Зміни поведінки і деяких констант гомеостазу у щурів на різних стадіях естрального циклу при гонадній недостатності та її корекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Донецький національний медичний університет ім. М. Горького

УДК: 612.821+612.6+612.013]:599.323.4

14.03.03 - нормальна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Зміни поведінки і деяких констант гомеостазу у щурів на різних стадіях естрального циклу при гонадній недостатності та її корекції

Кустов Дмитро Юрійович

Донецьк - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Кравцов Павло Якович, Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, провідний науковий співробітник лабораторії клінічної та прикладної нейрофізіології кафедри фізіології.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Шандра Олексій Антонович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фізіології;

- доктор медичних наук, доцент Родинський Олександр Георгійович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри фізіології.

Захист відбудеться 28.10.2009 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д11.600.01 у Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького за адресою: 83003, Україна, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького національного медичного університету ім. М. Горького за адресою: 83003, Україна, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16.

Автореферат розісланий 25.09.2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради д.мед.н., професор Д.О. Ластков.

Анотація

Кустов Д.Ю. Зміни поведінки і деяких констант гомеостазу у щурів на різних стадіях естрального циклу, при гонадній недостатності та її корекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.03 - нормальна фізіологія. - Донецький національний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, Донецьк, 2009.

Досліджували зміни лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу у білих щурів на різних стадіях естрального циклу, при гонадній недостатності, після гормональних і трансплантаційних варіантів її корекції.

Виявлено, що зміна рівня статевих гормонів у крові на різних стадіях естрального циклу призводила до коливань значень показників, що вивчалися. Оваріальна недостатність супроводжувалась порушенням вироблення статевих стероїдів; зникненням естрального циклу; зниженням загальної кількості циркулюючих у крові лейкоцитів, в основному - за рахунок лімфоцитів, при збільшенні кількості еозинофілів і моноцитів; зниженням добового споживання води при збільшеному споживанні сольового розчину, підвищенні діурезу і екскреції іонів хлору з сечею; зниженням грумінгової активності. Екзогенне введення естрадіолу відновлювало початковий рівень більшості параметрів гомеостазу і поведінки, що вивчалися, проте його ефект був нетривалим. Трансплантаційні варіанти корекції більшою мірою сприяли відновленню фізіологічної норми лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу. При цьому використання для трансплантації алогенної культури оваріальних тканин виявилося ефективнішим, ніж застосування ксеногенної культури.

Ключові слова: естральний цикл, гонадна недостатність, лейкоцитарна формула, водно-сольовий обмін, грумінг.

Аннотация

Кустов Д.Ю. Изменения поведения и некоторых констант гомеостаза у крыс на разных стадиях эстрального цикла, при гонадной недостаточности и её коррекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.03 - нормальная физиология. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького МЗ Украины, Донецк, 2009.

Одной из наиболее важных задач современной физиологии является изучение изменений, возникающих в организме при недостаточном содержании тех или иных гормонов. В последнее время активно изучается роль половых стероидов в регуляции иммунитета, поведения, различных констант гомеостаза. Снижение уровня половых гормонов влечет за собой целый комплекс иммунологических, вегето-сосудистых, обменно-эндокринных и психо-эмоциональных нарушений. Несмотря на то, что накоплен большой экспериментальный и клинический материал, позволяющий оценить влияние гонад на компоненты психонейроиммуноэндокринной системы, остаётся ещё много невыясненных и противоречивых моментов, связанных с направленностью и выраженностью такого влияния.

Восстановление уровня половых гормонов проводилось до недавнего времени преимущественно путём их экзогенного введения, однако с развитием такого нового направления в медицине, как трансплантология, пересадка культур тканей, в том числе и железистых, стала новым перспективным способом коррекции гормональной недостаточности. Поскольку не всегда есть возможность своевременно пересаживать аллогенную культуру ткани, поиск оптимального ксеногенного материала представляется довольно перспективным. С другой стороны, необходимо чётко представлять возможные функциональные различия между этими вариантами пересадки, даже с учётом одинакового процента приживляемости трансплантата. Применение трансплантации культур клеток и тканей в клинике существенно опережает экспериментальные исследования, посвящённые воздействию трансплантата на отдельные органы и системы. С этих позиций нам кажется перспективным определение степени восстановления при трансплантации культуры тканей яичников не только основных функций репродуктивной системы, но также и тех поведенческих, иммунологических и обменно-эндокринных показателей, которые находятся в выраженной зависимости от её состояния.

Исследовали закономерности колебаний лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга у белых крыс на разных стадиях эстрального цикла, а также изменения єтих показателей гомеостаза и поведения при гонадной недостаточности, после гормональных и трансплантационных вариантов её коррекции.

Было показано, что изменения в лейкоцитарной формуле были связаны с увеличением содержания нейтрофилов и лимфоцитов, но снижением содержания эозинофилов и моноцитов на стадии эструс, и, соответственно, снижением количества нейтрофилов и лимфоцитов, но увеличением количества эозинофилов и моноцитов - на стадии диэструс. Груминговая активность крыс также существенно изменялась в течение эстрального цикла, увеличиваясь к эструсу и снижаясь к диэструсу. Водно-солевой баланс в меньшей степени зависел от эстрального цикла. Из всех изученных показателей достоверное увеличение наблюдалось только в потреблении солевого раствора на стадии диэструс, когда концентрация половых гормонов в крови минимальна.

Гонадная недостаточность сопровождалась нарушением уровня половых стероидов и исчезновением эстрального цикла. Исследовано её влияние на показатели лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга. Показано, что после овариэктомии, так же как и во время диэструса, снижалось общее количество циркулирующих в крови лейкоцитов, причём в основном за счёт снижения содержания лимфоцитов, в то время как количество эозинофилов и моноцитов возрастало. При этом резко увеличивался диурез, сопровождавшийся значительными потерями ионов хлора, что включало механизмы активации водного аппетита. Груминговая активность у этих животных резко снижалась уже на ранних этапах формирования овариальной недостаточности и продолжала снижаться со временем.

