Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

УДК 616-002.5-079.4:577.21:615.015.8

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Місце й значення полімеразно-ланцюгової реакції у визначенні резистентності збудника туберкульозу до фармакологічних засобів

14.03.05 -- фармакологія

Антоненко Катерина Олексіївна

Одеса 2009

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Протягом останніх 50 років арсенал протитуберкульозних препаратів, на жаль, істотно не змінився [Migliori G. B. et al., 2007]. Водночас в Україні спостерігається швидкий ріст поширеності туберкульозної інфекції, однією з причин якого є високий рівень медикаментозної резистентності збудника туберкульозу [Москаленко В. Ф. і співавт., 2006]. У світі частота мультирезистентного туберкульозу збільшилась з 29,0 до 39,0 %, туберкульозу із розширеною резистентністю -- з 5,0 до 7,0 %, що є однією з головних причин зниження ефективності фармакотерапії хворих на туберкульоз [Петренко В. М. і співавт., 2007]. Головними методами визначення медикаментозної резистентності мікобактерій туберкульозу є метод абсолютних концентрацій і метод пропорцій [наказ МОЗ України «Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції» № 45 від 06.02.2002]. Однак результати дослідження медикаментозної резистентності культуральним методом не завжди є об'єктивними і за часом займають 2-2,5 міс після взяття матеріалу. Отже, цей метод визначення медикаментозної резистентності не забезпечує хворому швидкого і коректного лікування [Ngoc L. N. et al., 2007]. Тому інші методи, зокрема молекулярно-генетичні методи визначення резистентності, є досить привабливими. Протягом останніх двадцяти років дослідження різних ділянок ДНК збудника туберкульозу виявило мутації, що викликають резистентність до основних протитуберкульозних препаратів [Shemyakin I. et al., 2007; Huong N. et al., 2007]. В літературі описана методика визначення мутантних послідовностей в генах rpoB, katG і embB, виникнення яких спричиняє медикаментозну резистентність до рифампіцину, ізоніазиду та етамбутолу відповідно [Mokrousov I. et al. 2002, 2003]. Головними перевагами молекулярно-генетичних методів є їхня висока чутливість і швидкість отримання результатів, проте молекулярні методи майже не застосовуються на Україні [Kozіowska I. et al., 2007; Taegtmeyer M. et al., 2007; Hillemann D. et al., 2007].

Для моніторингу процесу поширення туберкульозної інфекції в розвинутих країнах впроваджено метод генотипування збудника туберкульозу [Cavuєoрlu C. et al., 2007; Alonso-Rodrнguez N. et al., 2008]. Застосування генотипування є визначальним у клініко-епідеміологічних дослідженнях, коли виникає необхідність вирішити питання медикаментозної резистентності, тобто визначити - або це є результатом неефективного лікування (набута резистентність), або це результат інфікування новим штамом мікобактерії туберкульозу. Однак недоліком існуючих методів генотипування є необхідність високотехнологічного обладнання, дорогих реактивів тощо [Бажора Ю. И. і співавт., 2005; Kurepina N. et al., 2005; Martнn A. et al., 2008]. Тому в Україні були проведені лише кілька робіт з генотипування M.tuberculosis [Nikolayevskyy V. V. et al., 2007]. Таким чином, дана робота присвячена дослідженню стану медикаментозної резистентності на прикладі Одеського регіону та вивченню інформативності молекулярних методів визначення медикаментозної резистентності і генотипування медикаментозно-резистентних штамів збудника туберкульозу з метою підвищення ефективності фармакотерапії хворих на туберкульоз.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедри загальної і клінічної фармакології та кафедри клінічної імунології, генетики і медичної біології Одеського державного медичного університету (ОДМУ), затвердженої МОЗ України «Імуногенетичні, епідеміологічні, фармакогенетичні та клініко-мікробіологічні аспекти взаємовідносин у системі «паразит-хазяїн» при туберкульозній інфекції в умовах зростання захворюваності на туберкульоз» (№ держреєстрації 0104U010501). Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є визначення рівня медикаментозної резистентності до протитуберкульозних препаратів і вдосконалення методів її детекції та генотипування медикаментозно-резистентних штамів мікобактерій туберкульозу за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції.

Задачі дослідження:

1. Визначити рівень первинної і набутої резистентності мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів І і ІІ рядів в Одеському регіоні.

2. З'ясувати рівень мутацій в генах rpoB, katG і embB, що відповідають за резистентність мікобактерій туберкульозу до рифампіцину, ізоніазиду і етамбутолу, та можливість їх визначення за допомогою мультиплексної алель-специфічної полімеразно-ланцюгової реакції.

3. Проаналізувати можливу кореляцію між мутаціями в генах rpoB, katG і embB, що відповідають за медикаментозну резистентність мікобактерій туберкульозу, з епідеміологічними факторами, клінічним перебігом захворювання і успішністю фармакотерапії.

4. Вивчити дискретну здатність детекції локусів MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39-MIRU40-ETR A для генотипування резистентних форм збудника туберкульозу.

5. Виявити за даними локусів MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39-MIRU40-ETR A найбільш поширені кластери і групи штамів збудника туберкульозу родини Beijing і групи non-Beijing, що характеризуються високим рівнем резистентності до ізоніазиду і рифампіцину.

Об'єкт дослідження - медикаментозна резистентність збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів І і ІІ рядів.

Предмет дослідження - параметри і шляхи визначення медикаментозної резистентності до протитуберкульозних препаратів за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції.

Методи дослідження - фармакогенетичні, молекулярно-біологічні, мікробіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні за допомогою мультиплексної алель-специфічної полімеразно-ланцюгової реакції проведено детекцію мутацій в генах rpoB, katG і embB, що обумовлюють резистентність мікобактерій туберкульозу до рифампіцину, ізоніазиду та етамбутолу відповідно. Встановлено, що найбільша специфічність спостерігалась при визначенні мутації в гені rpoB, а найбільша чутливість - при визначенні мутації в гені katG.

