объем опухоли (V_t) нормализовали к ее объему на момент облучения (V₀) и строили кривые V_t/V₀ в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). По этим кривым вычисляли параметры: М = [ V_t/V₀ (D)]/[ V_t/V₀ (0)], время задержки роста опухоли (Т_(з)) - время дорастания объема опухоли до своего первоначального значения в момент облучения, и время дорастания ее до двойного объема (Т_(дор)) по сравнению с Vo. Параметры определяли графически по кривым изменения V_t/V₀ от t для каждого животного. 2.7. Включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Выделение ДНК из опухолевых клеток осуществляли по методу Шмидта и Тангаузера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом А.С. Спирина. Активность фракций измеряли в пробирках на гамма-спектрометре MAG-510 (фирма «Бертольд»). Измеренная радиоактивность выражалась как процент от введенной дозы на грамм ткани. На все результаты радиометрических измерений делали поправки на радиоактивный распад изотопа после его введения животным. 2.8. Методы оценки экспериментальных данных. Поскольку доверительные оценки как средних значений, так и дисперсий основаны на гипотезе нормальности закона распределения случайных ошибок измерения, мы проверяли нормальность распределения используя критерий К, Пирсона ² (хи-квадрат) и методом оценки центральных моментов третьего и четвертого порядков М₃ и М₄. Показателем асимметрии A_S считали отношение центрального момента третьего порядка к кубу среднего квадратического отклонения. A_S = (p * a ³) / n * ³ (a - отклонение вариант от средней арифметической, p - повторяемость отдельных вариант). Величина этого показателя колеблется от 0 до 1; при совершенно симметричных распределениях этот коэффициент равен 0; асимметрия считается незначительной, если A_S 0,25; при А_S 0,5 скошенность распределения оказывается уже значительной. Величину эксцесса E_X (E_X = (p * a ⁴) / n * ⁴ - 3) измеряли как центральный момент четвертого порядка, отнесенный к среднему квадратическому отклонению в четвертой степени минус 3 (для строго симметричных нормальных распределений показатель эксцесса равен 3). При Е_X 0,2 эксцесс практически отсутствует. Если Е_X 0.5, но 1, эксцесс считается уже заметным. Крайняя степень отрицательного эксцесса равна -2, что указывает на наличие двух вариационнах рядов. Частотная гистограмма распределения значений N_t/N_0.25 у контрольной группы животных показала, что ряд N_t/N_0.25 подчиняется закону нормальных распределений. Аналогичная ситуация характерна и для распределения относительных объемов опухолей V_t/V₀, поэтому выбор способа усреднения не принципиален. Достоверность различий, наблюдаемых между двумя средними, производили на основе нормирования, то есть по оценке критерия достоверности t или по сравнению с доверительными границами случайных колебаний, среднюю квадратическую ошибку разности между средними арифметическими вычисляли по формулам в зависимости от величины сравниваемых выборок, исходя из 95% уровня доверительной вероятности. Для сравнительной оценки выборочных данных небольшого объема использовали непараметрический критерий статистической значимости различий (критерий Уайта), не требующий нормальности распределения исследуемых рядов. Динамику связи между двумя признаками характеризовали с помощью регрессионного анализа. Для построения кривых регрессий и получения функций регрессий применяли метод наименьших квадратов. Доверительная зона регрессии определяла ошибку нахождения прогнозируемой величины при 95% уровне значимости. Принимая во внимание, что, как правило, линия регрессии - нелинейна и коэффициент регрессии не может служить ее надежным показателем, степень зависимости между переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции r. Приняли следующую градацию r: от 0,1 до 0,5 - слабая связь между признаками, от 0,5 до 0,7 - средняя степень сопряженности, свыше 0,7 - сильная. r = 1 означает уже не коррелятивную, а функциональную связь между переменными. Достоверность коэффициента корреляции определяли показателем преобразования Фишера. Площади под кривыми выведения радиоактивной метки из зоны опухоли рассчитывали аналитически. Для этого проводили анализ эмпирических значений и выбирали аппроксимирующую функцию с наилучшим приближением. После определения параметров искомой функции вычисляли ее определенный интеграл. Пределы интегрирования задавались от 0,25 ч до 72 ч. Чтобы охарактеризовать изменение уровня накопления меченого соединения в опухоли при ее локальном облучении различными дозами в сравнении с необлученными, полученные значения площадей (S_d) нормировали на значения площадей (S₀) в контрольных группах (S_d / S₀). Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов.

