Роль гастрину в регуляції виділення біологічно активних речовин у слизовій оболонці товстої кишки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Роль гастрину в регуляції виділення біологічно активних речовин у слизовій оболонці товстої кишки

Скляров Павло Олександрович

Вінниця - 2011

Дисертацією є рукопис.

Мета роботи: встановити роль гастрину в регуляції систем нітрогену оксид/NO-синтази та ПГЕ2/ЦОГ-2, процесів ліпопероксидації, активності ензимів антиоксидантного захисту в слизовій оболонці товстої кишки.

Задачі дослідження:

· Вивчити зміни вмісту гастрину в плазмі крові за умов блокування протонної помпи лансопразолом, ССК-2 рецепторів та активності ЦОГ-2;

· Дослідити морфологічні зміни епітеліоцитів СОТК за умов гіпергастринемії та при блокуванні ССК-2 рецепторів, активності ЦОГ-2, іNOS та введенні L-аргініну на тлі гіпергастринемії;

· Вивчити зміни активності NO-синтаз, вмісту нітрит-аніону та ПГЕ2 у СОТК та L-аргініну в плазмі крові за умов гіпергастринемії та блокуванні індуцибельної NO-синтази, активності ЦОГ-2, ССК-2 рецепторів та введенні L-аргініну на тлі гіпергастринемії;

· Вивчити процеси ліпопероксидації та активність ензимів системи антиоксидантного захисту за умов гіпергастринемії та при блокуванні ССК-2 рецепторів, активності ЦОГ-2, iNOS та введенні L-аргініну на тлі гіпергастринемії.

Об'єкт досліджень - механізми регуляції синтезу, виділення та дії біологічно активних речовин у слизовій оболонці товстої кишки та за умов впливу гастрину.

Предмет досліджень - роль гастрину у регуляції виділення нітрогену оксиду та простагландинів Е2 у слизовій оболонці товстої кишки за умов окремого та поєднаного блокування ЦОГ-2 та іNOS та введенні L-аргініну.

Методи досліджень - фізіологічні - моделювання стану гіпергастринемії, блокування ССК-2 рецепторів, циклооксигенази-2; біохімічні - визначення вмісту нітрогену оксиду, ПГЕ2, L-аргініну, рівня активності загальної NO-синтази, cNOS, іNOS, вмісту продуктів тіобарбітурової кислоти (ТБК), активності супероксиддисмутази (СОД), каталази; морфологічні - гістологічні та електронно-мікроскопічні; статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведених комплексних досліджень отримані нові дані щодо ролі гастрину в регуляції систем нітрогену оксид /NO-синтази та ПГЕ2/циклооксигенази у СОТК в експерименті. Показано, що блокування Н⁺,К⁺-АТФази лансопразолом призводить до різкого зростання концентрації гастрину в крові, що супроводжувалось структурними змінами та активацією процесів проліферації у СОТК. Гіпергастринемія на ранніх етапах призводить до зростання вмісту нітрогену оксиду, за рахунок підвищення активності cNOS, зменшення вмісту продуктів ТБК та зростання активності ензимів антиоксидантного захисту - СОД та каталази в СОТК, концентрація L-аргініну в плазмі крові мала напрям до зменшення.

Відзначена роль ССК-2 рецепторів у механізмі дії гастрину на СОТК, що пов'язано із зменшенням концентрації гастрина в крові, збереженням слизового бар'єру, відновленням структури епітеліоцитів, зниженням проліферативних процесів. Показано, що блокування ССК-2 рецепторів на фоні гіпергастринемії викликало зниження вмісту нітрогену оксиду та активність cNOS, активність iNOS при цьому суттєво не змінювалась, процеси ліпопероксидації зростали, активність СОД та каталази зменшувалась.

Вперше відзначена роль систем нітрогену оксид/NO-синтази та ПГЕ2/циклооксигенази у СОТК за умов одночасного блокування ССК-2 рецепторів та циклооксигенази-2.

Вперше вивчена роль NO-синтазної системи та показані зміни процесів ліпопероксидації у СОТК за умов введення L-аргініну та блокування іNOS за умов гіпергастринемії.

Практичне значення отриманих результатів. Вивчення ролі гастрину в регуляції виділення біологічно активних речовин у товстій кишці має як теоретичне, так і практичне значення. Результати досліджень впроваджені у навчальний процес кафедр нормальної фізіології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри фізіології людини та тварин Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Донецького національного медичного університету ім. М.Горького.

За результатами досліджень отриманий патент на спосіб гальмування проліферації епітеліоцитів товстої кишки за умов гіпергастринемії у експериментальних тварин (Патент на корисну модель N 46591).

Визначення рівня гастрину у крові при застосуванні блокаторів Н⁺, К⁺-АТФази може бути використано для ранньої діагностики поліпів та новоутворень товстої кишки.

Блокування ССК-2 рецепторів може бути одним з перспективних напрямків при лікуванні гіпергастринемій у гастроентерології.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень на базі кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, проведено статистичне опрацювання одержаних результатів, самостійно підібрана та проаналізована наукова література за темою дисертації, підготовлені наукові праці до друку, оформлено дисертаційну роботу. Разом з к.б.н., ст.наук. співробітником ЦНДЛ Ковалишиним В.І. проведені морфологічні дослідження. Планування напрямків досліджень, обговорення їх результатів, формулювання висновків здійснено за участі наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на міжнародній конференції, приуроченій до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені І.Франка (Львів, 2006); ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); науково-практичній конференції “Біологічне окиснення в нормі та патології” (Тернопіль, 2006); міжнародній конференції “Нейро-гуморальні та клітинні механізми регуляції процесів травлення” (Львів, 2007); міжнародній конференції RECOOP HST CONSORTIUM. Regional Cooperation for Health, Science and Technology (2007); Львівсько-Люблінських конференціях з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін, 2006; Львів, 2008); 15-му Європейському Гастроентерологічному тижні (Париж, 2007); між -кафедральній конференції Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (2010).

