Пошук потенційних міотропних детрузороселективних сполук в ряду похідних гуанідину

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фармакології та токсикології

УДК 615.015.13:615.217.5

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Пошук потенційних міотропних детрузороселективних сполук в ряду похідних гуанідину

14.03.05 - фармакологія

Лимаренко Ірина Василівна

Київ-2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фармакології серцево-судинних засобів Інституту фармакології та токсикології АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Мохорт Микола Антонович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу фармакології серцево-судинних засобів.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Тишкін Сергій Михайлович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії;

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології.

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, кафедра фармакології з курсом клінічної фармакології, МОЗ України, Київ.

Захист відбудеться ‹‹15›› лютого2006р. о 13 ⁰⁰годині на засіданні спеціалізовано вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє,14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє,14.

Автореферат розісланий ‹‹13›› січня 2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Данова І.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Гіперактивність сечового міхура - стан, що характеризується наявністю частого сечовипускання, імперативних позивів з ургентним нетриманням сечі чи без нього, є одною з найчастіших причин порушень сечовипускання. Статистичні дані підтверджують, що близько 30% жінок середнього і літнього віку нашої країни страждають цим захворюванням (А.С. Переверзев, 2001). Гіперактивність сечового міхура класифікується як поняття, що уродинамічно визначається мимовільними скороченнями детрузора під час фази наповнення. Клінічно гіперактивність детрузора проявляється сильними, несподіваними позивами до сечовипускання, які при неможливості негайного випорожнення сечового міхура можуть призводити до ургентного нетримання сечі.

Для лікування гіперактивності сечового міхура використовують аналоги вазопресину; гормональні препарати; інгібітори синтезу простагландинів; б-адреноміметики; в-адреноблокатори; трициклічні антидепресанти; антихолинергичні препарати. недостатня ефективність або наявність великої кількості побічних ефектів (порушення акомодації, тахікардія, гепатотоксичність) у препаратів перелічених груп спонукали до пошуку та дослідження нових засобів (D. Rigby, 2005). Вважається, що найбільш перспективним є пошук засобів модуляції активності аденозин-трифосфатзалежних калієвих каналів гладеньком'язевих елементів сечового міхура, які відіграють важливу роль в регуляції скорочувальної здатності детрузора (R. Kavia, 2005).

Активатори калієвих каналів - відносно новий клас антигіпертен-зивних, протиішемічних, антиангінальних препаратів, що викликають артеріолярну та венулярну вазоділатацію. На даний час існує багато груп сполук, які мають здатність активувати калієві канали. Найбільш вивчені похідні бензопирану (кромакалім), гуанідину (пінацидил), нікотинаміду (нікорандил) та піримідиндіаміну (міноксидил). Незважаючи на різну хімічну структуру, відкривачі (активатори) калієвих каналів мають загальний механізм дії: активуючи певні види калієвих каналів у клітинних мембранах, вони сприяють виходу іонів калію з клітки і виникненню на мембрані стійкої гіперполяризації, що перешкоджає надходженню іонів кальцію через потенціалкеровані кальцієві канали, при цьому збільшується пороговий потенціал, що викликає зниження збудливості гладеньком'язевих клітин (судин, матки, бронхів, сечового міхура і т.д.) і здатності їх до скорочення. Кромакалім, пінацидил і левкромакалім in vitro та in vivo показали здатність концентраційно-залежним чином знижувати скорочувальну активність сечового міхура, як спонтанну, так і індуковану електростимуляцією, високими концентраціями позаклітинного калію, карбахолом та ін. Однак, значним недоліком цих препаратів є наявність вираженої гіпотензивної дії. Результати клінічних випробувань показали, що дані сполуки не спричинюють відповідного ефекту в дозах, які не зменшували виражено артеріальний тиск (H. Hedlund із співавт., 1991; K. Komersova із співавт., 1995). Для вирішення цієї проблеми необхідний подальший пошук нових більш селективних активаторів калієвих каналів, позбавлених виражених антигіпертензивних властивостей.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно планової наукової теми відділу фармакології серцево-судинних засобів Інституту фармакології та токсикології АМН України, № державної реєстрації 0105U002252.

Мета роботи: на основі експериментальних досліджень нових фторвмісних похідних гуанідину визначити найбільш активну сполуку з переважним впливом на скорочувальну активність м'яза, що виштовхує сечу.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Вивчити вплив нових фторвмісних похідних гуанідину на скорочувальну активність детрузора на ізольованих смужках сечового міхура щурів in vitro.

2. Дослідити дію нових фторвмісних похідних гуанідину на тонус судин іn vitro.

3. Встановити вплив найбільш селективної по відношенню до детрузора сполуки на скорочувальну активність сечового міхура в умовах in vivo.

4. Вивчити гостру токсичність (DL₅₀) найбільш активної по відношенню до детрузора сполуки на білих мишах.

Об'єкт дослідження - фторвмісні похідні гуанідину (аналоги пінацидила).

Предмет дослідження - характер впливу нових фторвмісних похідних гуанідину на скорочувальну активність сечового міхура та тонус судин.

Методи дослідження - фармакологічні, фізіологічні, токсиколо-гічні, статистичні.

Наукова новизна дослідження. Проведені дослідження в умовах in vitro вперше показали наявність спазмолітичних та вазодилататорних властивостей у нових фторвмісних похідних гуанідину.