Глава 3. «Кинетика выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина» посвящена анализу различных подходов для оценки эффективности лучевой терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.

3.1. Выведение 5-йод-2'-дезоксиуридина из опухолевой и здоровой ткани. Способность 5-йод-2'-дезоксиуридина встраиваться в ДНК, а не в другие биологические макромолекулы, является определяющим фактором для использования этого соединения как маркера реакции опухоли на противоопухолевое воздействие. После введения ЙДУР накопление соединения в опухолевой ткани наблюдается на протяжении 15 - 90 мин в зависимости от метода введения и достигает 12 % от радиоактивности, измеренной во всем теле. Уже в первые сутки существует преимущественное накопление ЙДУР в опухоли, в сравнении с различными органами и тканями животных. Согласно результатам радиометрических измерений in vitro, коэффициент дифференциального накопления (КДН) радиоактивного ЙДУР для различных органов и тканей к 30 ч убывает согласно следующей последовательности: опухоль - 29 %, кишечник - 13 %, селезенка - 9 ч11 %, кость бедренная - 5 ч 7 %, кожа - 6,5 ч 4 %, кровь - 5 ч 6 %, почки - 3,5 %, печень - 1,5ч2 %, жир - 1ч2 %, мышцы - 1,5 %. При этом, через 15 мин после введения в организм 90 - 94 % находящегося в опухоли ЙДУР связано с ее ДНК, где он удерживается при медленном клиренсе в течение 1 - 4 суток.

Для определения количества ¹²⁵I-ЙДУР, включающегося в ДНК при облучении опухолей, была выделена ДНК опухолевых клеток. Радиоактивность образца ДНК выражали как % от дозы на 1 г опухолевой ткани и сравнивали со значениями общей радиоактивности в первоначальной ткани. В таблице 1 приведены данные включения ¹²⁵I-ЙДУР в ДНК необлученных опухолей для 24 ч, 48 ч, 96 ч от момента введения ¹²⁵I ЙДУР (количество образцов на точку - 6). Оставшиеся 7% приходятся на долю меченых метаболитов (преимущественно йодида и йодированных белков).

Таблица 1 Включение ¹²⁵I ЙДУР в ДНК опухолевой ткани

На рисунке 1 представлены результаты измерений внешним детектором опухоли (меланома В-16) и аналогичной зоны коллатеральной безопухолевой лапки животного. Кривые зависимости N_t/N_0,5 от t даны для групп однородных животных и представляют собой динамику отношений уровней РМ в импульсах в минуту в момент времени t (N_t) и через 0,5 мин после введения ЙДУР, меченного ¹²⁵I (N_0,5). Измеренная радиоактивность приведена к общему количеству введенной РМ.