Публікації. За матеріалами роботи опубліковано 13 друкованих праць, з них 6 статей (4 - у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 - у закордонних виданнях), 6 тез - у збірниках матеріалів вітчизняних і міжнародних наукових конференцій та з'їздів, один патент України.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 134 сторінках машинописного тексту (з них залікового принтерного тексту 107 сторінок) і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, трьох розділів з викладом отриманих даних, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел, що містить 271 найменувань (з них 15 кирилецею, 156 - латинецею), додатку, ілюстровані 11 мікрофотографіями та 23 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріал та методи досліджень. Дослідження проведені на 186 білих щурах масою 180-230 г. Умови досліджень відповідали міжнародним етичним нормам роботи з лабораторними тваринами. Згідно завдань досліджень були проведені наступні серії дослідів: 1. Дослідження впливу блокатора Н⁺,К⁺-АТФази лансопразола, блокатора ССК-2 гастринових рецепторів проглуміду та селективного блокатора ЦОГ-2 целекоксиба, введених протягом двох тижнів, на рівень гастрину у крові (n=24); 2. Дослідження морфологічних змін у слизовій оболонці товстої кишки за умов гіпергастринемії, блокування ССК-2 рецепторів, ЦОГ-2, iNOS та введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії у СОТК (n=42); 3. Дослідження змін процесів ліпопероксидації та активності ензимів антиоксидантного захисту (СОД, каталаза) за умов гіпергастринемії, блокування ССК-2 рецепторів, ЦОГ-2, iNOS та введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії у СОТК (n=40); 4. Визначення вмісту нітрогену оксиду, ПГЕ₂ у СОТК та L-аргініну в плазмі крові за умов гіпергастринемії, блокуванні ССК-2 рецепторів та активності ЦОГ-2 та тлі гіпергастринемії (n=40); 5. Визначення активності NO-синтаз (загальної NOS, iNOS, cNOS) у СОТК за умов гіпергастринемії, блокуванні ССК-2 рецепторів, активності ЦОГ-2, iNOS та введенні L-аргініну на фоні гіпергастринемії (n=40). гастрин лансопразол ензим

Гіпергастринемію моделювали шляхом двотижневого внутрішньошлункового введення блокатора Н⁺, К⁺-АТФази - лансопразола (Україна) у дозі 30 мг/кг (Omura N.,et all.,1997; Tsuji S., Sun W.H., 2002). Оцінку ролі ендогенних простагландинів у СОТК проводили на фоні гіпергастринемії шляхом блокування циклооксигенази - 2 целекоксибом (доза 10 мг/кг), який вводили протягом 14 днів (Hirata T., 1997; Pinheiro R.M., Calixto J.B., 2002); для визначення характеру впливу ендогенного гастрину на епітеліоцити товстої кишки застосовували блокатор ССК-2 рецепторів проглумід (Proglumide, “Sigma”) у дозі 250 мг/кг протягом 14 днів (Moutaery AL. A., 2005). Для оцінки ролі NO-синтазної системи на фоні гіпергастринемії вводили прекурсор для NO-синтаз L-аргінін (300 мг/кг) (Mane J., 2001) або блокатор iNOS аміногуанідин (20 мг/кг) “Sigma” (Singh V.,2003; Aoi Y., 2008).

За умов поєднаної дії лансопразола з - проглумідом, целекоксибом, L-аргініном, аміногуанідіном, проглумідом та целекоксибом, речовини вводились перорально у вище вказаних дозах.

Дослідження проведені під уретановим знечуленням (1,1 мг/кг, Urethane “Sigma”). У тварин проводили розріз передньої стінки живота, діставали товсту кишку, промивали її фізіологічним розчином (t 37єC, рН 7,4), потім просушували фільтрувальним папером. Механічним шляхом відділяли слизову оболонку від ілео-цекального кута до початку прямої кишки.

У гомогенаті СОТК визначали: вміст продуктів тіобарбітурової кислоти (ТБК) за методом Тимирбулатова Р.А., Селезнева Е.И. (1981); активність ензимів антиоксидантного захисту - СОД за методом Чевари С. (1991) та каталази - за методом Королюк М.А. (1988). Стан системи NO-синтази / нітрогену оксид в СОТК оцінювали по визначенню вмісту стабільного метаболіту NO^-₂ за методом Green L.C. (1982), активності ензимів NO-синтазної системи за методом Сумбаева В.В., Ясинскої І.М. (2000), концентрації L-аргініну в сироватці крові за методом Алейникова Т.Л. (2000). Концентрацію гастрину в плазмі крові визначали радіоімунним методом за допомогою набору фірми МР Biomedicals, LLC (USA), вміст ендогенних простагландинів (ПГЕ2) у гомогенаті СОТК проводили імуноферментним методом із застосуванням реактивів фірми R&D Systems (USA).

Морфологічні дослідження включали проведення гістологічного та електронно-мікроскопічного аналізу. При гістологічному дослідженні препарати СОТК забарвлювали гематоксилін-еозином. Мікрофотографії отримано за допомогою цифрової фотокамери Olympus C-5050 Zoom (Olympus Europe GmbH, Японія) та мікроскопа Olympus BX-41 (Olympus Europe GmbH, Японія) при збільшеннях х 150-320.