Вперше визначена найбільш селективна відносно детрузора речовина PF-5, яка пригнічує скорочувальну активність сечового міхура в дослідах на тваринах.

Показано, що в механізм спазмолітичної дії нового фторвмісного похідного гуанідину речовини PF-5 залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обґрунтовано доцільність використання нової фторвмісної похідної гуанідину речовини PF-5 для усунення гіперактивності сечового міхура. Результати досліджень впроваджено в навчальний процес кафедр фармакології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, Медичного інституту Української Асоціації Народної Медицини, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Харківського медичного університету

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових серверів та медичної бази даних мережі Internet, аналіз даних наукової літератури за темою дисертації, відпрацював дослідні методики, спланував та виконав всі дослідження. Облік, аналіз первинного матеріалу, статистична обробка результатів, розробка основних положень та висновків роботи, написання всіх розділів дисертації також виконано дисертантом особисто.

Апробація результатів роботи. Основні положення та висновки дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: Науково-практичній конференції “Актуальні питання кардіології та ревматології” (Київ, 2003); V конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); Науково-практичній конференції “Актуальні питання діагностики, лікування і профілактики серцево-судинних захворювань” (Донецьк, 2004);V конференції молодих вчених СО РАМН (Новосибірськ, Росія, 2004); IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (Україна, Вінниця, 7-8 жовтня, 2004 р.); XII міжнародній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Ломоносов-2005” (Москва, Росія, 2005), де отримала Диплом другого ступеня за наукову роботу в конкурсі наукових робіт; XII Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, Росія, 2005); Науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми радіаційної медицини” (Київ, 2005); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005); 12^th International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); 16^th European students' conference (Берлін, Німеччина, 2005), де отримала Диплом переможця сесії “Урологія/Нефрологія”; Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2005); ІІ Науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005).

Публікації. Матеріали досліджень опубліковані в 20 наукових роботах: 8 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 статті у закордонних наукових виданнях та 10 тез наукових форумів, семінарів, симпозіумів, конференцій, 5 з яких закордонні.

Об'єм та структура дисертації. Дисертацію викладено на 140 сторінках друкованого тексту. Вона складається зі вступу, огляду літератури, розділу “матеріали та методи дослідження”, 5 розділів власних досліджень, розділу “Обговорення отриманих результатів”, висновків та списку використаної літератури. Роботу проілюстровано 9 таблицями, 23 рисунками. Бібліографія включає 240 джерел, 205 із яких опубліковані в зарубіжних виданнях.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. У роботі досліджувалися нові похідні N-1; 2,2-триметилпропил-N''-ціано-N'-арилгуанідину, що були синтезовані в Інституті органічної хімії під керівництвом проф. Л.М. Ягупольського. Ці нові речовини відрізняються від препарату-прототипу, пінацидила, наявністю атома хлору або фторованої групи в ароматичному кільці.

Експерименти виконані на 200 нелінійних статевозрілих щурах-самках масою 250-350 г, 50 нелінійних статевозрілих щурах-самках масою 300-350 г, 20 нелінійних статевозрілих білих мишах різної статі масою 18-29 г, які утримувалися на стандартному раціоні у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Для приготування всіх буферних розчинів Кребса та Кребса-Хенселейта використовували хімічно чисті реактиви, які розчиняли у дистильованій воді. Глібенкламід, диметилсульфоксид та диметилацетамід були виробництва “CGmbH” (Німеччина).

Для проведення досліджень in vitro використовували установку для вивчення скорочувальної активності ізольованих смужок сечового міхура та кільцевих судинних сегментів. Досліди проводили на ізольо-ваних смужках сечового міхура та на ізольованих кільцевих смужках аорти щурів, що були закріплені в робочій камері з одного боку до стаці-о-нарного гачка, а з іншого - до штоку тензодатчика (M. Gopalakrishnan, 2002; C.D. Foster, 1989). Всі тестування проводилися в ізометричному режимі при початково заданій напруженості. Дослідження вазодилататорних ефектів досліджуваних сполук проводили на фоні підвищеного судинного тонусу препаратів аорти, який отримували, в залежності від мети експерименту, за допомогою гіперкалієвого розчину Кребса (KCl- 60 ммоль/л) або фенілефрина (1 ммоль/л). Вивчення спазмолітичних ефектів досліджуваних сполук проводили на фоні підвищеної скорочувальної активності препаратів сечового міхура, який отримували, в залежності від мети експерименту, за допомогою гіперкалієвого розчину Кребса-Хенселейта з концентрацією хлориду калію 60 або 15 ммоль/л. Робочі розчини насичували газовою суміщщю 95% О₂ та 5% СО₂. За допомогою автоматичного термостата температура розчину в камері підтримувалась на рівні 37±0,5С. Запис скорочувальної активності здійснювали на папері за допомогою багатоканального самописця моделі Н3031.