Вперше проведено дослідження зв'язку між мутаціями в генах rpoB, katG і embB, що обумовлюють медикаментозну резистентність мікобактерій туберкульозу, з епідеміологічними (вживання наркотичних речовин, перебування в місцях позбавлення волі, попередній контакт з хворими на туберкульоз) та клінічними особливостями перебігу туберкульозного процесу (форма туберкульозу, стан хворого на момент виписки зі стаціонару).

Вперше вивчено дискретну здатність визначення 6-ти локусів (MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39- MIRU40-ETR A) для генотипування збудника туберкульозу. Вперше за даними 6-ти локусів (MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39- MIRU40-ETR A) наведено і проаналізовано найбільш поширені кластери збудника туберкульозу, в тому числі і кластери, що характеризувались високим рівнем медикаментозної резистентності.

Практичне значення одержаних результатів. Наведені дані щодо рівня резистентності збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів в Одеському регіоні у 2006 році і динаміки медикаментозної резистентності допомагають у підборі найбільш ефективної фармакотерапії хворих на туберкульоз. Отримані дані щодо ефективності використання полімеразно-ланцюгової реакції у визначенні резистентності мікобактерій туберкульозу до антимікробних засобів дозволяють розширити спектр застосування лікарських препаратів при хіміотерапії хворих на туберкульоз в Україні. Запропоновано удосконалення реакційної суміші для виявлення мутації в гені katG, що покращує якість результатів визначення резистентності збудника туберкульозу до ізоніазиду і знайшло відображення у отриманому патенті України № 29211 від 10.01.2008р.

Результати роботи впроваджено у наукову роботу відділу патофізіології Інституту фармакології та токсикології АМН України, навчальний процес кафедр фармакології та клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Дніпропетровської державної медичної академії, кафедр загальної та клінічної фармакології, фтизіатрії, клінічної імунології, генетики і медичної біології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок дисертанта. Здобувач самостійно вивчив і узагальнив сучасний стан проблеми за даними інформаційних джерел, сформулював мету і задачі дослідження, здійснив планування. Самостійно освоїв методи експе-риментальних досліджень і виконав запланований обсяг експериментів. Зробив узагальнення і провів аналіз отриманих результатів, опублікував і апробував основні дані, написав і оформив дисертаційну роботу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були апробовані на науково-практичних конференціях молодих вчених з міжнародною участю „Вчені майбутнього” (Одеса, 2005, 2006); ХII міжнародній науково-практичній конференції «Спортивна медицина, лікувальна фізкультура та валеологія - 2006» (Одеса, 2006); науковій конференції з міжнародною участю “Національній фармакології - 35 років” (Кишинів, Молдова, 2006); ІІ міжнародній науково-практичній конференції „Розвиток наукових досліджень'2006” (Полтава, 2006); конференції, приуроченій до Дня Науки „Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни” (Львів, 2007); ІІІ з'їзді фармакологів Росії «Фармакология -- практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, Росія, 2007); республіканській науково-практичній конференції „Лікування та реабілітація у загальній практиці-сімейній медицині” (Одеса, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми фармакології» (Вінниця, 2007), 38-ій Всесвітній конференції з захворювань легень (Кейптаун, Південна Африка, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Молодь - медицині майбутнього» (Одеса, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових праць, з яких 5 статей надруковано в наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 патент України, 11 тез у міжнародних та вітчизняних виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 167 сторінках комп'ютерного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 2 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури. Робота ілюстрована 44 таблицями і 32 рисунками. Бібліографічний покажчик включає 182 джерела, з них 61 - кирилицею.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Ретроспективне та проспективне вивчення резистентності M.tuberculosis до протитуберкульозних засобів було виконано в бактеріологічній лабораторії Одеської обласної клінічної протитуберкульозної лікарні (ООКПТЛ). Всього було проаналізовано дані про 224 культури збудника туберкульозу, з них 66 культур були виділені від хворих, які вперше лікувались з приводу туберкульозу, і 158 культур - від хворих з повторним лікуванням. Задля забезпечення об'єктивності визначення епідеміологічної ситуації щодо особливостей поширеності медикаментозної резистентності був використаний метод «поперечного зрізу» [Флетчер Р. и соавт., 1998]. Окремо вивчали рівень первинної і вторинної (набутої) резистентності збудника туберкульозу за даними бактеріологічної лабораторії ООКПТЛ. Вивчали медикаментозну резистентність до препаратів І ряду - ізоніазиду, рифампіцину, стрептоміцину, етамбутолу і піразинаміду, і ІІ ряду - канаміцину, амікацину, рифабутину, етіонаміду, офлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, ломефлоксацину, пефлоксацину, пара-аминосалицилової кислоти (ПАСК) [наказ МОЗ України «Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції» № 45 від 06.02.2002 р.]. Дослідження проводили згідно вимог комісії біоетики ОДМУ (протокол № 19А від 26 січня 2007 р.).

У ході досліджень були проведені ретельний аналіз і співставлення даних лабораторної (бактеріологічної) служби з медичними картками хворих після їх виписки з ООКПТЛ. Показники медикаментозної резистентності, поширеності геннихмутацій, що пов'язані з медикаментозною резистентністю, порівнювались з показниками попередніх років.

Для вивчення резистентності штамів M. tuberculosis за допомогою мультиплексної алель-специфічної полімеразно-ланцюгової реакції (МАС-ПЛР) були обрані зразки 107 культур, виділені від пацієнтів ООКПТЛ [Mokrousov I. et al., 2002; 2003]. Виділення ДНК проводилось в бактеріологічній лабораторії ООКПТЛ з використанням хлороформу та центрифугування [Бажора Ю. И. и соавт., 2005].

Виявлення медикаментозної резистентності до ізоніазиду проводили шляхом визначення мутантних послідовностей в кодоні 315 гена katG за допомогою 3-ох праймерів; резистентності до рифампіцину - за допомогою визначення мутантних послідовностей в кодонах 516, 526, 531 гена rpoB з використанням відповідних 3-ох внутрішніх прямих праймерів і 1-го зворотного праймеру; резистентності до етамбутолу - шляхом визначення мутацій 1-го та 3-го нуклеотидів кодону 306 гена embB за допомогою 4-ох внутрішніх та 2-ох зовнішніх праймерів.