При електронно-мікроскопічних дослідженнях, після декапітації тварин, ділянку товстої кишки поміщали у 2 %-ий розчин чотириокису осмію на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,36). Вивчення і фотографування зрізів проводили за допомогою мікроскопу УЕМВ-100К. Для гістологічних та електронно-мікроскопічних досліджень брали ділянку посередині товстої кишки. При морфометричному аналізі обчислення показників (площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів, глибина кишкових крипт, ширина слизової оболонки) проводили за допомогою програми UTHSCSA ImageTool.

Статистичні розрахунки та побудову діаграм проводили за допомогою ЕОМ типу AMD Athlon з використанням програми Microsoft Excel, Statistica. Показники розглядали як статистично достовірні при значеннях t, яке відповідало 95% вірогідності або р<0,05. Дані у рисунках та таблицях подані як середнє та його стандартна похибка (M±m).

Результати досліджень та їх обговорення

Структурні зміни у слизовій оболонці товстої кишки за умов гіпергастринемії. Блокування Н⁺,К⁺-АТФази лансопразолом протягом двох тижнів призводило до різкого зростання концентрації гастрину в крові з 103 ± 7,4 пг/мл ( у контрольних тварин) до 430 ± 11,2 пг/мл. При гістологічній оцінці структурної організації СОТК при гіпергастринемії відзначено зміни як одношарового циліндричного епітелію, стовпчастих поверхневих епітеліоцитів, так і структури епітеліоцитів крипт, келихоподібних клітин і гемокапілярів. При гіпергастринемії площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів СОТК зросла з 1,76 ± 0,06 до 2,01±0,15 мкм², глибина кишкових крипт підвищилась з 54,4 ± 1,21 до 62,4±4,42 мкм, ширина слизової оболонки - з 122,5±3,03 до 139,5±7,07 мкм, кількість клітин у криптах збільшилась на 32%, що свідчить про активацію проліферативних процесів.

При електронно-мікроскопічних дослідженнях відзначались зміни апікальної поверхні мембрани епітеліоцитів - зменшувалась кількість мікроворсинок на 45% (р<0,05), спостерігались деформація ділянок апікальної мембрани (рис. 1- Б), у порівнянні з контрольними тваринами, що є одним з факторів який призводить до зміни секреції, реабсорбції іонів та транспорту води у СОТК.

На нашу думку, відзначені ультраструктурні зміни пов'язані з участю двох механізмів - з однієї сторони гастрин призводив до посилення синтезу слизу, а з другої - на мембранах келихоподібних клітин може також бути локалізована Н⁺,К⁺-АТФаза, блокування якої лансопразолом призводить до сповільнення екструзії слизу і, у наслідок цього, різко зростає об'єм клітин. Келихоподібні клітини вміщували значну кількість гранул секрету, внаслідок чого клітина з подовженої форми (рис. 2-А) приймала форму кола (рис. 2-Б).

Рис. 1. Ультраструктура апікальної поверхні епітеліоцитів товстої кишки білих щурів за умов норми (А) та гіпергастринемії (Б) (х 23000)

При блокуванні ССК-2 рецепторів проглумідом гістологічними дослідженнями виявлено: зменшення ступеня ушкодження поверхні СОТК, збереження слизового бар'єру, зменшення процесів десквамації клітин. Поверхня епітеліоцитів вкрита шаром слизу. Стовбчасті епітеліоцити були не змінені. Набряку міжклітинного простору не спостерігається. Однак, при цьому звертає на себе увагу звуження дна крипт та зростання кількості келихоподібних клітин у дні крипти.

Блокування ССК-2 гастринових рецепторів проглумідом призводило до відновлення кількості та структури мікроворсинок на апікальній мембрані епітеліоцитів та структури та секреції келихоподібних клітин. Площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів суттєво не змінювалась, у порівнянні з гіпергастринемією - 1,95 ± 0,15 мкм², однак, глибина кишкових крипт та ширина слизової оболонки зменшувались до 35,88±3,39 мкм та 131,6±6,68 мкм, відповідно. Це свідчить про зменшення проліферативної активності клітин. При двотижневому блокуванні ССК-2 рецепторів на фоні гіпергастринемії відзначалось зменшення концентрації гастрину в плазмі крові (на 32%, р<0,05) та проходили зміни структури компонентів СОТК. Отримані результати свідчать, що гастрин реалізує свій ефект за участю ССК-2 рецепторів.

Рис. 2. Ультраструктура келихоподібних клітини слизової оболонки товстої кишки білих щурів за умов норми (А) та гіпергастринемії (Б) (х 1500)

При блокуванні ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії спостерігалось зниження концентрації гастрину в плазмі крові до 210,4±9,7 пг/мл (на 51%, р<0,05) у порівнянні з показниками при дії лансопразолу. При цьому відзначалось звуження просвіту крипт та ділянки дна, у більшій мірі зберігалась цілістність келихоподібних клітин верхньої третини крипти. Слизовий бар'єр був дещо порушеним, що проявлялось у десквамації епітеліальних клітин та слизу. За умов блокування ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії глибина кишкових крипт та площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів суттєво не змінювались (63,9 ± 6,3 мкм та 1,97 ± 0,19 мкм², відповідно) у порівнянні з дією лансопразолу; ширина слизової оболонки дещо зростала до 156,7±12,2 мкм (при дії лансопразолу - 139,5±7,07 мкм). Кількість клітин у криптах зменшувалась на 15 % у порівнянні з гіпергастринемією.

Отримані результати свідчать, що вираженої дії блокатора ЦОГ-2 целекоксибу протягом двох тижнів на морфологічний стан епітеліоцитів товстої кишки на тлі гіпергастринемії не спостерігалось.

