Порівняльний аналіз ефективності використання методів розеутворення та імунофенотипування лімфоцитів за допомогою моноклональних антитіл у контролі за станом імунної системи у практично здорових та хворих на дерматити собак

Размещено на http://www.allbest.ru/

Порівняльний аналіз ефективності використання методів розеутворення та імунофенотипування лімфоцитів за допомогою моноклональних антитіл у контролі за станом імунної системи у практично здорових та хворих на дерматити собак

М.М. Брошков, кандидат ветеринарних наук, доцент Одеський державний аграрнийуніверситет

У статті представлені дані порівняльного аналізу визначення кількості Т-лімфоцитів з використанням методів розеткоутворення та імунотипування за допомогою моноклональних антитіл. Показано, що у практично здорових собак значних відмінностей відносної кількості Т-лімфоцитів у периферичній крові не відзначається. Згідно отриманих даних можливість використання «розеткових» тестів є об'єктивною у контролі за станом імунної системи собак.

Ключові слова: собаки, імунітет, Т-лімфоцит, Т-хелпер, Т-супресор, імунофенотипування

Відомо, що найбільш інформативними тестами, які характеризують потенційну здатність системи імунітету до адекватної імунної відповіді, є аналіз кількості Т- і В-лімфоцитів, активованих Т-лімфоцитів в периферичній крові хворих. Протягом 30-ти років найбільш важливими показниками кількісної характеристики популяції Т- і В-лімфоцитів вважалася кількість Е-розеткоутворюючих клітин, метод визначення яких базується на факті наявності поверхневих рецепторів лімфоцитів до гетерологічних еритроцитів (для Т-лімфоцитів- це еритроцити барана (Е- РУК), для В-лімфоцитів -еритроцити миші[2,10].

Відкриття гібридомної технології отримання моноклональних антитіл і впровадження в широку практику клініко-діагностичних лабораторій автоматичного аналізу на базі кількісної проточної цитофлюориметрії сприяло поступовому витісненню «розеткових» тестів. Бурхливий розвиток цієї галузі сприяв відкриттю великої кількості нових фенотипів імунокомпетентних клітин, значимість яких в оцінці стану імунної системи за різних дисфункцій активно вивчається. Разом з тим, загальновідомо, що не зважаючи на виражену клінічну картину, яка свідчить про наявність порушень в імунній системі, у хворих собак нерідко складно виявити будь- які значні відхилення в отриманих результатах. У зв'язку з цим слід згадати про значущість тесту спонтанного розеткоутворення, який не обмежується лише підрахунком кількості Т- і В- клітин [5, 7, 8, 9, 11]. Зокрема, модифікації тесту дозволяють з Е-РУК відокремити різні «корисні» варіанти, наприклад, сенсибілізованих Т-лімфоцитів до різних антигенів органів і тканин. Це дозволяє досить легко характеризувати модуляцію експресії поверхневих структур лимфоцита під invitro впливом різних стимулів, оскільки кількість розеткоутворюючих клітин здатна порівняно швидко змінюватися під дією безлічі сполук: медіаторів нервової системи, ендогенних і екзогенних імуномодуляторів, гормонів тощо [1, 3,4].

Мета досліджень - провести порівняльний аналіз визначення кількості Т-, Т- активованих лімфоцитів за результатами двох тестів: спонтанного розеткоутворення (Е-РУК) і CD- типування (популяції CD3 +, CD4 +, CD8 +) з метою оцінки найбільш інформативного методу для контролю за станом імунної системи у здорових і хворих на дерматит собак.

Матеріал і методика досліджень. Робота виконана на кафедрі фізіології, біохімії і мікробіології Одеського державного аграрного університету спільно з лабораторією імунології інституту очних хвороб ім. акад. В. П Філатова. Клінічний огляд собак і відбір проб крові проводили в умовах приватної ветеринарної клініки м. Одеси.