Для визначення питання про приналежність певного штаму M.tuberculosis до родини Beijing також використовували ПЛР [Banu S. еt al., 2004]. Методика мала на меті виявлення інсерційного фрагменту IS6110 в міжгенному регіоні dnaA-dnaN, що є характерною рисою родини Beijing, за допомогою 2-ох праймерів.

Для генотипування збудника туберкульозу було проведено дослідження 6-ти локусів, що були найбільш поліморфними для M.tuberculosis (MIRU10, MIRU26, MIRU31, MIRU39, MIRU40 та ETR А), методом ПЛР із залученням відповідних праймерів [Supply P. et al., 2000].

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програмного пакету Microsoft Excel з використанням ч2 критерію [Флетчер Р. и соавт., 1998].

Результати дослідження. Рівень медикаментозної резистентності збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів в Одеському регіоні. Частота первинної резистентності до препаратів І ряду була найнижчою у піразинаміду - 22,2 % і найвищою у стрептоміцину і рифампіцину - 59,3 і 61,1 % відповідно (табл. 1). Резистентність до етамбутолу і ізоніазиду в цій категорії хворих склала 57,4 і 35,2 %; лише 9,3 % культур були чутливими до всіх п'яти препаратів І ряду, водночас 22,2 % були мультирезистентними (одночасно резистентні до ізоніазиду і рифампіцину) і 5,6 % були нечутливими до всіх п'яти препаратів І ряду.

Показники вторинної резистентності культур M.tuberculosis до препаратів І ряду були найнижчими для піразинаміду - 42,9 % і найвищими для рифампіцину - 80,6 %. Резистентність до ізоніазиду, етамбутолу і стрептоміцину відзначалась у 68,2-72,9 % випадків; тільки 5,9 % культур зберігали чутливість до всіх препаратів І ряду. Натомість 31,2 % культур були резистентними до всього І ряду, а 64,1 % культур - мультирезистентними.

Таблиця 1. Рівень медикаментозної резистентності до протитуберкульозних препаратів I ряду серед хворих на туберкульоз легень

Назва препарату	Штами з первинною резистентністю, n=54	Штами з набутою резистентністю, n=170	Загалом, n=224
Чутливість до І ряду	5	10	15
Ізоніазид	19	117*	136
Рифампіцин	33	137*	170
Піразинамід	12	73*	85
Стрептоміцин	32	124	156
Етамбутол	31	116	147
Мультирезистентність	12	109*	121
Резистентність до І ряду	3	53*	56

Примітка: у табл. 1 і 2 * - Р<0,05 (відносно рівня первинної резистентності)

За даними, що були отримані нами у 2006 р., поширеність резистентності збудника туберкульозу до ізоніазиду і рифампіцину, порівняно з даними В. В. Ніколаєвського (2004 р.), збільшилась у 2,7-4,1 рази. В цей же період рівень мультирезистентності збільшився майже в 5,5 рази, а збереження чутливості до дії усіх протитуберкульозних препаратів І ряду скоротилась у 7,2 рази.

Рівень первинної резистентності до протитуберкульозних препаратів ІІ ряду був найвищим для пефлоксацину, етіонаміду і амікацину (табл. 2). Найнижчими були показники первинної резистентності до канаміцину, ПАСК, ломефлоксацину, левофлоксацину і офлоксацину. Найбільший рівень набутої резистентності спостерігався відносно пефлоксацину, етіонаміду, амікацину і рифабутину, а найнижчий рівень - відносно ломефлоксацину, ПАСК, левофлоксацину і офлоксацину.

Серед штамів, що були виділені від хворих, які лікувались з приводу туберкульозу вперше, 66,7 % мали одночасну резистентність не більше ніж до 3-х препаратів ІІ ряду; водночас, серед штамів, що були отримані від хворих під час повторного лікування, 59,0 % мали одночасну резистентність від 4-х до 10-ти препаратів. Одночасна резистентність до 7 і більше протитуберкульозних препаратів ІІ ряду відмічалась лише під час повторного лікування.

Таблиця 2. Рівень медикаментозної резистентності до протитуберкульозних препаратів ІI ряду серед хворих на туберкульоз легень

Назва препарату	Штами з первинною резистентністю, n=51	Штами з набутою резистентністю, n=173	Загалом, n=224
Етіонамід	39	135	174
Пефлоксацин	39	139	178
Амікацин	34	122	156
Рифабутин	11	122*	133
Ципрофлоксацин	11	56	67
Канаміцин	5	63*	68
ПАСК	3	23	26
Ломефлоксацин	2	29*	31
Левофлоксацин	2	21	23
Офлоксацин	0	21*	21

Зростання кількості протитуберкульозних препаратів ІІ ряду, до яких фіксувалась резистентність збудника туберкульозу, спостерігалось в молодшій віковій групі і серед пацієнтів, які не палили. Більш високий рівень резистентності до препаратів ІІ ряду асоціювався з більш високою частотою хронічної форми туберкульозу, збереженням бактеріовиділення і процесів інфільтрації в легенях на момент виписки із стаціонару, а також зі збільшенням тривалості стаціонарного лікування.

Згідно отриманих даних, 73,3 % рифампіцин-резистентних штамів з первинною резистентністю зберігали чутливість до рифабутину, водночас лише 20,7 % рифампіцин-резистентних штамів з набутою резистентністю зберігали аналогічну чутливість.

Отримані дані щодо резистентності штамів M.tuberculosis до фторхінолонів значно перевищували результати, визначені в сусідній Миколаївській області в 2003 р. Так, первинна резистентність до ципрофлоксацину і левофлоксацину в Одеській області була в 12 і 3 рази вище відповідно, а вторинна - 9 і 8 разів відповідно [Асмолов О. К. і співавт., 2004].