За умов поєднаного блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії можна відзначити, що слизовий бар'єр та поверхневі епітеліоцити не повертаються до вихідного стану - наявні мікроерозії, порушення цілісності поверхневих епітеліоцитів, набряк та розширення між криптами; глибина кишкових крипт достовірно не змінювалась, у порівнянні з дією лансопразолу; ширина слизової оболонки незначно зростала до 148,8±9,53 мкм; площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів становила 1,87±0,19 мкм².

За умов двотижневого введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії слизовий бар'єр був не порушений, келихоподібні клітини структуровані та знаходились на різних фазах синтезу та виділення секрету. Набряку СОТК не спостерігалося. Просвіт та дно крипт були дещо звужені. За умов введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії глибина кишкових крипт зменшувалась - 50,3 ± 7,22 мкм, у порівнянні з дією лансопразолу; ширина слизової оболонки та площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів достовірно не змінювались. Отримані дані свідчать, що двотижневе введення L-аргініну на тлі гіпергастринемії проявляло слабу моделюючу дію на проліферативні процеси у СОТК.

За умов блокування iNOS на фоні гіпергастринемії свідчить, що глибина кишкових крипт, ширина слизової оболонки та площа поперечного перерізу ядер епітеліоцитів суттєво не змінювались у порівнянні з дією лансопразолу. Це свідчить про те, що блокування iNOS аміногуанідином не викликало виражених змін структури СОТК за умов гіпергастринемії.

Вміст нітрогену оксиду та активності NO-синтаз за умов гіпергастринемії, блокування ССК-2 рецепторів, ЦОГ-2, іNOS та введенні L-аргініну в слизовій оболонці товстої кишки.

У інтактних тварин вміст нітрит-аніону у СОТК становив 16,5±1,58 мкмоль/л, при цьому рівень активності загальної NO-синтази був 0,698±0,06 нмоль/хв·г, активності сNOS - 0,49±0,07 нмоль/хв·г, iNOS - 0,205±0,08 нмоль/хв·г. Тобто, за фізіологічних умов без функціонального навантаження на товсту кишку у вигляді наявності у ній харчових залишків або активації моторики, основна роль у синтезі нітрогену оксиду належить сNOS. Активність iNOS за вказаних умов є незначною або не визначається (Каnkuri E, 2002; Скляров О.Я., Панасюк Н.Б., 2009; Harisa В., 2010). Концентрація L-аргініну у плазмі крові інтактних тварин коливалась у межах 43,1±2,8 мг/мл.

Гіпергастринемія протягом двох тижнів призводила до зростання вмісту нітрит-аніону в СОТК (на 25%, р0,05), при цьому відзначалось зростання рівня активності загальної NOS (на 28%, р0,05), активності сNOS (на 26%, р0,05) та зменшення концентрації L-аргініну (на 18%) у плазмі крові. Співставляючи зміни активності NO-синтаз та вмісту нітрит-аніону у СОТК за умов гіпергастринемії спостерігаємо односпрямовані зміни, які свідчать про те, що зростання нітрит-аніону обумовлено підвищенням активності сNOS. Підвищення активності сNOS супроводжувалось тенденцією до зменшення концентрації L-аргініну в плазмі крові, що свідчить про тісний зв'язок між активністю NO-синтаз у СОТК та концентрацією L-аргініну плазми крові. Фізіологічний механізм підвищення активності сNOS та зростання вмісту нітрит-аніону може бути обумовлений тим, що сNOS у плазматичній мембрані епітеліоцитів ко-локалізується з катіонним амінокислотним транспортним білком - 1 (САТ-1), який переносить L-аргінін. Зростання вмісту L-аргініну та іонів Са²⁺ у цитоплазмі може спричиняти підвищення рівня активності сNOS (Wu G., Morris S.M., 1998).

Вміст ПГЕ2 у СОТК за умов норми складав 2,27±0,16 пг/мг. Введення лансопразолу призводило до незначного підвищення вмісту ПГЕ2 - 3,49±0,17 пг/мг. Це свідчить про зростання активації циклооксигеназ ендогенним гастрином, що може бути одним з факторів посилення процесів проліферації епітеліоцитів та призводити до зміни процесів транспорту води, електролітів та секреції слизу.

За умов блокування ССК-2 рецепторів проглумідом на фоні гіпергастринемії відзначена тенденція до зниження вмісту нітрит-аніону на 12%. Активність загальної NO-синтази зменшилась на 27% (р0,05), активність сNOS знизилась на 38% (р0,05), активність iNOS у СОТК та концентрація L-аргініну в плазмі крові суттєво не змінювались. Вміст ПГЕ2 у СОТК зменшився до 2,35±0,12 пг/мг, у порівнянні з впливом лансопразолу. Очевидно, що блокування ССК-2 рецепторів зменшувало ефект дії гастрину на процеси синтезу ПГЕ2, що розкриває зв'язок між ССК-2 рецепторами та активністю циклооксигеназ.

Наведені результати свідчать про те, що за умов гіпергастринемії підвищення виділення нітрит-аніону в СОТК проходить за участю ССК-2 рецепторів. Фізіологічний механізм зменшення рівня активності cNOS за умов блокування ССК-2 рецепторів при гіпергастринемії очевидно пов'язаний з тим, що блокуючи ССК-2 рецептори гальмується активність транспортної системи САТ-1, внаслідок чого зменшується транспорт L-аргініну у клітину та знижується активність cNOS.