Кривая 2 изменения РМ зоны интактной лапки животного не показывает накопления РМ, и спустя уже 10 ч значение РМ уменьшается на порядок. Зарегистрированная в интактной лапке радиоактивность преимущественно локализована в ДНК красного костного мозга бедра, что и обусловливает медленный спад кривой в дальнейшем. Кривая 1 изменения радиоактивности опухоли характеризуется 4-мя выраженными участками: быстрое увеличение РМ, спад, значительное замедление скорости выведения - «плато», затем некоторое увеличение скорости выведения. В пределах первых суток на фоне включенного в ДНК опухолевых клеток ЙДУР происходит спад радиоактивности в зоне опухоли, который обусловлен в первую очередь потерей меченого материала за счет выведения из организма радиоактивных продуктов метаболизма ЙДУР, не включившихся в ДНК, главным образом, быстро экскретируемого почками йодида. Возникающее затем между 24 ч и 80 ч «плато» отражает уровень включенного в ДНК опухолевых клеток ЙДУР и остаточной радиоактивности выводимого йодида и может характеризовать количество ДНК-синтезирующих клеток. Дальнейший медленный спад кривой (80 часов и далее) является следствием суммы нескольких процессов: «вымывание» радиоактивных метаболитов, репарация ДНК с последующим дейодированием ЙДУР, клеточная смерть, приводящая к катаболизму ДНК с соответствующим высвобождением РМ. Реутилизация ЙДУР во время нормального клеточного цикла по данным Lee D. составляет менее 10% и, следовательно, уровень ЙДУР, вступившего в повторный цикл не должен привносить значительную ошибку в оценку фармакокинетики включения и задержки ЙДУР. Оценить эффективность лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР возможно с помощью двух подходов.

При первом подходе - облучить опухоль через несколько суток после введения в организм радиоактивного ЙДУР, когда РМ в опухоли практически вся связана с ЙДУР, включенным в ДНК и оценить уровень потери ЙДУР, включившегося в опухолевые клетки. Потеря радиоактивности в опухоли после ее облучения может служить количественной мерой гибели опухолевых клеток в ответ на противоопухолевое воздействие. При втором подходе радиоактивный ЙДУР следует ввести в организм после облучения опухоли и далее регистрировать уровень включения РМ в опухоль. Снижение радиоактивности в зоне опухоли в ответ на облучение будет характеризовать уровень подавления синтеза ДНК.

Рисунок 1. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли (1) и аналогичной зоной интактной лапки (2) у мышей линии С57Bl/6 с привитой меланомой В-16 после введения 125I-ЙДУР; N_t/N_0,5 /РМ - отношение радиоактивности (имп. / мин), измеренной в момент времени t к радиоактивности через 0,5 мин после введения ¹²⁵I-ЙДУР и приведенное к общему количеству введенной РМ.

3.2. Оценка уровня потери из опухоли радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина, включившегося в опухоль до облучения. Принципиальная возможность оценки реакции опухоли на лучевое воздействие с помощью ¹²⁵I-ЙДУР, включившегося в клетки до облучения была нами показана на культуре клеток HeLa и на перевиваемой опухоли меланома В-16. 3.2.1. Культура клеток HeLa. Во флаконы с культурой клеток добавляли содержащую ¹²⁵I-ЙДУР среду из расчета 74 кБк /мл (148 КБк на флакон) и инкубировали при температуре +37°С. Спустя 44 ч - 46 ч проводили радиометрические измерения, затем клетки подвергали рентгеновскому облучению с последующей ежедневной радиометрией до 200 часов от момента мечения клеток ЙДУР-м. Облучение клеток, включивших ¹²⁵I-ЙДУР, проводили различными дозами рентгеновского излучения (5 Гр, 10 Гр, 30 Гр). Данные радиометрических измерений после радиационного воздействия приводили к измеренной перед облучением образцов радиоактивности, принятой за 100%. В этом случае по снижению радиоактивности облученных клеток можно было оценить степень поражения, и рассчитать число погибших клеток. Однако в проведенных нами исследованиях дисперсионный анализ показал, что различия между данными контрольной и опытных групп недостоверны. 3.2.2. Меланома В-16. Оценку потери радиоактивного ЙДУР из опухоли после облучения мы повторили на привитой мышам линии С57 BL/6 меланомы В-16. Опухоли облучали локально рентгеновским излучением в дозах 5, 10, 20, 30 Гр через 5 сут после введения ¹²⁵I-ЙДУР. Снижение уровня радиоактивности можно было заметить через 1-2 суток после облучения опухолей, однако, как и в экспериментах с культурой клеток HeLa различия между данными опытных и контрольных групп не являются достоверными (Табл.2).