Исследовано влияние введения эстрадиол-дипропионата и нанесения препарата "Дивигель" на показатели лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга. Показано, что экзогенное введение гормона способствовало восстановлению указанных показателей, однако эффективность такого восстановления была непродолжительна и носила пикообразный характер. "Дивигель" оказывал физиологически более адекватное и пролонгированное воздействие.

Впервые исследовано влияние алло- и ксенотрансплантации культуры тканей яичников на показатели лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга. Трансплантационные варианты коррекции в большей степени способствовали восстановлению физиологической нормы лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга, чем гормональные.

Аллотрансплантация культуры овариальных тканей восстанавливала исходный уровень половых гормонов в крови, а в некоторых случаях - и цикличность изменений клеточного состава вагинальных мазков, и более полноценно корректировала изучавшиеся показатели гомеостаза и поведения, чем ксенотрансплантация.

Разнонаправленные изменения показателей лейкоцитарной формулы, водно-солевого обмена и груминга при однотипном эндо- и экзогенном влиянии обосновывают целесообразность применения их совокупности в качестве комплексного критерия оценки состояния психонейроиммуноэндокринной системы с последующим уточнением физиологических механизмов взаимодействия ее компонентов.

Ключевые слова: эстральный цикл, гонадная недостаточность, лейкоцитарная формула, водно-солевой обмен, груминг.

Annotation

Kustov D.Yu. Changes of Behaviour and Some Homeostasis Constants in Rats at Different Oestrous Cycle Stages, in Gonadal Deficiency and Its Correction. - A manuscript.

Dissertation for the candidate of medical sciences degree by speciality 14.03.03 - normal physiology. - M. Gorky Donetsk National Medical University Health Ministry of Ukraine, Donetsk, 2009.

Changes in leucocytic formula, water-salt metabolism and grooming in white rats at different oestrous cycle stages, in gonadal deficiency and after its correction by hormonal and transplantation methods were investigated.

It was revealed that changes in sex hormones' blood levels at different oestrous cycle stages led to fluctuations of the parameters studied. Ovarian insufficiency was accompanied by sex steroids synthesis impairment; oestrous cycle cease; total circulating white blood cell count decrease mainly caused by lymphocyte count diminishment while eosinophil and monocyte count being increased; water intake lowering while salt solution intake, diuresis and chlorine anions excretion being increased. Exogenous oestradiol administration recovered the initial level of the most parameters studied, but its effect did not appear to be long-lasting. Transplantation methods were most favourable towards restoration of the physiological norm of leucocytic formula, water-salt metabolism and grooming while use of an allogenic ovarian tissues culture occured to be more effective than xenogenic culture grafting.

Key words: oestrous cycle, gonadal deficiency, leucocytic formula, water-salt metabolism, grooming.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним із найважливіших завдань сучасної фізіології є вивчення змін, що виникають у організмі при недостатньому вмісті тих або інших гормонів. Це пов'язано, перш за все, з тим, що залози внутрішньої секреції мають підвищену чутливість до дії чинників навколишнього середовища і першими ушкоджуються при радіоактивному опроміненні, отруєнні хімічними речовинами, важкими металами, канцерогенній дії тощо (Иваницкая Н.Ф., 1994; Eimani H., 2009). Гормональний дисбаланс може викликати зміни вищої нервової діяльності, спричиняти зрушення різних констант гомеостазу, і, нарешті, призводити до значного погіршення якості життя.

Роль статевих стероїдів у регуляції імунітету, поведінки, різних констант гомеостазу (Peysner K., 1990) останнім часом активно вивчається. Зниження рівня статевих гормонів тягне за собою цілий комплекс імунологічних, вегето-судинних, обмінно-ендокринних і психо-емоційних порушень, з яких дві останні категорії є менш вивченими (Кангельдиева А.А., 1989).

Вплив статевих гормонів на систему імунітету вивчається досить давно. Проте останнім часом дослідження у цьому напрямку зазнали нового поштовху. Це пов'язано з новими знаннями про механізми дії гормонів на різні ланки імунної системи. Якщо до недавнього часу було прийнято вважати, що статеві стероїди є імуносупресорами (Ройт А., 2000), то зараз накопичено дані, що демонструють різноспрямованість їх впливу на імунітет. Так, Татарчук Т.Ф. (2003), кажучи про гендерні відмінності в імунній системі, відзначає, що у жінок виявлено вищий рівень Т-хелперів і низький рівень Т-супресорів, та вираженість імунної відповіді є більшою, ніж у чоловіків. Ідентифіковано різні типи рецепторів до естрогенів і прогестерону в імунокомпетентних клітинах, тканинах й органах імунної системи, залежно від чого може мінятись як вираженість, так і спрямованість імунної відповіді організму (Drackmann R., 2001). При цьому дуже мало зустрічається робіт, присвячених вивченню впливу статевих гормонів власне на зміни вмісту різних типів лейкоцитів (Кучерявых Л.Е., 2000).

Обмінно-ендокринні розлади проявляються у деструкції кістково-суглобово-м'язової системи, надмірній масі тіла, сухості шкіри та слизових оболонок і багато чому іншому. У основі цього лежить, передусім, зміна гормонального профілю, і, як наслідок, водно-електролітного балансу в організмі. Вміст у клітині води і солей суворо підтримується на певному рівні, і незначні коливання концентрації цих елементів призводять до важких порушень життєдіяльності. Однак організм має потужні компенсаторні механізми, що дозволяють відновлювати водно-сольовий баланс навіть в умовах сильних порушень, до яких можна віднести і гонаддефіцитний стан. Вмикання цих механізмів повинне знаходити віддзеркалення у водно-сольовому апетиті. У той же час, робіт, присвячених вивченню цього аспекту водно-сольового балансу як за фізіологічних коливань рівня статевих гормонів у крові, так і за гонадної дисфункції, украй мало (Claybaugh J.R., 2000).