Блокування активності ЦОГ-2 на тлі гіпергастринемії спричиняло зменшення вмісту нітрит-аніону (на 13%) у СОТК, активність загальної NOS знижувалась на 26%, cNOS зменшувалась на 45% (р0,05), а іNOS мала тенденцію до зростання. Підвищення активності iNOS можливо пов'язано з тим, що при гіпергастринемії відбувається активація 5-ліпооксигенази, продукти діяльності якої - лейкотрієни можуть активувати iNOS, окрім цього не можна не враховувати зміну транспорту води та електролітів при блокуванні Н⁺,К⁺-АТФази та ЦОГ-2 та пряму дію целекоксибу на метаболічні процеси клітин СОТК (Kashfi K., Rigas B., 2005). Вміст ПГЕ2 у СОТК за умов блокування ЦОГ-2 при гіпергастринемії становив 2,33±0,11 пг/мг, що було нижче, ніж при дії лансопразолу.

Рис. 3. Вміст нітрит-аніону (А) та активність загальної NO-синтази (Б) в СОТК за умов: 1-контролю; 2 - гіпергастринемії; 3 - блокування ССК-2 рецепторів на тлі гіпергастринемії; 4 - блокування ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії; 5 - поєднаного блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2; *Р<0,05 порівняно з показниками контрольних тварин; # Р<0,05 порівняно з показниками при гіпергастринемії

За фізіологічних умов у товстій кишці основну роль відіграють простагландини, що синтезуються ЦОГ-1. Значне зростання експресії та активності ЦОГ-2 та синтезу ПГЕ2 відбувається при запаленні та канцерогенезі (Li G., Yang T., Yan J., 2002; Martin A.R., 2006; Fornai S., 2006). Підвищення виділення простагландинів при дії гастрину пов'язано з тим, що він за участю ССК-2 рецепторів може активувати ЦОГ-2 (Yao M., Song D.H., Rana B. et al., 2002).

Поєднане блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 призводило до зниження вмісту нітрит-аніону в СОТК до 16,4±2,19 мкмоль/л, що було менше, ніж при самостійній дії проглуміду або целекоксибу. Активність загальної NO-синтази становила 0,765±0,104 нмоль/хв·г, що суттєво не відрізнялось від показників дії целекоксибу та проглуміду на тлі гіпергастринемії. Тобто, сумаційної дії на активність загальної NO-синтази блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 не відзначалось (рис. 3). Активності cNOS та iNOS за умов одночасного блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 також значно не відрізнялись від їх самостійної дії при гіпергастринемії (рис. 4).

Рис. 4. Активність cNOS (А) та iNOS (Б) в СОТК за умов : 1-контролю; 2- гіпергастринемії; 3 - блокування ССК-2 рецепторів на фоні гіпергастринемії; 4- блокування ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії; 5 - поєднаного блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2

Отже, поєднане блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 за умов розвитку гіпергастринемії суттєво не змінювало вміст нітрит-аніону та активність NO-синтаз, у порівнянні показниками при самостійному блокуванні ССК-2 рецепторів та активності ЦОГ-2 при гіпергастринемії.

Двотижневе введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії не викликало виражених змін вмісту нітрит-аніону та активності NO-синтаз. При цьому активність загальної NO-синтази, активність cNOS та iNOS були на рівні показників при дії лансопразолу (табл. 1). Концентрація L-аргініну у плазмі крові була на 15% вищою, ніж при гіпергастринемії.

Те що активність NO-синтаз та вміст нітрит-аніону у СОТК при введенні L-аргініну на тлі гіпергастринемії виражено не змінювались, у порівнянні з показниками при гіпергастринемії, очевидно обумовлено зростанням рівня L-аргініну у крові та клітинах, який є субстратом для NO-синтаз. Так, попередніми дослідженнями було показано, що підвищення позаклітинної концентрації L-аргініну призводило до посилення продукції нітрогену оксиду індуцибельною та ендотеліальною формами NO-синтаз ендотеліальними клітинами та активованими макрофагами (Wu G., Bazer F.W., 2009). Слід відзначити, що L-аргінін також метаболізує аргіназа з утворенням орнітину та сечовини, які у свою чергу можуть впливати на синтез нітрогену оксиду та ПГЕ2. Отже, двотижневе введення Lаргініну на фоні гіпергастринемії виражено не змінює активність NO-синтаз та вміст нітрит-аніону у СОТК, концентрація L-аргініну у плазмі крові мала динаміку до зростання.

Таблиця 1 Активність NO-синтаз, вміст нітрит-аніону в СОТК та концентрація L- аргініну в плазмі крові за умов введення L-аргініну та блокування iNOS на тлі гіпергастринемії

* -p <0,05 у порівнянні з показниками контрольної групи; #- p <0,05 у порівнянні з показниками при гіпергастринемії; M±m, n=8-10.

Двотижневе блокування активності іnos аміногуанідином на тлі гіпергастринемії не викликало достовірних вмісту нітрит-аніону, відзначена тенденція до зменшення активності сNOS, активність iNOS суттєво не змінювалась у СОТК. Отримані результати свідчать про те, що протягом двох тижнів гіпергастринемії значної активації iNOS не відбувалось і дія на цьому фоні блокатора аміногуанідину не проявлялась. Слід відзначити, що активність іNOS та синтез нітрогену оксиду різко зростають при дії бактеріальних ліпополісахаридів, мітогенних стимулів, прозапальних цитокінів (Pacher, 2007; Tackeuchi, 2007; Aoi, 2008).

Зміни процесів ліпопероксидації та активності ензимів антиоксидантного захисту за умов гіпергастринемії, блокування ССК-2 рецепторів та активності ЦОГ-2 у СОТК. Гіпергастринемія на ранньому етапі (протягом перших двох тижнів) супроводжується зменшенням вмісту ТБК-активних продуктів (на 23%, р<0,05) та зростанням активності ензимів системи антиоксидантного захисту СОД (на 95%, р<0,01) та каталази (на 45%, р<0,05), у порівнянні з контрольними тваринами (табл. 2).