Експерименти in vivo проведені на щурах-самках (300-350 г), анестезованих уретаном (1,2 г/кг). Внутрішньопузирний тиск вимірювався через інтрауретральний катетер, який був підключений через триходовий перемикач до датчика тиску. Система була заповнена фізіологічним розчином. Трахея була інтубована поліетиленовою трубкою для полегшення дихання. В першій серії експериментів об'єм інфузованого сольового розчину складав 0,1-0,15 мл і не викликав рефлексу сечовипускання (Y. Yu, 1999). Ефекти досліджуваних речовин фіксувалися через 10 хв після внутрішньооочеревинного введення. В другій серії експериментів об'єм інфузованого сольового розчину складав 0,4 мл і викликав рефлекс сечовипускання (S. C. Turner, 2003). Максимальні ефекти досліджуваної речовини фіксувалися через 20 хв після внутрішньоочеревинного введення. Одночасно з дослідженням впливу експериментальної речовини на рефлекс сечовипускання вимірювали артеріальний тиск прямим методом через катетер, введений в сонну артерію та заповнений гепаринізованим розчином. Реєстрація скорочувальної активності здійснювалася за допомогою датчиків тиску виробництва “Vogtmedical” (Німеччина). Запис здійснювали на папері за допомогою багатоканального самописця моделі Н3031.

Для визначення середньої летальної дози (DL₅₀) найбільш активної речовини використовували метод В.Б. Прозоровського (1998).

Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали за t-критерієм Ст'юдента. Зміни вважали статистично вірогідними при Р0,05. Величини ЕС₅₀ для залежностей доза-ефект були отримані з апроксимацій експериментальних даних кривої доза-ефект (кривої Хілла), що побудована за методом найменших квадратів. Всі розрахунки проводили на персональному комп'ютері “Pentium 4 3.0”. При виконанні дисертаційної роботи було використано програми “Microsoft ехеl 2002 (10.2701.2625)” та “ORIGIN 6.0”.

Результати досліджень та їх обговорення. Вплив нових фторвмісних похідних гуанідину на скорочувальну активність смужок сечового міхура щурів. При перфузії дослідних препаратів гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію 60 ммоль/л спостерігається підвищення базального тонусу смужок сечових міхурів. Нові фторвмісні похідні гуанідину зменшують тонус смужок сечового міхура, індукований сольовим розчином з концентрацією хлориду калію 60 ммоль/л концентраційно-залежним чином (табл. 1).

Таблиця 1 Значення середніх ефективних концентрацій нових фторвмісних аналогів пінацидила (ізольовані смужки сечового міхура, 60 мМ KCl, М±m, n=8)

Примітки: на цій та табл. 2-4: 1.* - р<0,05 в порівнянні з пінацидилом; 2.** - р<0,001 в порівнянні з пінацидилом.

Перфузія смужок сечового міхура гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію 15 ммоль/л призводить до збільшення амплітуди та частоти хвиль їх спонтанної скорочувальної активності. Нами встановлено, що нові фторвмісні похідні гуанідину зменшують амплітуду хвиль спонтанної скорочувальної активності смужок сечових міхурів концентраційно-залежним чином (табл. 2).

Таблиця 2 Значення середніх ефективних концентрацій нових фторвмісних аналогів пінацидила (ізольовані смужки сечового міхура, 15 мМ KCl, М±m, n=8)

Отримані дані свідчать, що всі нові фторвмісні аналоги пінацидила здатні пригнічувати як базальний тонус детрузора, так і його спонтанну скорочувальну активність. Можна визначити, що всі досліджувані сполуки проявляють концентраційно-залежні спазмолітичні властивості, які були більш виражені на фоні індукції спонтанної скорочувальної активності смужок сечових міхурів гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію 15 ммоль/л. гуанідин детрузор фторвмісний

Вплив нових фторвмісних похідних гуанідину (аналогів пінацидила) на тонус судин. За результатами експериментів було встановлено, що всі фторовані аналоги пінацидила концентраційно-залежним чином пригнічують скорочувальну активність ізольованих судинних препаратів, індуковану гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію 60 ммоль/л (табл. 3).

Було встановлено, що всі фторовані аналоги пінацидила концентраційно-залежним чином, пригнічують скорочуваль-ну активність ізольованих судинних препаратів, індуковану перфузією фенілефрину в концентрації 1 ммоль/л. Як видно із табл. 4, нові фторвмісні похідні гуанідину проявляють менш виражені вазодилататорні властивості, ніж пінацидил.

для кожної речовини був розрахований відносний критерій селективності (ВКС), що являє собою відношення середньої ефективної концентрації по спазмолітичному впливу (в дослідах на фоні перфузії ізольованих смужок сечових міхурів гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію 15 ммоль/л) та середньої ефективної концентрації досліджуваної речовини по вазодилататорному впливу (в дослідах на фоні перфузії судинних кілець фенілефрином).

Таблиця 3 Значення середніх ефективних концентрацій нових фторвмісних аналогів пінацидила (ізольовані судинні препарати, 60 мМ KCl, М±m, n=8)

Таблиця 4 Значення середніх ефективних концентрацій нових фторвмісних аналогів пінацидила (ізольовані судинні препарати аорти щурів, фенілефрин 1 ммоль/л, М ± m, n=8)

Такий вибір пояснюється тим, що в цих серіях експериментів усі речовини, включаючи пінацидил, більш виражено проявляють свої фармакологічні властивості. Чим менша величина ВКС, тим більша селективність речовини до детрузора in vitro. Відносні критерії селективності складають: для пінацидила - 0,22; для речовини PF15 - 0,84; для речовини PF10 - 0,16; для речовини PF20 - 0,24 та для речовини PF5 - 0,0005. Порівнюючи ВКС пінацидила та інших фторвмісних його аналогів можна побачити, що речовина PF-5 проявляє найбільш детрузороселективні властивості серед інших фторвмісних похідних гуанідину.