Матеріалом для досліджень була попередньо стабілізована периферична кров собак, віком 1-9 років (n= 38), які мали однакові умови утримання та годівлі. Тварини були розділені на три групи:1-агрупа (n=14) -практично здорові собаки віком 1-5 років; 2-а група (n= 11) - практично здорові собаки віком6-9років; третя група (n=13) - собаки з дерматитами.

Кров відбирали вранці на голодний шлунок з ліктьової вени в про- бірку з ЕДТА. У тварин одночасно проводили оцінку популяції лімфоцитів в тестах розеткоутворення та імунофенотипування. У крові визначали абсолютний і відносний вміст лімфоцитів та їх субпопуляцій в реакції розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-тф.р.-РУЛ, Е-тф.ч.-РУЛ)[1].

Імунофенотип оцінювали згідно рекомендації фірми AbDSerotec (Великобританія ) з використанням реакції імунофлюорисценції. Для цього після забору крові розводили кров у 2 рази середовищем 199 і обережно нашаровували на 1,5 мл розчином фікол-урографіну щільністю 1,077, потім центрифугували40хвилин при400G,обережнозбираликільцелімфоцитівв окрему пробірку, відмивали лімфоцити 2 рази від залишків філолу розчином PBSз 1% BSA або середовищем 199 (4-5 мл), центрифугували при 400 G10 хвилин, відбирали надосадову рідину, а до осаду клітин додавали 1мл PBSз 1% BSA. Добре перемішували і підраховували кількість клітин в камері Го- ряєва, після чого готували робочу концентрацію клітин - 1 x106 клітин / мл. Розводили моноклональні антитіла 1: 100 розчином PBSз 1% BSA(попередньо їх відтитровували) і відбирали аліквоту 100 мкл клітинної суспензії 1x 106 клітин / мл і додавши 100 мкл розведених (1: 100) моноклональних антитіл. Добре перемішували, потім залишали для контакту на 30 хвилин за кімнатної температури. Відмивали 2 рази імунні комплекси, що утворилися від надлишку флуоресцентного барвника (FITC) - 2мл розчину PBSз 1%BSAі центрифугували при 400 G 5 хв. Видаляли супернатант і ресуспендували в 200 мклрозчину PBS з 1% BSA з додаванням 50% гліцерину в якості монтажного середовища. Розміщували краплю ресуспендованих клітин на предметне скло, накривали покривним склом і переглядали під люмінесцентним мікроскопом, використовуючи об'єктив х40 і відповідний FITC набір світло-фільтрів. Отримані дані статистично обробляли з використанням t-критерію Стьюдента.

Результати досліджень. Як показали результати досліджень (табл.) в крові практично здорових собак (група 1) циркулює 62,0 ± 4,0% - CD3 + -лімфоцитів і практично така ж кількість 61,33 ± 15,14% - Е-РУК. Відомо, що антиген CD3 + є основною частиною антигенспецифічного Т- клітинного рецептора (TcR- CD3+), що запускає процеси антигензалежної активації Т-клітин. Цей маркер дозволяє досить надійно ідентифікувати зрілі інтактні Т-клітини і досить повною мірою визначати їх кількість. У той же час, реакція розеткоутворення не дає однозначної відповіді про кількісну характеристику Т-лімфоцитів, а лише дозволяє відокремити популяцію клітин переважно з функціями Т-лімфоцитів. Результати імунологічних досліджень у собак після 6 років показали, що відносна кількість Т-лімфоцитів в реакції розеткоутворення на 2% більше, ніж в реакції імунотипування Т-клітин за допомогою моноклональнихантитіл.

Імунологічні показники практично здорових і хворих на дерматит собак

розеутворення імунофенотипування лімфоцит імунний

У собак з дерматитами різниця у відносній кількості Т-лімфоцитів в реакції розеткоутворення на 7,25% більше, ніж кількість цих же клітин в реакції з моноклонами CD3 +. Однією з причин відмінності в кількості Т- лімфоцитів, можливо, є зміна активності Т-клітинного імунітету у собак з віком у зв'язку з інволюцією тимуса, а також більшою активністю Е-РУК клітин в крові за патологічногостану.