Серед ДНК-ізолятів культур збудника туберкульозу мутація в кодоні 315 гена katG була виявлена в 54,2 %. Для покращення ефективності застосованої методики визначення мутації в гені katG автором було запропоновано удосконалення реакційної суміші [Антоненко К.О. і співавт., 2007]. Серед ізолятів, що мали мутацію кодона 315 гена katG, 84,5 % були резистентними до ізоніазиду. З числа культур із резистентністю до ізоніазиду 87,5 % мали мутацію в кодоні 315 гена katG. Отже, специфічність даного методу визначення резистентності до ізоніазиду склала 84,5 %, чутливість - 87,5 %.

Поширеність досліджуваних мутацій в гені rpoB складала 44,9 %. З цього числа 4,8 % складали мутації в кодоні 516 гена rpoB; 14,3 % - мутації в кодоні 526, і решта - 80,9 % - мутації в кодоні 531. Серед ізолятів, що мали мутацію в одному з кодонів 516/526/531 гена rpoB, 93,8 % були резистентними до рифампіцину. Серед культур з резистентністю до рифампіцину лише 49,5 % мали мутацію в одному з кодонів 516/526/531 гена rpoB. Отже, специфічність даного методу визначення резистентності до рифампіцину склала 93,8 %, чутливість - 49,5 %. Порівнянно з 2003-2004 рр. в Одеському регіоні рівень мутацій в кодоні 315 гена katG майже не змінився, водночас відбулось зростання поширеності мутацій в гені rpoB майже в 1,5 рази [Ніколаєвський В. В. і співав., 2004].

Серед отриманих ДНК-ізолятів культур збудника туберкульозу мутація в кодоні 306 гена embB була виявлена у 15,0 %. З числа ізолятів, що мали мутацію кодона 306 гена embB, 68,8 % були резистентними до етамбутолу. Далі, серед культур з резистентністю до етамбутолу 18,6 % мали мутацію в кодоні 306 гена embB. Таким чином, специфічність і чутливість даного методу визначення резистентності до етамбутолу становила 68,8 % і 18,6 % відповідно. Отже, застосований метод МАС-ПЛР виявив високу специфічність при визначенні резистентності збудника туберкульозу до рифампіцину та ізоніазиду, і значно меншу специфічність до етамбутолу.

Співставлення поширеності мутацій в генах rpoB, katG збудника туберкульозу і особливостей перебігу туберкульозного процесу. Застосування ін'єкційних наркотичних речовин було майже втричі вище серед хворих, які виділяли штами з мутацією в гені katG; також ці хворі вдвічі частіше попередньо перебували в місцях позбавлення волі та в 1,7 рази частіше мали попередній контакт з хворими на туберкульоз, ніж хворі, які виділяли «дикий» штам (табл. 3).

Пацієнти, які виділяли штами збудника туберкульозу з мутацією в кодоні 516/526/531 гена rpoB, в 1,8 рази частіше раніше перебували в місцях позбавлення волі та в 1,6 рази частіше попередньо отримували протитуберкульозне лікування.

полімеразний ланцюговий резистентність туберкульоз

Таблиця 3. Поширеність можливих факторів ризику серед хворих з/без мутації в кодоні 315 гена katG

Групи хворих Фактори ризику	Мутація в кодоні мутації в кодоні 315 гена katG
	Мутація є, n=58	Мутації нема, n=49	Загалом, n=107
Тютюнопаління	47	42	89
Зловживання алкоголем	30	20	50
Вживання наркотиків	14	4*	18
ВІЛ-інфекція	19	11	30
Перебування в місцях позбавлення волі	24	10*	34
Контакт з хворими на туберкульоз	36	18*	54
Попереднє протитуберкульозне лікування	40	14*	54

Примітка. * - P<0,05 (відносно хворих, які виділяли штами збудника туберкльозу з мутацію в кодоні 315 гена katG)

Пацієнти, які виділяли збудника без мутації в кодоні 315 гена katG майже в 1,5 рази частіше мали вперше діагностований туберкульоз і майже в 3 рази рідше хворіли на хронічний туберкульоз, ніж хворі, які виділяли мутовані штами. Серед хворих, які виділяли збудника туберкульозу без мутації в гені katG, процеси розсмоктування туберкульозних інфільтратів і рубцювання туберкульозних порожнин в легенях спостерігались в 3,3 рази частіше, а також в 3 рази частіше досягалась абацилярність на момент виписки із протитуберкульозного стаціонару, ніж серед хворих, які виділяли мутовані штами (табл. 4).

Пацієнти, які виділяли збудника туберкульозу з мутацією в кодоні 516/526/531 гена rpoB, в 1,5 рази рідше мали вперше діагностований туберкульоз і 2,6 рази частіше хворіли на хронічний туберкульоз, ніж хворі, які виділяли штами без даної мутації. Також у хворих, які виділяли немутовані штами, в 2,6 рази частіше мали місце процеси розсмоктування туберкульозних інфільтратів і рубцювання туберкульозних порожнин в легенях, а також в 1,9 рази частіше досягалась абацилярність на момент виписки із протитуберкульозного стаціонару, ніж у пацієнтів, які виділяли мутовані штами.

Таблиця 4. Поширеність мутації в кодоні 315 гена katG у збудника туберкульозу і успішність лікування хворих на туберкульоз

Групи хворих Успішність лікування	Мутація в кодоні 315 гена katG у збудника туберкульозу
	Мутація є, n=58	Мутації немає, n=49	Загалом, n=107
Причина виписки	Продовження лікування	20*	34	54
	Перерва лікування	30*	13	43
	Смерть	7*	1	8
	Інше	1	1	2
Розсмоктування туберкульозних інфільтратів і туберкульозних порожнин	9	25	34
Бактеріовиділення за даними мікроскопії	44	10	54
Бактеріовиділення за даними культурального методу	54	41	95

Примітка. * - P<0,05 (відносно хворих, які виділяли штами збудника туберкульозу без мутації, що вивчалась)

Серед причин виписки у хворих, що виділяли штам M.tuberculosis з мутацією в гені katG або в гені rpoB, переважала перерва лікування - 51,7 і 54,2 % відповідно, тоді як у хворих з немутованими штамами - переведення на амбулаторне лікування - 69,4 і 62,7 % відповідно. Згідно сучасної стратегії лікування туберкульозу саме отримання всього курсу протитуберкульозної фармакотерапії є обов'язковим для успішного лікування. Мутація в кодоні katG супроводжувалась майже в 7 разів вищою смертністю. Таким чином, відсутність мутацій в генах rpоB і katG є важливим прогностичним критерієм успішності лікування.