Не менш небезпечними слід вважати психо-емоційні зміни, глибина і тяжкість перебігу яких часто призводять до посилення афективних станів, а також низки соматичних і вегетативних розладів (Кангельдиева А.А., 1989). Вивчення грумінгу у щурів, для яких догляд за шкірою є важливим зоосоціальним і емоційно залежним компонентом поведінки, вважається нам дуже важливим. Враховуючи, що грумінг відносять до поведінки комфорту (Калуев А.В., 1998), ми припустили, що відхилення в його нормальному перебігу повинні спостерігатись вже на ранніх стадіях розвитку гонадної недостатності.

Відновлення рівня статевих гормонів проводилось до недавнього часу переважно шляхом їх екзогенного введення, проте з розвитком такого нового напряму в медицині, як трансплантологія, пересадка культур тканин, у тому числі і залозистих, стала новим перспективним способом корекції гормональної недостатності (Barros F.S., 2008; Yu X., 2008). Оскільки не завжди є можливість своєчасно пересаджувати алогенну культуру тканини, пошук оптимального ксеногенного матеріалу вважається досить перспективним (Aubard Y., 2003). З іншого боку, необхідно чітко уявляти можливі функціональні відмінності між цими варіантами пересадки, навіть із урахуванням однакового відсотка приживлюваності трансплантата. Застосування трансплантації культур клітин і тканин у клініці істотно випереджає експериментальні дослідження, присвячені дії трансплантата на окремі органи і системи. З цих позицій нам здається перспективним визначення міри відновлення при трансплантації культури тканин яєчників не лише основних функцій репродуктивної системи, але також і тих поведінкових, імунологічних і обмінно-ендокринних показників, які залежать від її стану. Таким чином, вивчення показників лейкоцитарної формули крові, водно-сольового обміну та грумінгу є необхідним для оцінки вираженості ендокринних порушень і міри впливу вживаних методів їх корекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи "Вивчення нейроімуноендокринних зв'язків і трансплантаційна корекція патології ендокринної, імунної і нервової систем" за № держреєстрації 0104U010592, яка виконувалась у науково-дослідній лабораторії клінічної і прикладної нейрофізіології кафедри фізіології Донецького національного медичного університету ім. М. Горького. Автор брав безпосередню участь у розробці методик реєстрації грумінгу і водно-сольового обміну, створенні дослідної групи тварин, реєстрації і подальшому аналізі мазків, лейкоцитарної формули крові, водно-сольового обміну і грумінгу.

Тему дисертації та наукового керівника затверджено Вченою радою Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України (протокол №7 від 19.10.2006 р.).

Мета дослідження: з'ясувати закономірності коливань показників гомеостазу і поведінки залежно від стадій естрального циклу, визначити, як вони змінюються при зниженні концентрації статевих гормонів у крові, викликаному видаленням гонад, яка можливість їх відновлення при корекції гонаддефіцитного стану екзогенним введенням естрогенів або трансплантацією культури тканин яєчників.

Для досягнення мети поставлено такі завдання:

1. Вивчити клітинний склад вагінальних мазків і вміст основних статевих гормонів у крові щурів на різних стадіях естрального циклу, після оваріектомії та подальшої гормональної або трансплантаційної корекції гонадної недостатності.

2. Вивчити лейкоцитарний склад крові щурів на різних стадіях естрального циклу, після оваріектомії та подальшої гормональної або трансплантаційної корекції гонадної недостатності.

3. Вивчити показники водно-сольового обміну щурів на різних стадіях естрального циклу, після оваріектомії та подальшої гормональної або трансплантаційної корекції гонадної недостатності.

4. Вивчити показники грумінгу щурів на різних стадіях естрального циклу, після оваріектомії та подальшої гормональної або трансплантаційної корекції гонадної недостатності.

5. Визначити перспективність застосування гормональних і трансплантаційних методів для корекції порушень лейкоцитарного складу крові, водно-сольового обміну і поведінки, спричинених оваріальною недостатністю, і з'ясувати можливість використання вивчених показників поведінки і гомеостазу для оцінки функціонального стану гонад.

Об'єкт дослідження - зміни лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу на різних стадіях естрального циклу, при гонадній недостатності та різних варіантах її корекції.

Предмет дослідження - вагінальні мазки, концентрація статевих гормонів у крові, лейкоцитарна формула крові, водно-сольовий обмін, грумінг на різних стадіях естрального циклу, при гонадній недостатності та різних варіантах її корекції.

Методи дослідження - фізіологічні: поведінкові (спостереження і аналіз грумінгу), біохімічні (визначення вмісту хлоридів у сечі), імунологічні (визначення вмісту статевих гормонів у крові), гістологічні та цитологічні (окраска і мікроскопічне вивчення вагінальних мазків і мазків крові), трансплантаційні (культивування і введення ало- або ксеногенного матеріалу внутрішньом'язово), та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено вивчення впливу на показники лейкоцитарної формули крові, водно-сольового обміну і грумінгу циклічних змін вмісту статевих гормонів, пов'язаних із фазами естрального циклу у статевозрілих самиць білих щурів. Уперше показано, що зміни у лейкоцитарній формулі пов'язані зі збільшенням вмісту нейтрофілів і лімфоцитів на тлі незначного зниження вмісту еозинофілів і моноцитів у фолікулярну фазу циклу і, відповідно, зниженням кількості нейтрофілів і лімфоцитів при збільшенні кількості еозинофілів і моноцитів у лютеїнову фазу. Виявлено підвищення сольового апетиту у щурів на стадії діеструс, коли концентрація статевих гормонів у крові є мінімальною. Вперше з'ясовано, що грумінг більшою мірою, ніж водно-сольовий обмін, є чутливим до циклічних змін вмісту статевих гормонів у крові. Грумінгова активність є вищою на стадії еструс, і знижується на стадії діеструс.