Наступним етапом нашої роботи було дослідження впливу цієї речовини на скорочувальну активність сечового міхура щурів in vivo. Спочатку оцінювали фармакологічну ефективність досліджуваної сполуки шляхом визначення внутрішньопузирного тиску. Потім застосовували методику вивчення впливу експериментальних речовин на рефлекс сечовипускання щурів.

Вплив речовини РF-5 на величину внутрішньопузирного тиску. Вплив дослідної речовини на скорочувальну активність сечового міхура in vivo оцінювали за змінами величини внутрішньопузирного тиску, який вимірювався через інтрауретральний катетер, що був підключений до датчику тиску. Контрольні дослідження (n=15) для трансуретрального запису були проведені шляхом інфузії сольового розчину до сечових міхурів. Визначено, що при повільному введенні сольового розчину в об'ємі 0,1-0,2 мл внутрішньопузирний тиск підвищувався і залишався на постійному рівні на протязі всього експерименту. Внутрішньопузирна інфузія 0,4 мл і більше сольового розчину призводила до виникнення рефлексу сечовипускання. Встановлено, що сполука РF-5 і пінацидил зменшують внутрішньопузирний тиск після внутрішньоочеревинного введення дозо-залежним чином (табл. 5).

Таблиця 5 Значення середніх ефективних концентрацій речовини PF-5 та пінацидила (дослідження in vivo, М ± m, n=9)

Примітка. * - р?0,05 в порівнянні з пінацидилом

Вплив речовини PF-5 на рефлекс сечовипускання. Як відомо, введення сольового розчину в об'ємі 0,4 мл і більше викликає рефлекс сечовиділення. Тому, ми провокували виникнення рефлексу саме таким чином. Щурам, анестезованим уретаном, через інтрауретральний катетер на протязі 1 год вводили фізіологічний розчин в об'ємі 0,4 мл. Одночасно реєстрували величину артеріального тиску через катетер, введений в сонну артерію. Досліджувану речовину вводили інтраперітонеально в дозі 1 мг/кг і через 20 хв після її введення починали реєстрацію результатів. Кожне введення 0,4 мл фізіологічного розчину викликає виникнення рефлексу сечовипускання, що реєструвалося за допомогою датчика тиску та візуально. Через 20 хв після введення речовини PF-5 інфузія 0,4 мл сольового розчину підвищувала внутрішньопузирний тиск (який потім швидко повертався до вихідного рівня), але не провокувала сечовипускання. Рефлекс сечовипускання виникав лише після 3-4 введення фізіологічного розчину. Якщо порівнювати максимальну амплітуду скорочувальної активності сечового міхура (рефлексу сечовипускання) до введення речовини PF-5 та через 20 хв після введення досліджуваної речовини, то можна визначити, що досліджувана речовина в дозі 1 г/кг зменшує максимальну амплітуду скорочувальної активності на 90,72±2,13% (n=7, р<0,001). При цьому артеріальний тиск залишався майже незмінним, а саме знижувався на 6,1±1,66 мм рт.ст. (n=9, р>0,05). Таким чином, речовина PF-5 в дозі 1 мг/кг повністю пригнічує рефлекс сечовипускання, зменшуючи амплітуду хвиль скорочувальної активності, та практично не впливає на артеріальний тиск.

Дослідження механізму дії нового фторвмісного похідного гуанідину pf-5. Як відомо, пінацидил відноситься до групи активаторів калієвих каналів, тому цілком справедливим може бути припущення, що в механізм дії його похідних також може бути залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів. Активність АТФ-залежних калієвих каналів знижується під впливом сульфонілуреатичних препаратів (глібенкламіду, толбутаміду та ін.). Тому для з'ясування механізму дії найбільш активної речовини РF-5 ми використовували глібенкламід - специфічний блокатор саме АТФ-залежних калієвих каналів. Для цього смужки сечового міхура попередньо (перед введенням досліджуваної речовини) перфузували протягом 10 хв глібенкламідом (3 ммоль/л). Глібенкламід не викликав вірогідних змін скорочувальної активності гладеньком'язевих препаратів. При наступній перфузії речовиною РF-5 спостерігалось зменшення її спазмолітичного ефекту відносно смужок сечового міхура. В серії експериментів без інгібування АТФ-залежних калієвих каналів середня ефективна концентрація речовини PF-5 складала -7,57±0,03 (0,028±0,002 мкмоль/л). В серії експериментів з інгібуванням цих каналів глібенкламідом напівмаксимальний ефект спостерігався при концентрації речовини PF-5 -5,84±0,07 (1,43±0,5 мкмоль/л). Як видно на рис. 3, глібенкламід викликає зсув кривої концентрація-ефект спазмолітичної дії досліджуваної речовини практично паралельно вправо. Таким чином, отримані результати свідчать, що в механізм дії нового фторвмісного похідного гуанідину речовини РF-5 залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів, внаслідок чого її можна ідентифікувати як активатор калієвих каналів. Механізм дії пінацидила не обмежується лише активацією К_АТФ каналів. Відомо, що пінацидил проявляє свої фармакологічні властивості на фоні перфузії дослідних гладеньком'язевих препаратів (ізольованих судинних кілець, ізольованих смужок сечових міхурів, ізольованих кілець бронхолегеневого дерева та ін.) гіперкалієвим розчином з концентрацією хлориду калію від 15 до 130 ммоль/л (D.K. Beattie et al., 1998). Інші відомі активатори калієвих каналів (діазоксид, кромакалім, левкромакалім) та їх похідні можуть проявляти спазмолітичні та вазодилататорні ефекти на фоні гіперкалієвого розчину з концентрацією хлориду калію не більше 30 ммоль/л. Така відмінність пояснюється наявністю у пінацидила ще іншого “додаткового” механізму дії, не пов'язаного з активацією АТФ-залежних калієвих каналів (B. Cai et al., 1994; M. Magnon et al., 1998). Незважаючи на велику кількість досліджень в цьому напрямку, повністю механізм дії пінацидила ще не з'ясовано. Нові фторвмісні похідні пінацидила також проявляють концентраційно-залежні спазмолітичні властивості на фоні гіперкалієвої деполяризації 60 ммоль KCl. Це дозволяє припустити, що вони також можуть мати інші мішені впливу.