Загалом 43,0 % штамів збудника туберкульозу належали до родини Beijing, що дещо вище даних 2003 р. - 39,6 % [Ніколаєвський В. В. і співав., 2004]. Серед штамів родини Beijing частіше спостерігались мутації в кодоні 315 гена katG або/та в кодоні 516/526/531 гена rpoB, або/та в кодоні 306 гена embB (табл. 5). Отримані дані підтвердили зв'язок мутацій в генах katG і rpoB, що вивчались, з низкою епідеміологічних факторів ризику, особливостями перебігу захворювання, а також наслідками лікування хворих на туберкульоз.

Таблиця 5. Поширеність мутацій в генах rpoB, katG, embB серед різних штамів збудника туберкульозу (%)

Ген збудника туберкульозу	Родина Beijing	Група non-Beijing
Первинна мутація
katG	53,3	17,9*
rpoB	40,0	14,3*
embB	13,3	3,6
katG + rpoB	33,3	7,1*
Набута мутація
katG	77,8	64,3
rpoB	63,0	50,0
embB	25,9	14,3
katG + rpoB	55,6	39,3*

Примітка. * - P<0,05 (відносно штамів, що належали до родини Beijing)

Результати генотипування збудника туберкульозу в Одеському регіоні. Для ідентифікації штамів збудника туберкульозу з високим рівнем мутацій в генах katG і rpoB, що вивчались, нами було проведено генотипування ДНК-ізолятів M.tuberculosis. Згідно генотипуванню штамів збудника туберкульозу за даними 6-ти локусів (MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39-MIRU40-ETR A) було виявлено, що найбільш поширеною комбінацією серед штамів родини Beijing була 355335 (5 культур), рідше зустрічались комбінації 355344, 355345, 356335, 356344, 365334, 375334, 375344, 385334 (кожна комбінація зустрічалась у 2 культур) і 385345 (3 культури). Найчастіше серед штамів групи non-Beijing відзначались комбінації 452242 (6 культур); 562242 і 712234 (по 3 культури кожна); 353233, 363233, 452252, 553213 (по 2 культури кожна). Причому серед останньої групи були кластери, близькі до групи Cameroon (353233 і 363233), до групи LAM (452242 і 452252), до групи Harlem (553213) та до групи URAL (712234). Отримані дані є близькими до даних, одержаних в центральному регіоні Росії, де серед ізолятів збудника туберкульозу домінували штами родин LAM і Beijing [Иванов И. Ю. и соавт., 2004]. Ці штами відрізнялись значним поширенням і відіграють велику роль у поширенні туберкульозної епідемії.

Згідно з індексом Хантера-Гастона комбіноване визначення всіх 6-ти локусів для генотипування як серед ізолятів групи Beijing, так і серед зразків групи non-Beijing, було високоефективним: 0,88 і 0,93 відповідно.

Мутація в гені katG серед штамів родини Beijing мала місце у 80 % ізолятів з комбінацією 355335 і у 100 % кластерів 355345, 375334, 375344, 385334 і 385345. Мутація в гені rpoB мала місце у 100 % кластерів 375344, 385334 і 385345. Кожний другий ізолят з числа зразків, що належали до родини Beijing, мав одночасно мутації в кодоні 315 гена katG і кодоні 516/526/531 гена rpoB. Було з'ясовано, що одночасно мали обидві зазначені мутації ДНК-ізоляти з наступними комбінаціями: 375344, 385345 і 385334 (100 %).

Мутація в гені katG мала місце у 100 % кластерів групи non-Beijing 553213 і 712234. Мутація в гені rpoB мала місце у 100 % кластерів 452252 і 712234. З ДНК-ізолятів, що належали до групи non-Beijing, лише 25,0 % одночасно мали мутації, що досліджувались, в генах katG і rpoB. Більша частина культур з комбінацією 452242 (5 культур з 6) одночасно мали обидві мутації, що досліджувались.

Кластер 375334 в 100 % випадків був виділений від хворих, що також були ВІЛ-позитивними; в 100 % випадків хвороба закінчувалась смертю хворого протягом одного року; в 100 % хворобі передував контакт з хворим на туберкульоз. Всі хворі, що виділяли збудника туберкульозу групи non-Beijing з профілем 553213, мали ВІЛ-інфекцію (смертність протягом 2006 р. - 50 %).

Отримані дані засвідчили високий рівень та подальше зростання в Одеському регіоні як первинної, так і набутої медикаментозної резистентності збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів І-ІІ рядів; виявили фактори, що корелюють з поширеністю резистентності до препаратів ІІ ряду. Отримано дані щодо інформативності методу МАС-ПЛР для визначення поширеності мутацій, що досліджувались, в генах katG, rpoB і embB; виявлено поширеність цих мутацій у збудника туберкульозу; з'ясовано фактори (епідеміологічні, клінічні), що корелюють із розповсюдженням мутацій в генах katG, rpoB і embB.

Отримані дані засвідчили, що високий рівень мутацій, які обумовлювали резистентність до рифампіцину та ізоніазиду, і мультирезистентності за культуральними даними є притаманним для певних кластерів збудника туберкульозу. Виявлено кластери, що були найбільш поширеними серед ВІЛ-інфікованих хворих. Таким чином, результати роботи засвідчили значення і можливості молекулярно-генетичних методів у детекції резистентності до найефективніших протитуберкульозних засобів - ізоніазиду та рифампіцину, а також у ідентифікації штамів збудника туберкульозу, що відігравали велику роль у поширенні штамів з високим рівнем медикаментозної резистентності.