Досліджено вплив моделі гонадної недостатності на показники лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу. Вперше показано, що після оваріектомії, так само, як і під час діеструсу, знижується загальна кількість циркулюючих у крові лейкоцитів, причому в основному за рахунок зниження вмісту лімфоцитів, тоді як кількість еозинофілів і моноцитів зростає. При цьому різко збільшується діурез, що супроводжується значними втратами іонів хлору, і це вмикає механізми активації сольового апетиту. Грумінгова активність у цих тварин є різко зниженою вже на ранніх етапах формування гонадної недостатності і продовжує знижуватись з часом.

Досліджено вплив естрадіол-дипропіонату і препарату "Дивигель" на показники лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу. Вперше показано, що екзогенне введення естрогенів сприяє відновленню вказаних показників, проте його ефект є нетривалим і має пікоподібний характер. "Дивигель" чинив фізіологічно адекватнішу і пролонговану дію.

Уперше вивчено вплив ало- і ксенотрансплантації культури тканин яєчників на показники лейкоцитарної формули, водно-сольового обміну і грумінгу. Показано, що алотрансплантація більшою мірою, ніж ксенотрансплантація, сприяє відновленню вихідних значень досліджуваних показників, і ефект такого відновлення є тривалішим, ніж при застосуванні гормональної корекції.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширюють уявлення про особливості гормональної регуляції лейкоцитарного складу крові як елементу імунної системи, водно-сольового гомеостазу, і такого складного компоненту зоосоціальної поведінки тварин, як грумінг, і свідчать про те, що статеві гормони надають вираженої модулюючої дії на гомеостаз і поведінку. Показано перевагу застосування трансплантаційних варіантів корекції гонадної недостатності над гормональними, що говорить на користь перспективності подальших досліджень у цьому напрямку для впровадження даного методу у клінічну практику лікування нейроімуноендокринних порушень, спричинених ендокринопатією. Обґрунтовується доцільність застосування грумінгового тестування для оцінки функціональної активності яєчників, гонадної недостатності та її корекції.

Рівень впровадження результатів дисертаційного дослідження. Результати дослідження впроваджено у науково-дослідну діяльність відділу кріобіохімії інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (акт впровадження від 02.04.09 р.), у програму експериментальних наукових досліджень НДЛ біофізики і радіобіології інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (ІКБГІ) (акт впровадження від 03.04.09 р.), у навчальну програму кафедри патологічної фізіології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (акт впровадження від 06.04.09 р.), у навчальну програму кафедри фізіології, фізичної та психологічної реабілітації Донецького державного інституту здоров'я, фізичного виховання і спорту (акт впровадження від 09.04.09 р.).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто розроблено методи реєстрації показників водно-сольового обміну і грумінгу, проведено огляд сучасної літератури за темою дисертації, проведено експериментальну роботу. На підставі отриманих результатів було створено базу даних, результати проаналізовано, узагальнено і зроблено висновки. У дисертації не використано ідеї та розробки, які належать співавторам опублікованих наукових праць.

Апробація матеріалів дисертації. Основні результати досліджень доповідались на V науково-практичній конференції (з міжнародною участю) "Актуальные вопросы профилактической медицины, фитотерапии и питания здорового и больного человека" (Донецьк, 2004), І (установчому) з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), ІІІ з'їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004), III конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2005), IV Російській конференції "Нейроиммунопатология" (Москва, 2006), IV з'їзді трансплантологів України (Київ, 2007), науково-практичній конференції "Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм" (Тернопіль, 2008), IV Всеросійському з'їзді трансплантологів пам'яті академіка В.І. Шумакова (Москва, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 21 наукова праця, з яких 4 статті у наукових фахових виданнях, 2 патенти України, 15 тез і статей у збірках наукових праць.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках комп'ютерного тексту, містить вступ, чотири розділи власних досліджень, висновки, список використаних джерел і додаток. Роботу проілюстровано 3 таблицями (на 3 сторінках) і 29 рисунками (на 28 сторінках). Список використаних джерел включає 190 найменувань, із них 98 викладено кирилицею та 92 латиницею. Додаток складає 4 сторінки.

2. Основний зміст

Матеріали і методи досліджень. Досліди проводили на самицях безпорідних білих щурів, масою від 220 до 300 грамів, із стійким 4-5-денним естральним циклом, стадії якого визначали методом вагінальних мазків. Реєстрацію показників лейкограми, водно-сольового обміну і грумінгу, а також концентрації основних статевих гормонів у крові інтактних тварин здійснювали на всіх стадіях естрального циклу.

Формування посткастраційного синдрому спостерігали через 4-5 днів після оваріектомії та підтверджували за допомогою визначення рівня статевих гормонів у крові, а також методом вагінальних мазків.

Чотири дослідні групи складали оваріектомовані самиці, яким через місяць після формування посткастраційного синдрому проводили різні варіанти корекції. Першій дослідній групі одноразово підшкірно вводили естрадіол-дипропіонат у дозі 50 МО, другій - протягом 5 днів наносили на шкіру кореня хвоста гормональний препарат "Дивигель", що містить естрадіол у дозі 1 мг на 1 г препарату (загальна доза 0,1 мг на 1 кг маси тіла тварини), третій групі здійснювали алотрансплантацію культури оваріальних тканин, четвертій групі пересаджували ксеногенну культуру тканин яєчників.

Органоспецифічні культури оваріальних тканин готували на базі Центру клітинної та тканинної трансплантації Донецького національного медичного університету ім. М. Горького.

Лейкоцитарна формула обчислювалась за загальноприйнятою методикою (Базарнова М.А., 1988). В усіх груп щурів здійснювали забір крові для визначення вмісту основних статевих гормонів у сироватці методом ІФА. Для аналізу використовували пул крові. У всіх тварин проводили облік споживання води і сольового розчину (0,9% NaCl), а також виділення сечі й концентрації у ній хлоридів.

Спостереження за реакціями самоочищення проводили у різний час протягом всього світлового дня за методикою Свідерської Г.Є. (1993) у власній модифікації (Кустов Д.Ю., 2006).

Статистична обробка результатів експерименту проводилась в середовищі пакетів статистичного аналізу MedStat (версія 4, серійний номер MS000071) і Microsoft Excel (Лапач С.Н., 2000).