Кількісна характеристика субпопуляцій Т-клітин з хелперною (CD4 +) активністю свідчить про істотно підвищений їх відносний рівень щодо показника у собак в старечому періоді і за дерматитів у відповідності до результатів реакції розеткоутворення. Отримані ж за допомогою реакції розеткоутворення результати щодо вмісту Т-клітин з супресорною (CD8 +) активністю свідчать про низький вміст цих клітин в реакції імунофенотипування.

Разом з тим, слід зазначити, що впровадження методу імунофенотипування за допомогою моноклональних антитіл замість «розеткових» тестів суттєво не вплинуло на загальновизнані положення про зміни в стані імунної системи за різних дисфункціональних станів. Отже, можна стверджувати, що застосування методу розеткоутворення дозволяє певною мірою виявляти і кількісно оцінювати популяції лімфоцитів, які несуть маркери і володіють функціями, характерними переважно для Т-лімфоцитів.

Висновки

Виходячи з проведених досліджень, аналізуючи визначення кількості Т- лімфоцитів з використанням методів розеткоутворення та імунотипування за допомогою моноклональних антитіл встановлено, що у практично здорових собак до 6 років відносна кількість цих клітин знаходиться в межах 60%, з віком (після 6 років) вміст Т-лімфоцитів в периферичній крові знижується. У той же час відносна кількість Т-лімфоцитів у собак з дерматитами також знижується і більш виражене зниження цих клітин відзначено в реакції імунофенотипування. Отримані дані можуть бути використані в інтерпретації показників імунограм в клінічній ветеринарній практиці дрібних домашніх тварин за оцінювання імунофізіологічної реактивності організму та проведення імунотерапевтичного лікування.

Списоклітератури

1. Влізло В.В. Лабораторні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині / В. В. Влізло // Львів: СПОЛОМ, 2012. - С.234-237.

2. Донник И.М. Экология и здоровье животных / И. М. Донник, П. Н. Смирнов. -- Екатеринбург : УТК, 2001. -- 331с.

3. Дрожжина Г.И. Состояние иммунологической реактивности организма у больных с наследственными стромальными дистрофиями роговицы и ее особенности при наличии воспалительного компонента / Г. И. Дрожжина, Т. В. Дегтяренко // Офтальмологічний журнал. - 2004. - № 5. - С.10-16.

4. Лебедев К.А. Иммунология образраспознающих рецепторов: Интегральная иммунология / К. А. Лебедев, И. Д. Понякина. - М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2013. - 256с.

5. Новиков Д.К. Медицинская иммунология / Д. К. Новиков. - Минск.:

«Высшая школа», 2005. - С.116-119.

6. Новиков Д.К. Оценка иммунного статуса / Д. К. Новиков, В. И. Новикова. - Витебск-Москва: Высшая школа, 1996. - С.90-97.

7. Покровский В. И. Приобретенный иммунитет и инфекционный процесс / В. И. Покровский, М. М. Авербах, В. И. Литвинов, И. В. Рубцов // Медицина. -М. - 1979. - С.189-213.

8. Ройт А. Основы иммунологии / А. Ройт. - М.: Эксмо, 1996. - С.127-167.

9. Хаитов Р. М. Иммунология / Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович. - М.: Эксмо, 2000. - С.57-64.

10.Чередеев А. Н. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий / А. Н. Чередеев, Н. К. Горлина, И. Г. Козлов. - Клин. лаб. диагностика. - 1999. - №6. -С25-329.

11.Ярилин А. А. Иммунология / А. А. Ярилин // Медицина. - М. - 1999. - С. 76-83.

Размещено на Allbest.ru