Висновки

У дисертації наведено нове вирішення актуальної проблеми фармакології - підвищення ефективності фармакотерапії хворих на туберкульоз, яке полягає в обґрунтуванні застосування полімеразно-ланцюгової реакції для відстеження поширеності медикаментозно-резистентних штамів збудника туберкульозу. Обґрунтовано та впроваджено експрес-метод визначення мутацій в генотипі збудника туберкульозу як маркер медикаментозної резистентності та прогностичний критерій ефективності лікування туберкульозу.

1. В Одеському регіоні в 2006 р. найнижчий рівень первинної резистентності до протитуберкульозних препаратів І ряду був у піразинаміду - 22,2 %, а найвищим - у стрептоміцину і рифампіцину - 59,3 і 61,1 % відповідно; мультирезистентність виявлялась у 22,2 %. Найнижчий рівень вторинної резистентності до препаратів І ряду був зареєстрований також у піразинаміду - 42,9 %, а найвищий - у рифампіцину - 80,6 %; мультирезистентність складала 64,1 %. Рівень первинної резистентності до протитуберкульозних препаратів ІІ ряду був найвищим у пефлоксацину, етіонаміду і амікацину і перебував у діапазоні 66,7-76,5 %. Найнижчими показники первинної резистентності були у канаміцину, ПАСК, ломефлоксацину, левофлоксацину і офлоксацину - від 0 до 9,8 %, що підтверджує резервну роль цих фармакологічних препаратів.

2. Метод мультиплексної алель-специфічної ПЛР, що застосовувався, виявив найбільшу специфічність при визначенні мутації в гені rpoB, що досягала 93,8 %, і найбільшу чутливість при визначенні мутації в гені katG, що дорівнювала 87,5 %. Одержані результати підтверджують можливість застосування цього методу для експрес-діагностики медикаментозної резистентності збудника туберкульозу до ізоніазиду і рифампіцину. Поширеність мутацій в генах katG, rpoB, і embB, що асоціюються з резистентністю M.tuberculosis до ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу, в Одеському регіоні складала 54,2, 44,9 і 15,0 % відповідно.

3. Мутації в генах katG і rpoB, що обумовлюють резистентність збудника туберкульозу до ізоніазиду і рифампіцину, спостерігались частіше у хворих, які раніше перебували в місцях позбавлення волі, або раніше вже отримували протитуберкульозну терапію, що свідчить про значне поширення медикаментозно-резистентних штамів в пеніцитарних закладах та розвиток резистентності під час протитуберкульозної терапії. Наявність цих мутацій асоціювалась з меншою ефективністю протитуберкульозної хіміотерапії, що клінічно проявлялось у гальмуванні процесів розсмоктування і рубцювання осередків у легенях, збереженні бактеріовиділення. Обґрунтовано доцільність та доведено важливість визначення мутацій в генах katG і rpoB як прогностичного критерію успішності лікування туберкульозу.

4. Генотипування збудника туберкульозу за 6-ма локусами виявило високу дискретну здатність цього методу. Було виявлено штами родини Beijing, а також штами з груп LAM, URAL, що відрізнялись високим рівнем медикаментозної резистентності. Було проведено генотипування штамів збудника туберкульозу з дуже високим рівнем резистентності до ізоніазиду і рифампіцину, носії яких мали попередній туберкульозний контакт, тобто ці ізоляти мали особливе значення у поширенні медикаментозно резистентних штамів збудника туберкульозу серед населення Одеського регіону.

5. За результатами визначення локусів MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39-MIRU40-ETR A серед ізолятів родини Beijing і групи non-Beijing були виявлені кластери, що мали високий рівень мутацій генів katG і rpoB, які обумовлювали резистентність до ізоніазиду та рифампіцину відповідно. Зокрема, обидві мутації були присутні у кластерів 375344, 385334, 712234.

6. Отримані результати підтвердили актуальність постійного моніторингу рівня медикаментозної резистентності збудника туберкульозу, що дозволить покращити ефективність застосування протитуберкульозних препаратів.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Антоненко К. О. Поширеність медикаментозної резистентності у збудника туберкульозу та інформативність її генотипичного визначення / В. Й. Кресюн, К. О. Антоненко, О. К. Лобанов, В. А. Штанько // Досягнення біології та медицини. -- 2007. -- № 2. -- С. 74-80. Внесок дисертанта -- провела аналіз джерел літератури, експерименти, статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів, написала та оформила роботу.

2. Антоненко К. О. Визначення та поширеність мутацій, що пов'язані з медикаментозною резистентністю, в генотипі збудника туберкульозу / К. О. Антоненко, В. Й. Кресюн // Вісник проблем біології і медицини. -- 2007. -- Вип.4 -- С. 124-132. Внесок дисертанта -- розробка методології експерименту, огляд літератури, проведення досліджень, аналізу та узагальнення результатів, написання статті.

3. Антоненко К. О. Рівень резистентності збудника туберкульозу до рифампіцину і можливість її генотипічного визначення / К. О. Антоненко // Одеський медичний журнал. - 2008. -- № 1 (105). - С. 24-28.

4. Антоненко К. О. Вивчення резистентності збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів І-ІІ ряду / В. Й. Кресюн, К. О. Антоненко // Клінічна фармація. - 2008. - № 3. - С. 19-24. Внесок дисертанта -- розробка методології експерименту, проведення аналізу джерел літератури, досліджень, статистична обробка результатів, їх аналіз, написання та оформлення статті.

5. Антоненко К. О. Інформативність генотипування збудника туберкульозу / В. Й. Кресюн, К. О. Антоненко // Одеський медичний журнал. - 2008. - № 5 (109). - С. 26-30. Внесок дисертанта -- розробила методологію експерименту, провела огляд літератури, дослідження, аналіз та узагальнення результатів, написала статтю.