Результати дослідження та їх обговорення. За фізіологічних змін в організмі, пов'язаних із коливаннями концентрації статевих гормонів у крові, у щурів було відмічено збільшення загальної кількості лейкоцитів, і, зокрема, нейтрофільних елементів і лімфоцитів, при зниженні вмісту моноцитів у фолікулярну фазу циклу, коли концентрація естрадіолу досягає свого максимального значення. При зниженні концентрації естрадіолу в крові спостерігалось також і зниження кількості нейтрофілів і лімфоцитів, при деякому підвищенні кількості еозинофілів і моноцитів.

Останні дослідження говорять про неоднозначність і багатоплановість впливу статевих стероїдів на різні ланки імунної системи та залежність спрямованості імунної відповіді від концентрації естрогенів або прогестерону (Горбунова О.Л., 2007).

У наших дослідженнях оваріектомія призводила до істотного зниження кількості лейкоцитів у крові, що особливо чітко видно на прикладі лімфоцитів (табл. 1). У той же час, вміст еозинофілів і моноцитів зростав. Гормональна корекція гонаддефіцитного стану не спричиняла повноцінного відновлення показників лейкограми. Введення естрадіолу відновлювало рівень лейкоцитів у крові за рахунок збільшення кількості нейтрофілів і еозинофілів, проте абсолютно не впливало на рівень лімфоцитів. Застосування "Дивигелю" не призводило до збільшення загальної кількості лейкоцитів у крові, не впливало на вміст лімфоцитів і моноцитів, але знижувало кількість еозинофілів до рівня інтактних тварин, збільшуючи вміст нейтрофілів. Трансплантаційні варіанти корекції гонадної недостатності були ефективнішими у відновленні показників лейкограми. При алотрансплантації культури тканин яєчників показники лейкограми максимально наближались до норми. При ксенотрансплантації загальна кількість лейкоцитів у крові змінювалась несуттєво, але при цьому ще більше знижувався вміст нейтрофілів, у той же час вміст еозинофілів і лімфоцитів відновлювався до норми.

Таблиця 1

Лейкоцитарна формула крові щурів різних експериментальних груп (Г/л)

Примітка. 1 - р?0,05 при порівнянні з оваріектомованими тваринами.

Виявлені нами у ході експерименту зміни досліджуваних показників водно-сольового обміну мали слабко виражену залежність від стадій естрального циклу. За збереження тенденції тих або інших показників набувати пікових значень на стадіях еструсу і діеструсу, та усереднених значень - у проміжні стадії циклу (метеструс1 і метеструс2), відмінності між ними були невірогідними. Виняток становили лише дані споживання рідини на стадіях діеструс-фолікулярна, сольового розчину на стадіях діеструс-фолікулярна і діеструс-метеструс1, що говорить про деяку чутливість цих показників до змін профілю статевих гормонів на різних стадіях естрального циклу.

Оваріальна недостатність істотно впливала на досліджувані показники водно-сольового обміну. Відбувалось різке зниження споживання води на фоні збільшення споживання сольового розчину і загального споживання рідини щурами (табл. 2). Підвищувалось виділення сечі, і практично на порядок підвищувалась концентрація в ній іонів хлору. Хибна операція не робила вираженого впливу на ці показники. Це дозволило нам виключити дію хірургічного втручання, і показати, що виявлені зміни безпосередньо пов'язані з порушенням профілю статевих гормонів у крові і, як наслідок цього, можливим порушенням циклічності секреції та рівня гіпоталамо-гіпофізарних пептидів і гормонів надниркових залоз.

гормональний щур оваріальний гомеостаз

Таблиця 2

Показники водно-сольового обміну щурів різних експериментальних груп

Примітка. 1 - р?0,05 при порівнянні з оваріектомованими тваринами.

Введення естрадіол-дипропіонату спричиняло у оваріектомованих самиць різке збільшення споживання води (навіть вираженіше, ніж у інтактних тварин), знижувало споживання сольового розчину і загальне споживання рідини до рівня норми, не робило впливу на виділення сечі, проте істотно знижувало концентрацію у ній хлоридів. Практично усі досліджені показники водно-сольового обміну в цій групі щурів коректувались екзогенним введенням гормону, але суттєво відрізнялись від норми. Схожий, хоча і фізіологічно м'якший ефект надавав препарат "Дивигель". Він також підвищував споживання води оваріектомованими тваринами, відновлював споживання сольового розчину, дещо знижував споживання рідини щурами, знижував добове виділення сечі та концентрацію у ній іонів хлору. Взагалі, застосовані у цьому дослідженні варіанти гормональної корекції надавали схожого ефекту, корегуючи водно-сольовий обмін, але не доводячи його до початкового рівня, причому застосування препарату "Дивигель" чинило вираженішу дію, що може бути пов'язане як із способом його введення в організм, так і з тривалістю його ефекту. Трансплантаційні варіанти корекції оваріальної недостатності ефективніше відновлювали початковий рівень водно-сольового обміну. Споживання води, сольового розчину, рідини і виділення сечі у щурів із алотрансплантатом практично не відрізнялись від норми, тоді як концентрація хлоридів у сечі знижувалась до того ж рівня, що й при екзогенному введенні естрадіолу. У групі самиць зі ксеногенною культурою тканин яєчників спостерігалось різке збільшення споживання води, що істотно перевищувало добову норму. Споживання сольового розчину знижувалось до рівня інтактних тварин. Також було різко збільшене загальне споживання рідини щурами. Виділення сечі було вищим, ніж у групі щурів з алотрансплантатом, і вірогідно не відрізнялось від такого у самиць з видаленими яєчниками. Концентрація іонів хлору знаходилась на тому ж рівні, що й при інших варіантах корекції.