Гостра токсичність (DL₅₀) нового фторовмісного похідного гуанідину pf-5. Для визначення середньої летальної дози нового фторвмісного аналога пінацидила ми використовували експрес-метод В.Б. Прозоровського (1998). Нами було проведено визначення середньої летальної дози речовини PF-5 при внутрішньоочеревинному та при внутрішньошлунковому введеннях. Визначення DL₅₀ досліджуваної речовини при внутрішньоочеревинному введенні було проведено на 10 білих мишах масою 19-29 г, які були поділені на 5 груп по 2 тварини в кожній. Дози досліджуваної речовини складали 800; 1000; 1300; 1600 та 2000 мг/кг (табл. 6). Речовину вводили в об'ємі 0,2 мл. Спостереження проводили на протязі 14 днів. Після введення великих доз речовини (1600 та 2000 мг/кг) спостерігались симптоми інтоксикації, що виражались зменшенням рухової активності та сонливістю піддослідних тварин. Однак, дані ознаки зникали без наслідків на протязі першої доби. Таким чином, ми отримали послідовність реакцій 0, 1, 1, 2. За таблицею “4-х сусідніх доз” середня летальна доза (DL₅₀) речовини PF-5 для мишей при внутрішньоочеревинному введенні складає 1420±170 мг/кг. Як відомо, критерії токсичності, отримані при введенні речовини інтраперитонеально, близькі до отриманих при внутрішньовенному введенні. DL₅₀ пінацидила для мишей при внутрішньовенному введенні складає 177 мг/кг. Тому, можна стверджувати, що нова фторвмісна похідна гуанідину речовина PF-5 менш токсична, ніж препарат-прототип - пінацидил. визначення DL₅₀ досліджуваної речовини при внутрішньошлунковому введенні було проведено на 10 білих мишах масою 18-25 г, які були поділені на 5 груп по 2 тварини в кожній. Дози досліджуваної речовини складали 1000; 1300; 1600; 2000 та 2500 мг/кг (табл. 6). Речовину вводили за допомогою зонда в об'ємі 0,2 мл. Спостереження проводилися на протязі 14 днів. Після введення великих доз речовини (2000 та 2500 мг/кг) спостерігались симптоми інтоксикації, що виражались зменшенням рухової активності та сонливістю піддослідних тварин. Однак, дані ознаки зникали без наслідків на протязі першої доби. Таким чином, ми отримали послідовність реакцій 0, 1, 0, 2. За таблицею “4-х сусідніх доз” середня летальна доза (DL₅₀) речовини PF-5 для мишей при внутрішньошлунковому введенні складає 1930±260 мг/кг. Середня летальна доза (DL₅₀) пінацидила для мишей при внутрішньошлунковому введенні складає 412 мг/кг. Тому, можна стверджувати, що нова фторвмісна похідна гуанідину речовина PF-5 менш токсична при пероральному введенні, ніж препарат-прототип - пінацидил.

Таблиця 6 Середні летальні дози речовини PF-5 при різних шляхах введення

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що нові фторвмісні похідні гуанідину проявляють концентраційно-залежні спазмолітичні та вазодилатуючі властивості in vitro. Найбільш детрузороселективна речовина PF-5 зменшує скорочувальну активність сечового міхура in vivo. Крім того, ця речовина в дозі 1 мг/кг повністю пригнічує рефлекс сечовипускання, зменшуючи амплітуду хвиль скорочувальної активності, та практично не впливає на артеріальний тиск. В механізм спазмолітичної дії нового фторвмісного похідного гаунідину, речовини РF-5, залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів, тобто її можна ідентифікувати як активатор калієвих каналів. За величиною DL₅₀ ця речовина менш токсична при пероральному та внутрішньоочеревинному введенні, ніж препарат-прототип - пінацидил.

Висновки

В роботі встановлено наявність у нової фторвмісної речовини PF-5, похідної гуанідину, виразних детрузороселективних спазмо-літичних властивостей, що експериментально обґрунтовує доцільність її використання для корекції гіперактивності сечового міхура.