Зменшення активності процесів ліпопероксидації за умов зростання проліферативних процесів може бути пов'язане з декількома факторами. Так, при неопластичних процесах у товстій кишці зниження інтенсивності ПОЛ може бути обумовлено тим, що малігнізовані клітини мають кращу протекцію проти вільних радикалів, ніж нормальні; з іншої сторони це може бути пов'язано з рівнем активності ензимів антиоксидантного захисту клітини (Tanaka K., Kawabata K., Kakumoto M., 1998). Активація ензимів системи антиоксидантного захисту - СОД та каталази може бути проявом компенсаторної реакції при ранніх етапах дисфункції епітеліоцитів товстої кишки.

Блокування ССК-2 рецепторів на фоні гіпергастринемії призводило до зростання вмісту ТБК-активних продуктів (р<0,05) майже до вихідних значень, активність ензимів антиоксидантного захисту мала динаміку до зменшення, у порівняні з показниками при гіпергастринемії.

Таблиця 2 Вміст ТБК-активних продуктів та активність ензимів антиоксидантного захисту за умов блокування ССК-2 рецепторів, iндуцибельної NO-синтази, циклооксигенази-2 та введенні L-аргініну у СОТК

* -p <0,05 у порівнянні з показниками контрольної групи; #- p <0,05 у порівнянні з показниками при гіпергастринемії; M±m, n=8-10.

Блокування ЦОГ-2 целекоксибом на фоні гіпергастринемії призводить до зростання вмісту ТБК-активних продуктів на 26% (р<0,05), у порівнянні з впливом лансопразолу, що незначно відрізнялось від показників контрольних тварин. Отримані результати свідчать про те, що гіпергастринемія викликала підвищення вмісту у СОТК ПГЕ₂, які синтезуються ЦОГ-2 та включаються у реалізацію ефектів гастрину. Блокування ЦОГ-2 на тлі гіпергастринемії призводило до відновлення рівня процесів ліпопероксидації та активності СОД і каталази.

Одночасне блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 за умов гіпергастринемії свідчить про зміни активності процесів ПОЛ, у порівнянні з впливом лансопразолу, однак отримані показники були нижчими, ніж при самостійному блокуванні ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2. Це може свідчити про участь інших процесів, що активуються у СОТК при поєднаній дії целекоксибу та проглуміду. Активність ензимів антиоксидантного захисту при цьому, виявила домінування впливу блокади ЦОГ-2 і, відповідно, ендогенних простагландинів у регуляції активності СОД.

Двотижневе введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії призводило до зростання вмісту ТБК-активних продуктів у СОТК на 28% (р<0,05), активність СОД та каталази мали тенденцію до зменшення (на 27% та 24%, відповідно), у порівнянні з показниками при гіпергастринемії. Показано, що введений L-аргінін проявляє антиоксидантну активність гальмуючи активність iNOS, зв'язуючи супероксидний та гідроксильний радикали і, таким чином, регулює редокс-статус у клітині та грає роль у захисті клітини від оксидативного ураження [Flynn N.E., 2002.

Блокування іNOS на тлі гіпергастринемії призводило до зростання вмісту ТБК-активних продуктів на 15% (р0,05), активність СОД зменшувалась на 38% (р<0,05), а активність каталази - на 24 % у СОТК, порівняно з показниками при гіпергастринемії. Враховуючи те, що при блокуванні іNOS на тлі гіпергастринемії активність NO-синтаз знижувалась незначно, то антиоксидантна дія аміногуанідину може бути пояснена його непрямою дією.

Отже, блокування ССК-2 рецепторів, активності ЦОГ-2, активності іNOS або введення L-аргініну на тлі гіпергастринемії нормалізує перебіг процесів ліпопероксидації та активність ензимів антиоксидантного захисту, що свідчить про участь різних біологічних речовин у реалізації ефекту гастрину на клітини СОТК. Відзначений виражений протективний ефект за умов блокування ССК-2 рецепторів при гіпергастринемії свідчить про домінуючу їх роль у реалізації впливу гастрину, тоді як інгібування активності Н⁺,К⁺-АТФази епітеліоцитів лансопразолом грає модулюючу роль у регуляції активності NO-синтаз та синтезі нітрогену оксиду та ПГЕ2.

Висновки

1. Проведеними дослідженнями в експериментах на щурах виявлені ранні морфологічні зміни структур слизової оболонки товстої кишки, активності ензимів NO-синтазної системи, процесів ліпопероксидації, ензимів антиоксидантного захисту за умов гіпергастринемії та при блокуванні ССК-2 рецепторів, активності індуцибельної NO-синтази, циклооксигенази-2 та введенні L-аргініну.

2. Інгібування активності Н⁺,К⁺-АТФази лансопразолом викликало різке зростання концентрації гастрину в крові (у 3,2 рази), що супроводжувалось структурними змінами поверхневих епітеліоцітів, келихоподібних клітин, порушенням слизового бар'єру та активацією процесів проліферації у СОТК. За умов гіпергастринемії відзначалось зростання вмісту нітрит-аніону (на 25%, р0,05) за рахунок підвищення активності cNOS (на 26%, р0,05), зменшувався вміст ТБК-активних продуктів (на 25%, р0,05) та підвищувалась активність ензимів антиоксидантного захисту - СОД (на 66%) та каталази (на 26%) в СОТК, концентрація L-аргініну у плазмі крові незначно зменшувалась.

3. Блокування ССК-2 рецепторів на тлі гіпергастринемії призводило до зменшення концентрації гастрину в крові (на 32%, р<0,05), збереження слизового бар'єру, відновлення структури поверхневих епітеліоцитів та келихоподібних клітин, зниження проліферативних процесів у порівнянні з показниками при гіпергастринемії. За цих умов зменшувався вміст нітрит-аніону та активність cNOS (на 38%,р0,05), активність iNOS - суттєво не змінювалась, вміст ТБК-активних продуктів зростав (р0,05), активність СОД та каталази зменшувались.