6. Пат. 29211 Україна, МПК (2006) А61К 31/00, С12Q 1/68, С12R 1/32 Склад реактивної суміші для діагностики резистентності до ізоніазиду збудника туберкульозу / Антоненко К. О., Кресюн В. Й, Антоненко П. Б. (Україна). ; заявник і патентовласник Одес. держ. мед. ун-т. - № u200708746 ; заявл. 30.07.2007 ; опубл. 10.01.2008, Бюл. №1. - 4 с. Внесок дисертанта -- провела аналіз результатів експериментів, написала та оформлила патент.

7. Антоненко Е. А. Современные пути генотипирования возбудителя туберкулеза / Е. А. Антоненко, П. Б. Антоненко // Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини : ХII Міжнар. наук.-практ. конф., 5-6 жовт. 2006 р. : матеріали. -- Одеса : ОДМУ, 2006. -- С. 28. Внесок дисертанта -- розробила методологію експерименту, провела дослідження, аналіз та узагальнення результатів, написала тези.

8. Антоненко К. О. Нові можливості діагностики лікарської резистентності збудника туберкульозу / К. О. Антоненко, П. Б. Антоненко, М. М. Чеснокова // “Вчені майбутнього”: науково-практична конф. молодих вчених з міжнародною участю, 25-26 жовт. 2006 р. : тези доп. - Одеса, 2006. - С. 50. Внесок дисертанта -- провела аналіз джерел літератури, експерименти, статистичну обробку, аналіз результатів, написала та оформила тези.

9. Антоненко К. О. Медикаментозна резистентність збудника туберкульозу шляхи діагностики / К. О. Антоненко, П. Б. Антоненко // Розвиток наукових досліджень'2006 : друга міжнародна наук.-практ. конф., 27-29 листоп. 2006 р. : матеріали. - Полтава, 2006. - Т. 5. - С. 9-10. Внесок дисертанта -- провела аналіз джерел літератури, експерименти, статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів, написала та оформила тези.

10. Antonenko K. O. Detection of isoniazid-resistance mycobacterium tuberculosis / V. I. Kresyun, K. O. Antonenko, P. B. Antonenko // Revista Farmaceuticг a Moldovei: Ediюie specialг. -- Conferinюa єtinюificг "Farmacologia Naюionalг la 35 ani" a Societгюii єtiintifice a farmacologilor din Republica Moldova cu participare internaюionalг. -- Chiєinгu, 2006. -- P.19-20. Внесок дисертанта -- збір та аналіз експериментального матеріалу, переклад на англійську мову, оформлення тез до друку.

11. Антоненко К. О. Поширеність медикаментозної резистентності збудника туберкульозу в Одеському регіоні та можливості їх детекції за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції / В. Й. Кресюн, К. О. Антоненко, П. Б. Антоненко // Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни : конференція приурочена до Дня Науки., трав. 2007 р. : матеріали. - Львів, 2007. - С. 197-199. Внесок дисертанта -- розробила методологію експерименту, провела експерименти, статистичну обробку, аналіз результатів, написала та оформила тези.

12. Антоненко К. О. Стан медикаментозної резистентності збудника туберкульозу в Одеському регіоні станом на 2006 рік / К. О. Антоненко, П. Б. Антоненко, В. В. Годован // Лікування та реабілітація у загальній практиці-сімейній медицині : Українська респ. наук.-практ. конф., 11-12 трав. 2007 р. : матеріали. - Одеса, 2007. - С. 3-4. Внесок дисертанта -- збір та аналіз експериментального матеріалу, оформлення тез до друку.

13. Антоненко Е. А. Определение изониазид-устойчивости возбудителя туберкулёза / В. И. Кресюн, Е. А. Антоненко, В. В. Годован, П. Б. Антоненко // Психофармакология и биол. наркология. -- 2007. -- Т. 7, спец. вып. (сентябрь). -- Ч. 1 (А-Л). -- С. 1-1750. (Фармакология -- практическому здравоохранению: III съезд фармакологов России. Санкт-Петербург, 23-27 сент. 2007 р. : материалы) Внесок дисертанта -- провела експерименти, статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, написала та оформила тези.

14. Антоненко К. О. Генотипичне визначення медикаментозної резистентності збудника туберкульозу та його інформативність / К. О. Антоненко // Вісник Вінницького національного медичного університету. -- 2007. -- № 11 (2/2). -- С. 756-757 (Актуальні проблеми фармакології: наук.-практ. конф. з міжнар. участю, присвячена 70-річчю кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова. Вінниця, 28-29 верес. 2007 р. : тези доп.).

15. Антоненко К. О. Рівень резистентності збудника туберкульозу до рифампіцину та можливість її генотипичного визначення / К. О. Антоненко // “Вчені майбутнього” : наук.-практ. конф. молодих вчених з міжнародною участю., 15-16 жовт. 2007 р. : тези доповідей - Одеса, 2007. - С. 59.

16. Antonenko K. O. Detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis / P. B. Antonenko, K. O. Antonenko, V. I. Kresyun // The International journal of tuberculosis and lung diseases. - 2007. - Vol. 11, № 11 (suppl. 1). - P. 68-69. (38th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (The Union). Cape Town, 8-12 November 2007 : abstract presentations.). Внесок дисертанта -- збір та аналіз експериментального матеріалу, переклад на англійську мову, оформлення тез до друку.

17. Антоненко К. О. Поширеність резистентності збудника туберкульозу до препаратів другого ряду в Одеському регіоні / К. О. Антоненко // „Молодь - медицині майбутнього : науково-практична конф., 24-25 квіт. 2008 р. : тези доповідей - Одеса, 2008. - С. 125.

Анотація

Антоненко К.О. Місце й значення полімеразно-ланцюгової реакції у визначенні резистентності збудника туберкульозу до фармакологічних засобів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України.- Одеса, 2009.