1. нові фторвмісні похідні гуанідину (аналоги пінацидила) концентраційно-залежним чином зменшують тонус смужок сечового міхура in vitro, індукований гіперкалієвим розчином (60 ммоль/л KCl). Середні ефективні концентрації речовин PF-5, PF-10, PF-15, PF-20 та пінацидила складають 0,15±0,02; 0,19±0,02; 2,3±0,5; 8,8±0,6 та 0,21±0,03 мкмоль/л відповідно.

2. Досліджувані речовини, включаючи пінацидил, концентра-ційно-залежним чином зменшують амплітуду хвиль спонтанної скорочувальної активності смужок сечових міхурів in vitro, індукованої гіперкалієвим розчином (15 ммоль/л KCl). Середні ефективні концентрації речовин PF-5, PF-10, PF-15, PF-20 та пінацидила складають 0,03±0,002; 1,51±0,3; 1,32±0,03; 1,22±0,04 та 0,08±0,006 мкмоль/л відповідно. Речовина PF-5 проявляє більш виражені спазмолітичні властивості, ніж інші досліджувані речовини та пінацидил (р ? 0,05).

3. Всі фторовані аналоги пінацидила концентраційно-залежним чином пригнічують скорочувальну активність ізольованих судинних препаратів, індуковану гіперкалієвим розчином (60 ммоль/л KCl). Середні ефективні концентрації речовин PF-5, PF-10, PF-15, PF-20 та пінацидила складають 250±40; 29,0±6,7; 5,03±0,2; 12,6±0,3 та 3,8±0,4 мкмоль/л відповідно. Всі речовини концентраційно-залежним чином пригнічують скорочувальну активність ізольованих судинних препаратів, індуковану фенілефрином (1 ммоль/л). Середні ефективні концентрації речовин PF-5, PF-10, PF-15, PF-20 та пінацидила складають 59,0±3,0; 9,4±1,6; 1,56±0,2; 5,0±0,4 та 0,37±0,04 мкмоль/л, відповідно. Речовина PF-5 проявляє менш виражені вазодилатуючі властивості, ніж інші досліджувані сполуки та пінацидил (р0,05).

4. В умовах in vivo сполука РF-5 і пінацидил (внутрішньоочеревинне введення) зменшують внутрішньопузирний тиск дозо-залежним чином. Середні ефективні концентрації складають 2,87±0,3 та 4,67±0,6 мг/кг відповідно. Речовина PF-5 проявляє більш виражені спазмолітичні властивості, ніж пінацидил.

5. Речовина PF-5 (1 мг/кг) повністю пригнічує рефлекс сечови-пускання у білих щурів, зменшуючи амплітуду хвиль скорочувальної активності приблизно на 90,7%, та практично не впливає на величину артеріального тиску.

6. Глібенкламід (3 ммоль/л) пригнічує спазмолітичну активність речовини PF-5, викликаючи зсув вправо кривої концентрація-ефект на дві одиниці, що свідчить про її активуючий вплив на АТФ-залежні калієві канали.

7. Середня летальна доза (DL₅₀) речовини PF-5 для білих мишей при внутрішньоочеревинному введенні складає 1420±170 мг/кг, при внутрішньошлунковому введенні - 1930±260 мг/кг. За класифікацією К.К. Сидорова, досліджувана речовина відноситься до IV класу токсичності.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1.Мохорт Н.А., Самарская И.В. Фармакологическая активность активаторов калиевых каналов // Український медичний часопис. - 2003. - №6/38. - С. 26-38. (Особисто проаналізовано літературу та написано частину розділів).

2.Мохорт Н.А. Самарская И.В. Функциональная роль калиевых каналов в физиологических и патофизиологических условиях // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т.3, №2, Ч.1. - С. 193-195. (Особисто проаналізовано літературу та написано частину розділів).

3.Самарская И.В. Влияние новых фтор-содержащих производных гуанидина (аналогов пинацидила) на сократительную активность m. detrusor vesicae // Biomedscal and Biosocial anthropology. - 2004. - №3. - С. 105-108.

4.Мохорт М.А., Лимаренко І.В. Аденозинтрифосфатзалежні калієві канали: класифікація, структура та функції // Фізіологічний журнал. - 2005. - Т.51, №1. - С. 109-121. (Особисто проаналізовано літературу та написано частину розділів).

5.Лимаренко І.В. Порівняльне вивчення впливу нових фторвмісних похідних гуанідину та пінацидилу на скорочувальну активність сечового міхура in vitro // Фізіологічний журнал. - 2005. - Т.51, №3. - С. 88-91.

6.Лимаренко І.В. порівняльна характеристика нового фторвмісного похідного гуанідину та пінацидилу на скорочувальну активність детрузора in vitro // Ліки. - 2005. - №1-2. - С. 81-85.

7.Лимаренко І.В. Біохімічні аспекти активації АТФ-залежних калієвих каналів судин та кардіоміоцитів // Буковинський медичний вісник. - 2005. - №2. - С. 152-153.

8.Лимаренко І.В. Можливості фітотерапевтичної та фармако-ло-гічної корекції гіперактивності сечового міхура // Фітотерапія. Часопис. - 2005. - №3. - С. 29-31.