4. Блокування ЦОГ-2 на фоні гіпергастринемії призводило до зменшення концентрації гастрину в плазмі крові (на 51%, р<0,05). Вираженої дії целекоксибу на морфологічний стан епітеліоцитів товстої кишки на тлі гіпергастринемії не спостерігалось. Відзначена динаміка зменшення вмісту нітрит-аніону (на 13%), рівень активності загальної NO-синтази (на 15%) та активності cNOS (на 40%, р0,05), процеси ПОЛ та активність СОД та каталази, активність іNOS дещо зростала, вміст ПГЕ2 зменшувався.

5. Поєднане блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 призводило до зниження вмісту нітрогену оксиду в СОТК, що було менше, ніж при самостійному блокуванні ССК-2 рецепторів або ЦОГ-2. Сумаційної дії на активність загальної NO-синтази при блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2 не відзначалось. Активність ензимів антиоксидантного захисту за умов гіпергастринемії та одночасного блокування ССК-2 рецепторів та ЦОГ-2, виявила домінування впливу блокади ЦОГ-2 і, відповідно, ендогенних простагландинів у регуляції активності СОД.

6. За умов двотижневого введення L-аргініну на фоні гіпергастринемії зменшувались структурні зміни поверхневих епітеліоцітів, келихоподібних клітин, порушення слизового бар'єру та активація процесів проліферації у СОТК, при цьому виражено не змінювалась активність NO-синтаз та концентрація нітрит-аніону у СОТК, процеси ліпопероксидації зростали, активність СОД знижувалась у порівнянні з показниками при гіпергастринемії.

7. Двотижневе блокування iNOS на тлі гіпергастринемії запобігало морфологічним змінам слизового бар'єру, епітеліоцитів та крипт, призводило до тенденції зменшення активності загальної NOS, активності сNOS, вмісту нітрит-аніону, активність iNOS виражено не змінювалась, процеси ліпопероксидації незначно зростали, активність СОД знижувалась у порівнянні з показниками при гіпергастринемії.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Кімакович В.Й. Морфологічні зміни слизової оболонки товстої кишки при блокуванні Н⁺,К⁺-АТФази лансопразолом та ССК-2 гастринових рецепторів / В.Й.Кімакович, П.О.Скляров, В.І. Ковалишин // Фізіол. журн. - 2009. - Т. 55. - N 5. - С. 42- 48. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі морфологічних змін та обговоренні одержаних даних).

2. Кімакович В.Й. Зміни вмісту нітрогену оксиду, активності NO-синтаз та процесів ліпопероксидації за умов блокування ССК-1/2 рецепторів та ЦОГ-2 у слизовій оболонці товстої кишки щурів при гіпергастринемії / В.Й.Кімакович, П.О. Скляров // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. - 2009. - № 4. - С.12-17. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

3. Kimakovich V.J. Early changes in the lipoperoxidation processes and structure components of the mucous membrane of large intestine in rats under the blockage of COX-2/ V.J.Kimakovich, P.O. Sklyarov // Annales universitatis Mariae Curie-Sklodowska. - 2008. - Vol. 21. - N. 1. - P. 183-185. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

4. Кімакович В.Й. Роль гастрину у процесах канцерогенезу товстої кишки / В.Й.Кімакович, П.О. Скляров // Практична медицина. - 2007. - т. 13. - № 1. - С. 138-146. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

5. Кімакович В.Й. Процеси ліпопероксидації та активність ензимів антиоксидантного захисту у слизових оболонках шлунка та товстої кишки за умов поєднаної дії лансопразола з проглумідом та німесулідом / В.Й.Кімакович, П.О. Скляров // Медична хімія. - 2006. - т. 8. - № 3. - С. 111-114. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

6. Sklyarov P. Changes in lipoperoxidation processes in the mucous membranes of stomach and large intestine under H⁺,K⁺-ATPase blockage with lansoprazole in rats / P.Sklyarov // Annales universitatis Mariae Curie-Sklodowska. - 2006. - Vol. 19. - N. 1. - P. 187-189. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

7. Kimakovich V.J. Role of gastrin CCK2 receptors blockage in the mechanisms of gastrin action in large intestine / V.J.Kimakovich, P.O. Sklyarov // III international conference “Neuro - humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes” (October 4 - 6, 2007, Lviv, Ukraine), Lviv, 2007, P. 30-31. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

8. Sklyarov P.O. Ultrastructural changes of the mucous membrane of large intestine under blockage of H⁺, K⁺-ATPase / P.O.Sklyarov, V.I. Kovalyshyn // III international conference “Neuro - humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes” (October 4 - 6, 2007, Lviv, Ukraine), Lviv, 2007, P. 45-46. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

9. Kimakovich V.J. Ultrastructural and matabilic changes of mucous membrane of large intestine under blockage of H⁺,K⁺-ATPase and CCK-2 receptors / V.J.Kimakovich, P.O.Sklyarov // Recoop HST Consortium. Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review. Regional Cooperation for Health, Science and Technology. - October 2007. - Vol 1. - № 1.- Р. -24. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

10. Sklyarov P.A. Early changes of lipoperoxidation processes in the large intestine under blockage of H⁺,K⁺-ATPase, CCK-2 receptors and COX-2 in rats / P.A.Sklyarov, V.J. Kimakovich // 15th United European Gastroenterology Week (27-31 October 2007), Gut. - 2007. - Vol 39.- Suppl. 1. - P. A314. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі та обговоренні одержаних даних).