Можно заключить, что полученные нами результаты, при этом подходе, не позволяют достоверно судить о различиях в выведении РМ из опухоли в контрольных и облученных группах раньше чем через 6 - 9 дней после введения ЙДУР, что не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие. Результаты потери радиоактивности в опухоли после ее облучения несколько занижены, то есть занижено число погибших клеток, а, следовательно, уменьшена разница между уровнями радиоактивности в контроле и опыте. Причина этого заключается в том, что РМ, высвобождающаяся из погибших раковых клеток, в силу ряда факторов (поглощение ее в этом месте макрофагами, задержка в некротических зонах) не всегда быстро удаляется из места гибели клетки, что и приводит к искажению результатов анализа.

Таблица 2 Значения критерия F для разницы в дисперсиях результатов измерений ¹²⁵I-ЙДУР в клетках HeLa и меланоме В-16 при рентгеновском облучении

3.3. Оценка уровня включения радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина в опухоль. Наиболее адекватна разработке быстрого, чувствительного метода in vivo оценки реакции индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие схема, когда опухоль облучают до введения радиоактивного ЙДУР и регистрируют уровень включения РМ в опухоль. При этом наибольший эффект достигается при введении метки в интервале 2 - 4 ч после облучения. В экспериментах использовали две разные по радиочувствительности опухоли: меланома В-16 и саркома-180. Локальное облучение меланомы В-16 проводили различными дозами рентгеновского излучения, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с ¹⁰BSH. Саркому-180 облучали различными дозами только рентгеновского излучения (2 Гр, 10 Гр, 20 Гр ). Динамика изменения отношений уровней радиоактивности в зоне опухоли меланомы В-16 в момент времени t (Nt) и в момент первого измерения t₀ через 15 мин (0,25 ч) после введения ¹²⁵I-ЙДУР (N_0,25) для усредненных по группам однородных животных для различных доз 3-х видов облучения и для рентгеновского облучения саркомы-180 представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли после введения ¹²⁵I-ЙДУР при локальном облучении различными дозами рентгеновского излучения меланомы В-16 (А), саркомы-180 (Б), при локальном облучении меланомы В-16 различными дозами тепловых нейтронов (В) и тепловых нейтронов в сочетании с ¹⁰ВSH (Г); N_t/N_0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения ¹²⁵I-ЙДУР

Форма этих кривых в целом согласуется с метаболическим поведением ЙДУР: как правило, вслед за быстрым снижением радиоактивности в первые двое суток выведение РМ значительно замедляется так, что в интервале между 24 - 48 ч и 70 - 80 ч на кривых возникает плато, после которого скорость выведения метки вновь немного возрастает. В некоторых случаях плато на кривой менее выражено, что особенно характерно для опухолей, облученных в больших дозах. При идентичности формы кривых зависимости N_t/N_0,25 от t у необлученных опухолей и у опухолей, подвергнутых воздействию доз 3-х видов излучения, скорости выведения РМ различаются. При времени t более одних суток различия в скоростях выведения РМ становятся достоверными (табл.3), при этом с увеличением подводимой к опухоли дозы падает уровень оставшейся к этому времени радиоактивности. Также следует обратить внимание на различие параметров кривых N_t/N_0,25 для одной и той же дозы (например 2 Гр) для разных видов излучения. Уровень включения ¹²⁵I-ЙДУР в опухоль на 48 ч составляет по средним данным примерно 14 - 16 % для рентгеновского облучения опухоли, 4,5 - 5 % - для тепловых нейтронов и 3 - 3,5 % - для тепловых нейтронов в сочетании с ¹⁰BSH, что свидетельствует о разнице биологического эффекта трех видов поражающих факторов. Наличие зависимости радиометрических параметров от дозы говорит о достаточной чувствительности данного метода в использовании ЙДУР как маркера ответа опухоли и позволяет предположить возможность использования динамики РМ ЙДУР для установления количественной связи между дозой облучения и пролиферативной активностью индивидуальной опухоли.