9.Лимаренко И.В. Экспериментальный анализ фармакологических эффектов и механизма действия нового фторсодержащего аналога пинацидила // Вестник молодых ученых: Выпуск II: Сборник лучших докладов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2005”. - М.: МАКС Пресс, 2005. - С. 238-243.

10.Мохорт Н.А., Ягупольский Л.М., Лимаренко И.В. Модуляция сократительной активности мочевого пузыря и сосудов новыми фтор-содержащими аналогами пинацидила // Российский биомеди-цинский журнал medline.ru. - 2005. - Т.6, ст. №176. - с. 725-742. http://www.medline.ru/public/art/tom6/art176pdf.phtml (Особисто виконано дослідження, проаналізовано літературу та написано частину розділів)

11.Самарская И.В. Фармакологическая регуляция АТФ-чувствительных калиевых каналов // Матеріали науково-практичної конференції “Актуальні питання кардіології та ревматології”. - Київ, 2003. - С. 81.

12.Самарская И.В. Активаторы калиевых каналов в лечении гиперактивности мочевого пузыря // Матеріали V української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті акад. В.В. Фролькіса. - Київ, 2004. - С. 163-164.

13.Мохорт Н.А, Самарская И.В. Активаторы калиевых каналов // Материалы конференции “Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний” - Донецк, 2004. - С. 20-21. (Особисто проаналізовано літературу та написано частину розділів).

14.Самарская И.В. Некоторые представления о модуляторах калиевых каналов // Материалы V конференции молодых ученых СО РАМН. - Новосибирск, 2004. - С. 115-116.

15.Мохорт Н.А, Самарская И.В. Экспериментальное изучение миорелаксирующей активности нового фтор-содержащего производного гуанидина (аналога пинацидила) // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса “Человек и лекарство”. - Москва, 2005. - С. 687.

16.Лимаренко І.В. Модуляція скорочувальної активності судин новими фторованими аналогами пінацидилу // Тези науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми радіаційної медицини”. - Київ, 2005. - С. 34-35.

17.Samarskaya I.V. Novel fluorine-containing pinacidil analogues: pharmacological effects and mechanism of action // International Student Congress of Medical Sciences. - Groningen, the Netherlands, 2005. - Р. 114.

18.Samarska I.V. A new potassium channel opener-fluorine-containing pinacidil analogues // 16^th European students' conference. - Berlin, 2005. - Р. 280.

19.Лимаренко І.В. Спазмолітичні властивості нового фторвмісного аналогу пінацидилу // Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених. - Одеса, 2005. - С. 45.

20.Лимаренко І.В. Вплив нового фторвмісного аналога пінацидилу на скорочувальну активність сечового міхура in vivo // Тези ІІ Науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів. - Київ, 2005. - С. 34.

Анотація

Лимаренко І.В. Пошук нових потенційних міотропних детрузороселективних сполук в ряду похідних гуанідину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології Академії медичних наук України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу нових фторвмісних похідних гуанідину на скорочувальну активність сечового міхура та тонус судин in vitro з метою визначення найбільш детрузороселективної речовини для подальшого вивчення її фармакологічних властивостей in vivo, ідентифікації механізму дії та гострої токсичності.

Експериментальним шляхом встановлено, що нові фторвмісні похідні гуанідину (аналоги пінацидила) пригнічують базальний тонус та спонтанну скорочувальну активність ізольованих смужок сечового міхура in vitro концентраційно-залежним чином. Показано, що всі досліджувані речовини проявляють слабо виражені концентраційно-залежні вазодилататорні властивості in vitro, ніж препарат-прототип -- пінацидил. Встановлено, що найбільш детрузороселективна речовина PF-5 проявляє виражені спазмолітичні властивості in vivo.

Глібенкламід, інгібітор АТФ-залежних калієвих каналів, пригнічує спазмолітичну активність речовини PF-5, викликаючи зсув кривої концентрація-ефект на дві одиниці. Таким чином було встановлено що, в механізм дії нового фторвмісного похідного гуанідину, речовини РF-5, залучена активація АТФ-залежних калієвих каналів.В дослідах по визначенню гострої токсичності було показано, що речовина PF-5 менш токсична при внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введеннях, ніж препарат-прототип - пінацидил.

Ключові слова: пінацидил, активатори калієвих каналів, сечовий міхур, гіперактивність сечового міхура.

Аннотация

Лимаренко И.В. Поиск новых потенциальных миотропных детрузороселективных соединений в ряду производных гуанидина.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии Академии медицинских наук Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию влияния новых фторсодер-жащих производных гуанидина на сократительную активность мочевого пузыря и тонус сосудов in vitro с целью определения наиболее детрузороселективного вещества для дальнейшего изучения его фармакологических свойств in vivo, идентификации механизма действия и острой токсичности.

Экспериментальным путем установлено, что новые фторсодержащие производные гуанидина (аналоги пинацидила) угнетают базальный тонус и спонтанную сократительную активность изолированных полосок мочевого пузыря in vitro концентрационно-зависимым способом. Показано, что все исследуемые вещества проявляют слабо выраженные концентрационно-зависимые вазодилататорные свойства in vitro, чем препарат-прототип - пинацидил. Установлено, что наиболее детрузороселективное вещество PF-5 проявляет выраженные спазмолитические свойства in vivo.