У наших дослідженнях водно-сольового обміну на різних стадіях статевого циклу не виявлено значних коливань показників, що вивчались. У випадку з щурами, така нечутливість може бути пов'язаною зі швидкою зміною фаз циклу. Наші результати опосередковано підтверджують дані, отримані при вивченні споживання води у фолікулярну і лютеальну фази циклу (Claybaugh J.R., 2000). Цей факт може визначатись інерційністю процесів перебудови водно-електролітного гомеостазу у відповідь на повільне наростання і зниження концентрації статевих гормонів у сироватці. Можна припустити, що така інерційність залежить від щільності і функціональної активності естрогенових і прогестеронових рецепторів у нирках і наднирникових залозах, які не зазнають істотних змін за фізіологічних коливань концентрації статевих гормонів. Існуюча ж тенденція показників набувати пікових значень у фази максимальної та мінімальної статевої активності, ймовірно, пов'язана з коливанням рівнів лютеїнізуючого і фолікулостимулюючого гормонів протягом естрального циклу (Зурнаджи Ю.Н., 1975), а їх коливання, у свою чергу, - з функціональною активністю нейронних ансамблів, що координують біологічні ритми організму. Це призводить до вмикання механізмів компенсації втрати рідині і солей, що спостерігалось нами у вірогідному збільшенні споживання сольового розчину в стадію діеструс. Зниження концентрації статевих гормонів у крові, спричинене оваріектомією, призводило до дисбалансу в системі водно-сольового обміну. Це полягало у збільшенні діурезу та у втраті іонів хлору, що вмикало механізми активації сольового апетиту. Ймовірно, збільшення концентрації хлоридів у сечі, що спостерігалось нами, може служити непрямим критерієм оцінки порушень обміну натрію і кальцію, викликаних оваріальною недостатністю. Можна припустити, що збільшення кількості рецепторів at-1 у оваріектомованих щурів (Wu Z., 2003) призводить до зниження секреції альдостерону і, відповідно, збільшення екскреції іонів натрію, а, отже, - води і хлоридів з організму. Застосовані нами методи корекції оваріальної недостатності загалом нормалізували показники водно-сольового обміну, що вивчались, хоча їх ефективність була різною. Екзогенне введення естрадіолу на початковому етапі надає вираженого ефекту, відновлюючи рівень гормону і, відповідно, секрецію мозкових пептидів, але з його інактивацією та виведенням ефект зникає, і водно-сольовий обмін повертається до характерного для оваріектомованих щурів. Із застосованих гормональних методів корекції вираженішої фізіологічної дії на вивчені показники чинив препарат "Дивигель".

У доступній літературі нам не вдалось виявити інформацію з вивчення цих показників водно-сольового обміну після трансплантації культури оваріальної тканини. У дії пересадки культури тканин яєчників можна виділити два етапи: до приживлення і встановлення судинних контактів, коли ефект досягається за рахунок гормональної активності культуральної рідини, і після приживлення, коли вмикаються механізми продукції статевих гормонів власне клітинами трансплантата. Хоча в нашому дослідженні ми не можемо однозначно говорити про встановлення синаптичних контактів пересадженої культури з організмом хазяїна, у випадках тривалого й ефективного функціонування трансплантата не можна виключати чинник нейрональної регуляції з боку реципієнта.

У результаті проведених досліджень було виявлено залежність реакцій самоочищення поверхні тіла щурів від стадій естрального циклу. Найчіткішу залежність простежено у реакціях умивання та лизання, сумарній грумінговій активності, часі грумінгу і відсотку часу грумінгу. Чухання, обтрушування й показник інтенсивності грумінгу практично не змінювались у різних фазах статевого циклу. Загалом, мінімальна грумінгова активність припадала на стадію діеструс, а максимальна - на стадію еструс.

Нижче наведено гістограми інтенсивності та відсотка часу грумінгу як узагальнюючих показників, що відображають вплив гонадної недостатності та її корекції на таку поведінку.

Було виявлено вплив оваріектомії на реакції самоочищення поверхні тіла у щурів. Ступінь цього впливу залежить як від різновиду грумінгу, так і від терміну розвитку посткастраційного синдрому. Загалом, грумінгова активність цих самиць є різко зниженою і продовжує знижуватись з часом. Виняток становлять реакції чухання (зниження виявляється лише на 30-й день експерименту) і обтрушування, яке взагалі практично не змінюється у різних експериментальних групах, що говорить на користь припущення про слабку залежність цього показника від вмісту статевих гормонів у крові. Так само, як і у випадку з водно-сольовим обміном, проведення хибної операції дозволило говорити про те, що власне хірургічне втручання істотно не впливало на реакції самоочищення. Застосовані варіанти гормональної корекції виявились ефективними у плані відновлення грумінгової активності, проте залежали від термінів експерименту, і при тестуванні на 30-у добу після проведення відповідної корекції їх ефект був або різко знижений, або взагалі відсутній. Порівнюючи ці два варіанти гормональної корекції, ми дійшли висновку, що "Дивигель" надавав вираженішої дії на кількість реакцій самоочищення, ніж естрадіол-дипропіонат, не відрізняючись від нього у впливі на час грумінгу, а також мав пролонгованішу дію, доказом чого можуть служити вірогідні відмінності між групою щурів після корекції "Дивигелем" і оваріектомованими тваринами на 30-у добу експерименту за такими показниками грумінгу, як умивання, сумарна грумінгова активність і час грумінгу. Трансплантаційні методи корекції оваріальної недостатності ефективніше, ніж екзогенне введення естрадіолу, регулювали грумінгову активність. Значення її показників у цих групах були ближчими до фізіологічної норми, характерної для щурів у еструсі, і проявляли велику стійкість до дії часового чинника. У цілому, можна сказати, що алотрансплантація точніше коректувала грумінгову активність у порівнянні з ксенотрансплантацією, та її ефект був тривалішим.