Таблица 3 Значения критерия F для разницы в дисперсиях результатов измерений ¹²⁵I-ЙДУР в опухолях необлученных и при их рентгеновском облучении

Таким образом, мы показали возможность оценки эффективности лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР по уровню включения радиоактивного ЙДУР в опухоль, когда ЙДУР вводят в организм после облучения. В отличие от первого подхода, в этом случае достоверно установлена зависимость радиометрических параметров от дозы облучения как для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с ¹⁰BSH, так и для двух различных по радиочувствительности опухолей - меланомы В-16 и саркомы-180. Достоверное различие скоростей выведения ЙДУР из зоны опухоли при локальном воздействии на нее предполагает возможность установления количественной связи между величиной скорости выведения и дозой облучения.

3.4. Сравнительная кинетика выведения ¹²⁵I-ЙДУР и ¹³¹I-ЙДУР при локальном лучевом воздействии на опухоли. Применение ЙДУР, меченного только одним изотопом йода (¹²⁵I), для оценки реакции опухоли на воздействие для одного и того же животного невозможно из-за наложения радиометрических данных. Для того чтобы обойти эту проблему можно дополнительно использовать ЙДУР, меченный ¹³¹I. Одним и тем же животным за 24 ч до облучения ввести ¹³¹I-ЙДУР, при этом уровень измеренной радиоактивности в зоне опухоли будет соответствовать «нормальному» состоянию данной опухоли (контроль). Через 3 ч после облучения ввести ¹²⁵I-ЙДУР, который будет характеризовать реакцию опухоли в ответ на облучение. Прдварительно мы показали, что разница в дисперсиях величин (N_t/N_0.25), для ¹³¹I-ЙДУР и ¹²⁵I-ЙДУР во всех временных точках является недостоверной, т.е. при исследованиях in vivo, массовое число метящего изотопа йода не оказывает влияния на кинетику выведения ЙДУР. На рисунке 3 представлены характерные кривые зависимости N_t/N_0.25 от t для отдельных животных. опухоль неинвазивный лучевой терапия

Рисунок 3. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли у отдельных животных после введения ¹³¹I-ЙДУР до облучения и ¹²⁵I-ЙДУР после локального облучения меланомы В-16, привитой мышам С57Bl/6, рентгеновским излучением в дозе 10 Гр; N_t/N_0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения ЙДУР

Результаты измерений ¹³¹I-ЙДУР и ¹²⁵I-ЙДУР фиксировались в двух независимых каналах многоканального анализатора, соответствующих энергиям этих радиоизотопов. Видно, что параметры кривых выведения РМ ¹³¹I-ЙДУР (до облучения) и ¹²⁵I-ЙДУР (после облучения опухолей дозой 10 Гр) из зоны опухоли существенно различаются даже при наличии вариабельности уровней радиоактивности, которая отражает индивидуальную реакцию опухолей, привитых сингенным животным и связана с различным балансом в них двух независимых процессов: синтезом ДНК и индукцией апоптоза. Проведенный дисперсионный анализ совокупностей параметров этих кривых показал достоверность различий их парных вариант, начиная с 10 ч (F=3,09 при F_крит. =1,56 для p 0,05 и n (количество животных) =25).

На основании полученных данных можно заключить, что применение ЙДУР, меченного двумя различными радиоизотопами йода, позволяет оценить реакцию опухоли на облучение для каждого отдельного животного, то есть индивидуальную реакцию организма. При этом методика прижизненного определения параметров, характеризующих кинетику выведения меченного радиоизотопами йода ЙДУР, при воздействии на опухоль различными дозами облучения обладает удовлетворительной разрешающей способностью.