Глибенкламид, ингибитор Атф-зависимых калиевых каналов, угнетает спазмолитическую активность вещества PF-5, вызывая сдвиг вправо кривой концентрация-эффект на две единицы. Таким образом, было установлено что, в механизм действия нового фторсодержащего производного гуанидина, вещества РF-5, вовлечена активация АТФ-зависимых калиевых каналов. В опытах по определению острой токсичности было показано, что вещество PF-5 менее токсично при внутрижелудочном и внутри-брюшинном введениях, чем препарат-прототип - пинацидил.

Ключевые слова: пинацидил, активаторы калиевых каналов, мочевой пузырь, гиперактивность мочевого пузыря.

Abstract

Lymarenko I.V. The search of novel potential detrusor-selective compounds among guanidine derivatives. - manuscript.

Dissertation for scientific degree of candidate of medical sciences on speciality 14.03.05 - pharmacology. - The Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

Urge urinary incontinence, also known as unstable, hyperreflexive, or hyperactive bladder, is associated with abnormal spontaneous detrusor contractions that can be unrelated to bladder urine volume. Optimal therapy for urinary incontinence depends on a thorough evaluation, followed by treatment of all the likely causes and contributing factors. It has been suggested that a potassium channel openers may be useful in the treatment of detrusor hyperactivity. Potassium channels play a crucial role in controlling physiological function of excitable cells; thus, modulation of these channels provides novel mechanistic approaches to treat cell dysfunction. An increase in potassium channel permeability would hyperpolarize the cell, bring the membrane potential further from the threshold for activation of calcium channels, and reduce excitability. In urinary bladder smooth muscle, ATP-sensitive potassium are inhibited by sulfonylurea analogs such as glyburide and are activated by K_ATP channel openers. Potassium channel openers comprise a structurally diverse group of drugs with a broad spectrum of potential therapeutic applications. Pinacidil, cyanoguanidine derivative, has been shown to evoke concentration-dependent relaxation of isolated bladder smooth muscle strips precontracted by a variety of stimuli, including electrical field, carbachol, or high external [K⁺]. However, because pinacidil also activates vascular smooth muscle channels causing vasodilation, the clinical efficacy has been severely limited by hemodynamic side effects including hypotension and tachycardia. A series of new its analogs have been developed and included in various phases of preclinical investigation. They are expected to be clinically successful only if new molecules are developed with increased tissue specificity coupled with greater potency.

The effects of the a novel fluorine-containing analogues of pinacidil on bladder contractile function were examined in vitro on isolated bladder strips and on vascular tone in vitro on isolated aorta rings. The most selective compound for detrusor tissue was investigated in vivo.

Female rat bladder strips and thoracic aorta rings were analyzed in vitro by method of organ baths. Tissues were contracted with an additional 60 or 15 mM KCl, phenylephrine (1 mM). Compounds were administered directly into the tissue baths. Experiments in vivo were conducted on an adult female rats (250-350 g) anesthetized with urethane (1.2 g/kg). The intravesical pressure was recorded via a catheter passed through the urethra. The catheter was connected via a three-way stopcock to a pressure transducer and to a pump used for infusing fluid into the bladder. The volume of introduced physiological saline solution was 0.1-0.15 ml (in order not to cause micturition reflex) or 0.4 ml (to cause micturition reflex). The maximum effects of the tested compounds were observed approximately 20 min after intraperitoneal administration.

K⁺ produced concentration-related contractions of rat detrusor muscle strips. The presence of 60 mM K⁺ solution induces tonic contractions of the all preparations. All new fluorine-containing analogues of pinacidil concentration-dependently decreased contractions evoked by 60 mM K⁺. Low concentrations of K⁺ (15 mM) enhanced the already existing spontaneous activity. All new fluorine-containing analogues of pinacidil caused a concentration-dependent decrease in contractions amplitude and frequency evoked by 15 mM K⁺. The tested compounds inhibited KCl- and phenylephrine - induced contraction of the rat aortic rings in a concentration-dependent manner. It was shown, that all novel fluorine-containing analogues of pinacidil were less potent than pinacidil as a vascular smooth muscle relaxant. The differences between the EC₅₀ values for the compound PF-5 - mediated relaxation of the rat bladder strips and the EC₅₀ obtained for the relaxation of the rat aorta rings by this agent indicate that compound PF-5 demonstrated selectivity for detrusor smooth muscle over isolated thoracic aorta rings.

The effects of the PF-5 and pinacidil on urinary bladder activity in vivo were evaluated in urethane-anesthetized female Wistar rats. Both compounds decreased intravesical pressure after intraperitoneal administration in a dose-dependent manner. It was shown that experimental compound (1 mg/kg) inhibites the micturition reflex in the rat but does not alter arterial pressure. Preincubation of preparations with glibenclamide (3 mM) depressed the relaxant effect of compound PF-5. glibenclamide caused a rightward shift in the concentration-response curve for the relaxant effect of the tested compound.

The results obtained in the present study show, that compound PF-5 was found to be more potent than pinacidil and others compounds as a bladder smooth muscle relaxant and was found to be less potent than pinacidil and others compounds as a vascular smooth muscle relaxant. Thus, we have demonstrated that structural modifications to prototipical potassium channel opener pinacidil have provided novel compound with potential utility in urological therapeutic areas.

Key words: pinacidil, potassium channel openers, urinary bladder, overactive bladder.

Размещено на Allbest.ru