Відумостей про вплив функціональної активності яєчників на грумінг украй мало (Galeeva A.Y., 2003; Scimonelli T., 1999). Виявлений нами вплив оваріальної недостатності на грумінг можна пов'язати з дією, яку надають статеві гормони на різні мозкові структури (Seale J.V., 2004; Бабичев В.Н., 1998). Рецептори до статевих стероїдів виявлено у багатьох структурах мозку, у тому числі таких, як гіпоталамус, гіпокамп, мигдалик (Kato J., 2004; Von Arnim C.A., 2004; Osterlund M.K., 2001). Гіпокамп, беручи участь у формуванні моторного компоненту складних рухових актів, до яких відноситься і грумінг, має численні двобічні зв'язки як з різними ядрами гіпоталамічної ділянки, так і з мигдалеподібним комплексом, що відповідає за емоційне забарвлення поведінкових реакцій (Гарібян А.А., 1984). Було показано, що кількість нейронів у гіпокампі, щільність синаптичних контактів і просторова пам'ять прямо корелюють у щурів з грумінговою активністю (Bredy T.W., 2003). Оскільки деякі автори відносять грумінг до "поведінки комфорту", його показники можуть бути чутливими до порушення біологічних ритмів, пов'язаного, у цьому випадку, зі зміною гомеостазу статевих гормонів (Калуев А.В., 1998). Наші дані, що свідчать про збільшення інтенсивності поведінкових реакцій самоочищення у тварин в період статевої активності й підготовки до неї, тобто при істотному підвищенні вмісту статевих гормонів у крові, підтверджують наведені вище дослідження і вказують на циклічний характер грумінгу. Прогресуюча гонадна недостатність призводить не лише до порушення циклічності продукції та секреції рилізинг-факторів, але й до загального десинхронозу, що розвивається у первинних осциляторах біологічних ритмів, таких як супрахіазматичні ядра гіпоталамуса (Амофор Ю., 1984). Безумовно, це відображається на функціональній активності нейронів гіпокампу, мигдалику та інших мозкових структур, призводячи до численних і різноманітних змін вегетативних і поведінкових реакцій. Оскільки естрогенна недостатність, що розвинулась внаслідок оваріектомії, суттєво знижувала грумінгову активність, цей факт може підтверджувати ідею про участь естрогенів у формуванні елементарних нейрональних мереж на рівні переднього гіпоталамуса і гіпокампа. У той же час не можна виключити зменшення прямого активуючого впливу статевих гормонів на преоптико-супрахіазматичну ділянку гіпоталамуса (Лапенко Н.Т., 1998). Цілком можливо, що обидва ці механізми є тісно поєднаними між собою. Багато порушень психічних функцій пов'язано, передусім, з низькою концентрацією естрогенів. Такий дефіцит класично компенсують за допомогою замісної гормональної терапії на основі естрадіолу, яка знаходить широке застосування як засіб профілактики серцево-судинних порушень, остеопорозу і "приливів" (Юренева С.В., 2001; Кира Е.Ф., 1999). Нещодавно було показано, що така терапія не лише запобігає порушенню когнітивних функцій, але й покращує їх; знижує ризик розвитку хвороби Альцгеймера, підвищує реактивність серотонінергічної системи і покращує низку функцій, пов'язаних із норадренергічною системою, пригнічує активність моноаміноксидази і покращує загальне самопочуття (Birge S.J., 1997).

Наші дослідження не суперечать більшості літературних даних, показуючи виражений вплив екзогенного введення естрогенів на вищу нервову діяльність, зокрема, на грумінг. Так, Diaz-Veliz G. зі співавт. (1991) спостерігали зниження грумінгової активності у оваріектомованих щурів і подальше відновлення рівня грумінгу після ін'єкції естрадіолу.

Естрадіол посилює грумінгову активність щурів. Зниження його концентрації у плазмі відповідно гальмувало поведінкову активність, але після застосування "Дивигелю" ефект зберігався довше, ніж після ін'єкції естрадіол-дипропіонату в еквівалентній дозі.

Таким чином, ми з'ясували, що показники лейкоцитарної формули крові, водно-сольового обміну і грумінгу виявились чутливими до коливань рівня основних статевих гормонів у крові. Аналізуючи вплив, який чинять ці коливання на вивчені компоненти психонейроімуноендокринної системи під час нормального естрального циклу, після розвитку гонаддефіцитного стану, при гормональних і трансплантаційних варіантах корекції оваріальної недостатності, ми відзначили, що всі ланки системи є тісно взаємозв'язаними на рівні як центральних, так і периферичних механізмів регуляції. Реакція з боку імунної системи опосередковано через цитокіни впливає на електролітний баланс і нервові центри, що відповідають за водно-сольовий обмін і питну мотивацію, що, у свою чергу, через ренін-ангіотензинову систему (Серова О.Н., 2006) відображається на грумінговій активності.

Порівняння впливу різних методів корекції гонадної недостатності на гомеостаз і поведінку показало істотну перевагу трансплантації у порівнянні з екзогенним введенням естрадіолу. Фізіологічна норма лейкоцитарної формули крові, грумінгу і водно-сольового обміну, порушена внаслідок оваріектомії, коректується як ало-, так і ксенотрансплантацією культури фетальних тканин яєчників, причому після алотрансплантації значення вивчених показників гомеостазу і поведінки були ближчими до фізіологічної норми. Чутливість цих показників до коливань концентрації статевих стероїдів дозволяє запропонувати їх у якості комплексного критерію оцінки стану психонейроімуноендокринної системи при ендокринних порушеннях. Окремо слід зазначити доцільність подальшого вивчення грумінгу як інтеграційного показника, що може відображати не лише безпосередньо зміни ендокринної функції гонад, але й опосередкований їх вплив на водно-електролітний баланс та імунну систему.

Висновки

У дисертаційній роботі надано теоретичне обґрунтування і нове вирішення наукового завдання з проведення комплексного дослідження змін поведінки і деяких констант гомеостазу у щурів на різних стадіях естрального циклу, при оваріальній недостатності і різних варіантах її корекції. Дослідження показало, що зниження рівня статевих гормонів у крові призводить до дизрегуляції лейкоцитарного складу крові, водно-сольового балансу і поведінкових реакцій організму. Відновлення рівня естрадіолу шляхом екзогенного введення гормону сприяло частковій корекції показників, що вивчались, проте застосування трансплантації культури оваріальної тканини більшою мірою відновлювало початкові рівні грумінгової активності, водно-електролітного балансу і лейкоцитарної формули.