В главе 4 рассмотрены параметры выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина и Na^{+ 125}I^- и предложена методика оценки реакции опухоли на облучение. Особенности метаболизма ЙДУР указывают на то, что в первые 70 - 80 часов после инъекции этого соединения мы имеем дело с суперпозицией двух основных процессов: выведение продуктов трансформации ЙДУР (главным образом йодида) и включение ЙДУР в опухолевые клетки (что является показателем изменения активности синтеза ДНК опухолевых клеток). Разделение этих процессов, а также определение параметров последнего позволило нам дать количественную оценку изменения синтеза ДНК при противоопухолевом воздействии. 4.1. Сравнение выведения меченого йодида в форме Na⁺I^- и 5-йод-2'-ЙДУР из зоны опухоли. Ранее упоминалось, что одним из основных продуктов трансформации ЙДУР является свободный йодид-ион. Несмотря на то, что количество йодида-иона не превышает 3-7% от исходного количества ЙДУР, но его влияние должно в некоторой степени сказываться на результатах измерений РМ внешним детектором и, следовательно, необходимо оценить вклад йодид-иона в суммарный процесс. Проведенные эксперименты с использованием NaI, меченного ¹²⁵I, показали, что параметры выведения РМ из зоны опухоли зависят от величины радиационного воздействия. Несмотря на то, что эта зависимость менее выражена, чем при введении ЙДУР (рис.4), ее существование не позволяет напрямую, без должного анализа, вычленить из получаемых при радиометрии ЙДУР данных радиоактивность, относящуюся к иодиду. Следовательно, встает вопрос о сравнении параметров экспериментальных кривых в том и другом случае, и одним из возможных решений этого вопроса является применение метода моделирования. Для этого необходимо по отдельным точкам реконструировать ход всей кривой или интересующего нас участка и подобрать аппроксимирующую функцию с наиболее близким приближением. Далее - выделить параметры, характеризующие отдельные процессы, и использовать полученные параметры моделей для предсказания изменения уровня ЙДУР в ДНК опухолевых клеток.

Рисунок 4. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли меланома В-16 привитой мышам С57Bl/6 - при введении ¹²⁵I-ЙДУР: без облучения (1), после рентгеновского облучения дозой 20 Гр (3); - при введении Na¹²⁵I: без облучения (2), после рентгеновского облучения дозой 20 Гр. (4); N_t/N_0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения ¹²⁵I-ЙДУР или Na¹²⁵I

Математический анализ кривых выхода РМ NaI (N_t / N_0.25 от t) из опухоли как для контроля, так и для различных режимов облучения показал, что эти кривые хорошо аппроксимируются функцией вида: Y =A*e^-ax + B*e^-bx (коэффициент детерминации r²=93 98 при 95% достоверности). Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов. Ход кривой определялся по 10ч11 точкам при 8ч12 значениях на каждую. Такое двухфазное падение величины N_t / N_0,25 отражает процесс выведения из зоны опухоли свободного йодида (быстрая - вторая экспонента). Клиренс остаточной радиоактивности является быстрым, поскольку обусловлен активностью главного продукта трансформации ЙДУР - йодида. Первая экспонента - медленная - отражает выведение йодида «условно связанного», то есть вступившего в обменные процессы большей частью представлена кислоторастворимой фракцией йодированного белка плазмы. Напомним, что щитовидная железа животных во время проведения экспериментов блокирована нерадиоактивным йодом и не может депонировать радиоактивный йод. Кривая изменения РМ (N_t/N_0.25 от времени) в опухолевой зоне при введении меченого ЙДУР имеет более сложную форму, чем аналогичная зависимость, полученная при введении NaI. Однако, как показал анализ экспериментальных данных, в интервале от 0,25 до 72 часов также проявляются две основные фазы, и оба эти участка аппроксимируются экспоненциальными функциями с высокой степенью соответствия (r²=96ч98 при 95% достоверности). Эмпирические формулы при обработке результатов каждого эксперимента находились по 8ч10 значениям на каждую из 11ч12 пар зависимых величин.