В роботі проведено дослідження показників резистентності M.tuberculosis до протитуберкульозних препаратів в Одеському регіоні, а також можливостей методу полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) для визначення та відстеження резистентних штамів збудника туберкульозу. Показано, що в 2006 р. серед протитуберкульозних препаратів І і ІІ рядів медикаментозна резистентність була найменшою для піразинаміду і офлоксацину, а найбільшою - для рифампіцину і пефлоксацину. Метод мультиплексної алель-специфічної ПЛР виявив найбільшу специфічність при визначенні мутацій в гені rpoB і найбільшу чутливість при визначенні мутації в гені katG, що відповідали за резистентність до рифампіцину та ізоніазиду. Присутність мутацій в генах katG і rpoB частіше спостерігалась у хворих після перебування в місцях позбавлення волі або підчас повторного лікування. Також наявність цих мутацій супроводжувалась меншою ефективністю лікування туберкульозу. За результатами визначення 6- ти локусів високий рівень мутацій в генах katG і rpoB відзначався серед низки кластерів і груп M.tuberculosis. Отримані дані підтвердили важливість моніторингу медикаментозної резистентності збудника туберкульозу, засвідчили можливості і значення ПЛР-методу для визначення та ідентифікації резистентних штамів M.tuberculosis.

Ключові слова: медикаментозна резистентність, M.tuberculosis, полімеразно-ланцюгова реакція.

Аннотация

Антоненко Е.А. Место и значение полимеразно-цепной реакции в определении резистентности возбудителя туберкулеза к фармакологическим средствам. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины. - Одесса, 2009.

В работе проведено исследование уровня и динамики устойчивости M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам в Одесском регионе, а также возможностей метода полимеразно-цепной реакции (ПЦР) для определения и отслеживания резистентных штаммов возбудителя туберкулеза.

На примере Одесского региона показано, что в 2006 году сохранялся высокий уровень лекарственной устойчивости M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам. Среди препаратов І ряда первичная и вторичная резистентность была наименьшая для пиразинамида и наибольшая - для рифампицина. Уровень первичной устойчивости к противотуберкулезным препаратам ІІ ряда был наибольшим для пефлоксацина и этионамида, а наименьшим - для левофлоксацина и офлоксацина.

Метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР проявил наибольшую специфичность при определении мутаций в гене rpoB, составив 93,8 %, и наибольшую чувствительность при определении мутации в гене katG, составив 87,5 %. Частота мутаций в генах katG, rpoB, і embB, которые обусловливали устойчивость M.tuberculosis к изониазиду, рифампицину и этамбутолу составляла 54,2, 44,9 и 15,0 % соответственно. По сравнению с 2003 г. распространенность мутации в гене katG практически не изменилась, а частота мутаций в гене rpoB выросла практически в 1,5 раза.

Мутации в генах katG и rpoB отмечались чаще у больных, ранее находившихся в местах лишения свободы или ранее уже лечившихся по поводу туберкулеза, что свидетельствовало о значительном распространении лекарственно резистентных штаммов в пеницитарных учреждениях и развитии устойчивости во время противотуберкулезной терапии. Наличие выше указанных мутаций ассоциировалось со сниженной эффективностью противотуберкульозной химиотерапии, что клинически проявлялось торможением процессов рассасывания и рубцевания туберкулезных очагов в легких, сохранением бактериовыделения на момент выписки пациентов из стационара, более высоким уровнем летальности на протяжении года.

Генотипирование возбудителя туберкулеза по 6-ти локусам (MIRU10-MIRU26-MIRU31-MIRU39-MIRU40-ETR A) выявило высокую дискретную способность этого метода. Были обнаружены штаммы семейства Beijing, а также групп LAM, URAL, которые отличались высоким уровнем лекарственной резистентности. Было проведено генотипирование штаммов возбудителя туберкулеза с высоким уровнем резистентности к изониазиду и рифампицину, носители которых имели предварительный туберкулезный контакт, так как эти изоляты имели особое значение в распространении медикаментозно резистентных штаммов возбудителя туберкулеза среди населения Одесской области. В результате определения выше указанных локусов были обнаружены такие кластеры, как 355335, 375344, 385334 і 385345, 712234 и 452242, которые имели высокий уровень мутаций в генах katG и rpoB.

Полученные результаты подтвердили актуальность мониторинга показателей, которые определяют лекарственную устойчивость возбудителя туберкулеза в Одесском регионе, засвидетельствовали значение и возможности молекулярно-генетических методов в определении устойчивости к наиболее эффективным противотуберкулезным средствам - изониазиду и рифампицину, а также в идентификации штаммов возбудителя туберкулеза, которые играли большую роль в распространении культур с высоким уровнем лекарственной устойчивости.

Ключевые слова: лекарственная устойчивость, M.tuberculosis, полимеразно-цепная реакция.

Summary

Antonenko K.O. Place and meaning of polymerase chain reaction for detection of drug-resistance of tuberculosis agent to pharmacological drugs. -- A manuscript.

Thesis for a scientific degree of kandidate of biological sciences in speciality 14.03.05 - pharmacology. - Odessa State Medical University Ministry of Health Care of Ukraine. - Odesa, 2009.

In present work the research of resistance of M.tuberculosis to antituberculosis agents in Odesa region, and capability of polymerase-chain reaction (PCR) methods for detection and following-up of resistant strains was fulfilled. It was established that in 2006 y. among the first- and second-line antituberculosis agents the lowest resistance was for pyrazinamide and pefloxacine, while the highest one - for rifampicin and ofloxacine. Multiplex allele-specific PCR method revealed the highest specifity for mutations in rpoB gene and the highest sensitivity for mutation in katG gene, which are responsible for rifampicin- and isoniazide-resistance. Presence of katG and rpoB mutations has been more frequently observed in ex-detainees and at repeated course. Also presence of these mutations associated with lower effectiveness of tuberculosis treatment. According to the results of 6 loci detection the high level of katG і rpoB genes' mutations has been observed in a number of clusters and groups of M.tuberculosis. The obtained results proved importance of monitoring of the drug-resistance for M.tuberculosis, witnessed possibilities and importance of PCR-method for detection and identification of resistant strains of M.tuberculosis.

Key words: drug-resistance, M.tuberculosis, polymerase-chain reaction.

Размещено на Allbest.ru