При вивченні концентрації статевих гормонів у крові найближчі до фізіологічної норми значення було набуто у оваріектомованих щурів після корекції препаратом "Дивигель" (естрадіол - 4,9 нмоль/л, прогестерон - 1,8 нмоль/л, тестостерон - 8,7 нмоль/л), а максимально виражений ефект було отримано при алогенній пересадці культури тканин яєчників (естрадіол - 8,7 нмоль/л, прогестерон - 3,9 нмоль/л, тестостерон - 8,5 нмоль/л), тоді як ксенотрансплантація практично не впливала на цей показник (естрадіол - 0,4 нмоль/л, прогестерон - 1,6 нмоль/л, тестостерон - 1,7 нмоль/л).

Зміни секреції статевих гормонів, пов'язані з естральним циклом, істотно впливало на лейкоцитарну формулу, збільшуючи у стадії еструс загальну кількість циркулюючих у крові лейкоцитів (14,00 Г/л±0,42 Г/л) за рахунок збільшення вмісту нейтрофілів (2,99 Г/л±0,23 Г/л) і лімфоцитів (10,27 Г/л±0,38 Г/л), тоді як вміст моноцитів знижувався (0,09 Г/л±0,03 Г/л). Падіння концентрації статевих гормонів у крові, спричинене видаленням яєчників, призводило до різкого зменшення загальної кількості циркулюючих лейкоцитів (8,06 Г/л±0,52 Г/л), в основному за рахунок зниження вмісту лімфоцитів (4,83 Г/л±0,32 Г/л), тоді як кількість еозинофілів і моноцитів збільшувалась - (0,45±0,05) Г/л і (0,17±0,04) Г/л відповідно.

При порівнянні гормональних і трансплантаційних варіантів корекції гонадної недостатності було виявлено, що введення естрадіолу, збільшуючи загальну кількість циркулюючих у крові лейкоцитів (11,21 Г/л±0,35 Г/л), мало сприяло нормалізації співвідношення окремих їх форм, тоді як трансплантаційні варіанти корекції надавали м'якшого ефекту, причому максимально наближеною до фізіологічної норми була лейкоцитарна формула крові при алотрансплантації культури оваріальних тканин: (загальна кількість лейкоцитів склала (12,37±0,48) Г/л, з них паличкоядерних нейтрофілів - (0,12±0,03) Г/л, сегментоядерних нейтрофілів - (3,35±0,42) Г/л, еозинофілів - (0,40±0,09) Г/л, лімфоцитів - (8,11±0,43) Г/л і моноцитів - 0,12 Г/л±0,03 Г/л).

Показники водно-сольового обміну не зазнавали значних змін за нормального перебігу естрального циклу, проте істотно змінювались після оваріектомії: відбувалось зниження споживання води (4,37±0,62) мл/сут на фоні збільшення споживання сольового розчину (16,29±1,03) мл/сут, а також збільшення виділення сечі (9,01±1,08) мл/сут і концентрації у ній хлоридів (3344,28±390,75) ммоль/л. Загалом, корекція гонадної недостатності препаратом "Дивигель" повертала показники водно-сольового обміну ближче до фізіологічної норми, ніж введення естрадіол-дипропіонату. Трансплантаційні варіанти корекції оваріальної недостатності виявились ефективнішими у відновленні фізіологічного рівня водно-сольового обміну. Найкращого ефекту було досягнуто при алотрансплантації культури оваріальних тканин.

Показники реакцій самоочищення поверхні тіла (умивання, лизання, сумарна грумінгова активність і час грумінгу) виявили чітку залежність від стадій естрального циклу, причому мінімальна грумінгова активність спостерігалась на стадії діеструс (t% - 9,54±1,07), а максимальна - на стадії еструс (t% - 20,37±1,07). Внаслідок оваріектомії грумінгова активність знижувалась (t% - 6,03±0,48). Введення естрадіолу дещо її збільшувало (t% - 6,50±0,47). "Дивигель" надавав вираженішої та тривалішої дії на грумінг (t% - 9,50±0,69), проте найефективнішими виявились ало- і ксенотрансплантація культури оваріальної тканини (t% - 18,48±1,42 і t% - 10,29±0,66 відповідно).

Алотрансплантація культури тканин яєчників є перспективним методом корекції порушень поведінки і констант гомеостазу, спричинених гонадною недостатністю. Виявлені нами різноспрямовані зміни вивчених показників при однотипному ендо- та екзогенному впливі обґрунтовують доцільність застосування їх сукупності як комплексного критерію оцінки стану нейроімуноендокринної системи з подальшим уточненням фізіологічних механізмів взаємодії її компонентів.

Список публікацій за темою дисертації

Сопряжённость изменений клеточного состава вагинальных мазков и концентрации половых гормонов в крови крыс при различных вариантах коррекции овариальной недостаточности / Д.Ю. Кустов, А.А. Слюсарев, Е.А. Ракша-Слюсарева, С.В. Зяблицев, В.А. Коноплянко, Ю.Г. Друпп // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2005. - Т. 14, №1. - С. 28-32. Автором виконано експериментальні дослідження вагінальних мазків, проведено статистичну обробку даних з концентрації статевих гормонів у крові при різних варіантах корекції оваріальної недостатності.

Изменения некоторых показателей водно-солевого обмена белых крыс при овариальной недостаточности и после применения гормональной терапии / Д.Ю. Кустов, А.А. Слюсарев, Ю.Г. Друпп, Е.А. Ракша-Слюсарева // Питання експериментальної та клінічної медицини. - Донецьк, 2005. - Вип. 9, Т. 2. - С. 242-247. Автором виконано експериментальні дослідження водно-сольового обміну у щурів після оваріектомії і екзогенного введення гормонів.