11. Кімакович В.Й. Особливості процесів ліпопероксидації у слизових оболонках шлунка та товстої кишки за умов тривалого блокування H⁺,K⁺-АТФази та ССК-2 рецепторів / В.Й.Кімакович, П.О.Скляров / Матер. Міжнародної наукової конференції, приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені І.Франка (8-11 листопада 2006 р), Львів, 2006. - С. 66-67.

12. Скляров П.О. Процеси ліпопероксидації у слизових оболонках шлунка у слизових оболонках шлунка та товстої кишки за умов блокуваня H ⁺, K⁺-АТФази у щурів / П.О.Скляров, П.О.Кімакович / Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду, (24-27 жовтня 2006 р., Харків), 2006, т. ІІ, С. 110-111.

13. Патент на корисну модель N 46591 UA, МПК A61K 38/22 Спосіб гальмування проліферації епітеліоцитів товстої кишки за умов гіпергастринемії у експериментальних тварин / Кімакович В.Й. Скляров П.О., Фоменко І.С. (UA); патентовласник Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького. - № u200907742; заявл. 23.07.09; опубл. 25.12.09, Бюл. 24. (Дисертант особисто виконав експериментальні дослідження, брав участь в аналізі морфологічних змін та обговоренні одержаних даних).

Анотація

Скляров П.О. Роль гастрину в регуляції виділення біологічно активних речовин у слизовій оболонці товстої кишки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.03 - нормальна фізіологія. Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова МОЗ України, Вінниця, 2011.

Робота посвячена вивченню ролі гастрину в регуляції систем нітрогену оксид/NO-синтази та простагландин Е2/ЦОГ-2, процесів ліпопероксидації та ензимів антиоксидантного захисту та їх вплив на стан епітеліоцитів товстої кишки. Інгібування активності Н⁺,К⁺-АТФази лансопразолом призводило до різкого зростання концентрації гастрину в крові, що супроводжувалось структурними змінами поверхневих епітеліоцітів, келихоподібних клітин, порушенням слизового бар'єру та активацією процесів проліферації у СОТК. За умов гіпергастринемії відзначалось зростання вмісту нітрогену оксиду, за рахунок підвищення активності cNOS, незначно підвищувався вміст ПГЕ2, зменшувався вмісту продуктів ТБК та зростала активність ензимів антиоксидантного захисту - СОД та каталази в СОТК, концентрація L-аргініну у плазмі крові незначно зменшувалась. Блокування ССК-2 рецепторів при гіпергастринемії призводило до зменшення концентрації гастрину в крові, відновлення структури епітеліоцитів, зменшення проліферативних процесів. За цих умов відзначалось зниження вмісту нітрит-аніону та активності cNOS, вміст ПГЕ2 незначно зменшувався, процеси ПОЛ зростали, активність СОД та каталази зменшувались. Показані особливості зміни стану епітеліоцитів, NO-синтазної системи та процесів ліпопероксидації за умов блокування ЦОГ-2, іNOS та введення L-аргініну. Визначення гастрину у крові та блокування ССК-2 рецепторів при гіпергастринемії можуть використовуватись для діагностики лікування новоутворень товстої кишки.

Ключові слова: гастрин, товста кишка, ССК-2 гастринові рецептори, NO-синтазна система, простагландин Е2/ЦОГ-2.

Аннотация

Скляров П.А. Роль гастрина в регуляции выделения биологически активных веществ в слизистой оболочке толстой кишки. - Рукопись.

Дисертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.03 - нормальная физиология. Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И.Пирогова МЗ Украины, Винница, 2011.

Робота посвящена изучению роли гастрина в регуляции систем нитроген оксид/NO-синтазы и простагландин Е2/циклооксигенза-2, процессов липопероксидации и активности энзимов антиоксидантной защиты и его влиянию на состояние епителиоцитов толстой кишки.

Исследования проведены на беспородных крысах (n=230) согласно международным этическим требованиям по работе с лабораторными животными.

Гипергастринемию моделировали путем двухнедельного внутрижелудочного введения блокатора Н⁺,К⁺-АТФазы - лансопразола (30 мг/кг). Оценку роли эндогенних простагландинов в СОТК на фоне гипергастринемии проводили путем блокивания циклооксигеназы-2 целекоксибом (10 мг/кг); блокирование ССК-2 рецепторов проводили проглумидом (250 мг/кг). Моделирование активности NO-синтаз на фоне гипергастринемии проводили путем введения L-аргинина (300 мг/кг) или селективного блокатора iNOS аминогуанидина (20 мг/кг).

Ингибирование активности Na⁺,К⁺-АТФазы лансопразолом приводило к резкому повышению концентрации гастрина в крови, что сопроводжалось структурными изменениями поверхностных эпителиоцитов, бокаловидных клеток, нарушениями слизистого барьера и активацией процессов пролиферации в СОТК. При гипергастринемии отмечено повышение активности cNOS и, соответственно, содержание нитрогена оксида, содержание ПГЕ2 имело динамику к повышению, снижалось содержание ТБК-активных продуктов и повышалась активность энзимов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) в СОТК, концентрация L-аргинина в плазме крови имела динамику к снижению. Блокирование ССК-2 рецепторов при гипергастринемии приводило к снижению концентрации гастрина в крови, восстановлению структуры эпителиоцитов, снижению пролиферативных процессов. При этих условиях снижалось содержание нитрит-аниона и активность cNOS, содержание ПГЕ2 изменялось незначительно, процеси ПОЛ повышались, а активность СОД та каталазы снижалась по сравнению с показателями при гипергастринемии. Показаны особенности морфологических изменений СОТК, NO-синтазной системы и процессов липопероксидаци при блокировании активности ЦОГ-2, іNOS и введении L-аргинина.